PLoS ONE: WNT5A koder to isoformer med særskilte funktioner i Cancers

Abstrakt

WNT5A, et medlem af WNT familien af ​​udskilte lipid-modificerede glycoproteiner, er en kritisk regulator af et væld af udviklingsprocesser, herunder lemmer dannelse, lunge morfogenese, intestinal forlængelse og brystkirtel udvikling. Altered WNT5A ekspression er blevet forbundet med en række af cancere. Interessant nok i visse typer af kræft, såsom hæmatologiske maligniteter og colorektalt carcinom, WNT5A inaktiveres og udøver en tumor undertrykkende funktion, mens i andre cancere, såsom melanomer og gastrisk karcinom er WNT5A overudtrykt og fremmer tumorprogression. Den mekanisme, hvormed WNT5A opnår disse særskilte aktiviteter i kræft er dårligt forstået. Her giver vi bevis for, at

WNT5A

gen producerer to proteinisoformer, WNT5A lange (WNT5A-L) og WNT5A-kort (WNT5A-S). Amino-terminal sekventering og en WNT5A-L-specifikt antistof viser, at de modne og udskilte isoformer er forskellige, med WNT5A-L bærer yderligere 18 N-terminale aminosyrer. Biokemisk analyse viser, at begge oprensede proteiner er ens med hensyn til deres stabilitet, hydrofobicitet og WNT /β-catenin signaleringsaktivitet. Ikke desto mindre, modulering af disse to

WNT5A

isoformer, enten gennem ektopisk ekspression eller knockdown, viser, at de udøver særskilte aktiviteter i cancercellelinier: mens WNT5A-L inhiberer proliferation af tumorcellelinier, WNT5A-S fremmer deres vækst . Endelig viser vi, at ekspression af disse to WNT5A isoformer ændres i bryst- og livmoderhalsen carcinomer, såvel som i de mest aggressive neuroblastomtumorer. I disse kræftformer, WNT5A-L er ofte nedreguleres, hvorimod WNT5A-S opdages overudtrykkes i en signifikant fraktion af tumorer. Alt i alt, vores undersøgelse dokumenterer, at de forskellige aktiviteter WNT5A i kræft kan tilskrives produktionen af ​​to

WNT5A

isoformer.

Henvisning: Bauer M, Benard J, Gaasterland T, Willert K, Cappellen D (2013)

WNT5A

Koder to isoformer med særskilte funktioner i kræft. PLoS ONE 8 (11): e80526. doi: 10,1371 /journal.pone.0080526

Redaktør: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA

Modtaget: 10. juli 2013; Accepteret: 14 okt 2013; Udgivet: November 18, 2013 |

Copyright: © 2013 Bauer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra foreningen pour la Recherche sur le Cancer (DC), Institut National du Cancer (JB), Société française des Cancers de l’Enfant (JB), den europæiske Connective Tissue Cancer Network (DC og MB) og ved California Institute for regenerativ medicin (CIRM, RB1-01406, KW). MB blev tildelt stipendier fra Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche og fra CIRM (TG2-01154). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

WNT5A

genet koder en af ​​de 19 Wnt ligand familiemedlemmer. Ved binding til FZD (Frizzled) [1], ROR1 /2 (receptortyrosinkinase-lignende orphan-receptorer) [2,3] eller RYK (receptorlignende tyrosinkinase) [4] receptorer og LRP5 /6 (Low density lipoprotein receptor -relaterede protein) coreceptorer [5,6], Wnt-proteiner modulerer kanoniske WNT /β-catenin signalvej, samt en række ikke-kanoniske β-catenin-uafhængige pathways [7,8]. Wnt veje spiller en vigtig rolle under embryogenese og voksent væv homeostase ved at regulere cellevækst, proliferation, overlevelse, vedhæftning og migration. Ændringer i WNT signalering er ofte forbundet med onkogenese [7-9]. Navnlig er afvigende ekspression af visse WNTs, inaktiverende mutationer af APC og Axin tumorsuppressorer og onkogene aktiverende mutationer af β-catenin (CTNNB1) vist sig at bidrage til celletransformation via deregulering af gener, såsom

c-myc

og

CCND1

(cyklin D1). Epigenetisk inaktivering af gener, der koder Wnt-antagonister, såsom den opløselige afledningsindretningen receptorer SFRP (Udskilte Frizzled relateret protein) eller DKK, også fører til deregulering af vejen og er blevet observeret i flere kræftformer [7]. En nylig omfattende undersøgelse af kolorektale cancere viste, at over 94% af cancere bærer mutationer i en eller flere Wnt signalering komponenter [10].

Blandt Wnt signaling komponenter impliceret i onkogenese, WNT5A er særlig interessant: det virker både som oncoprotein og en tumorsuppressor. I melanomer og gastriske og bugspytkirtelcarcinomer,

WNT5A

er gentagne overudtrykte og udøver en pro-onkogen funktion ved at fremme spredning og /eller invasion og metastase [11-16]. I modsætning hertil

Wnt5a

heterozygote mus er disponeret for at udvikle B-celle lymfom gennem tab af Wnt5a funktion, og

WNT5A

gen inaktivering af somatiske sletninger eller hypermethylering er hyppig i menneskelig leukæmi, lymfom og kolorektal cancer [17-20]. Desuden WNT5A inhiberer proliferation af leukæmi, lymfom og colorektal carcinomceller, hvilket viser dets tumor-undertrykkende funktion i disse cancere [17,19,20]. Endelig har vi og andre vist, at

WNT5A

ekspression nedreguleres i humane brystcarcinomer og spiller en tumor suppressor rolle ved at inhibere proliferation og /eller metastase [21-24]. Forskelle i WNT receptor repertoire, og dermed i signalveje udløst af WNT5A [3,12-14,17,21,22,25-27], kunne forklare disse modsatrettede aktiviteter WNT5A i kræft. Her har vi udforsket en alternativ mekanisme, hvormed WNT5A kunne udøve disse særskilte aktiviteter, navnlig gennem udtryk og produktion af forskellige WNT5A isoformer. Konkret fandt vi, at en amino-terminalt trunkeret WNT5A isoform udviser tumorfremmende aktiviteter, mens den fulde længde WNT5A proteinet udviser tumor-undertrykkende aktiviteter.

Resultater

WNT5A

genet koder to proteinisoformer

For at afgøre, om

WNT5A

koder flere proteinisoformer, vi analyserede sekvenser deponeret i databaser og søgt efter mulige alternative udskrifter. Vi fandt

WNT5A

gen producerer mindst tre mulige

WNT5A

udskrifter fra alternativ transskriptionelle start- sites. Et transkript initierer ved exon 1 [19,20,28] og forudsiges at kode for et 380 aminosyre WNT5A protein precursor, herfra henvist til som WNT5A-L (Long) (figur 1A, B; Fig S1A og S1B). De andre to transkripter initiere 718 og 578 nukleotider opstrøms for exon 2, i en alternativ exon 1β (figur 1a; fig S1A og S1B). Både exon 1 P-initierede transkripter forudsiges at kode for et 365 eller 360 aminosyrer (afhængigt af anvendelse af startkodonen i position 16 eller 21 i forhold til start codon af WNT5A-L) precursorproteinet, benævnt WNT5A-S (Short), og mangler de første 15 eller 20 N-terminale aminosyrer i forhold til WNT5A-L precursor ([29] figur 1A, B; fig S1A og S1B).

A. Opbygning af den menneskelige

WNT5A

gen og alternative udskrifter. Nummererede felter angiver exoner, med 5 ‘og 3’ uoversatte (UTR) regioner i grå og kodende områder i sort. nt: nukleotider, kb: kilo base. Blå og røde pile og punkterede linier henholdsvis angiver positionerne for de forskellige transkription initieringssteder i exon 1 og exon 1β og splejsning af exon 1- og exon 1p-initierede transkripter. Blå og røde stjerner angiver translationsinitieringsstederne kodoner for de WNT5A-L og WNT5A-S-isoformer placeret i exon 1 og exon 2. Blå og røde lyn pile viser positionen af ​​målet sekvenser af

WNT5A-L

WNT5A-S

specifikke kort interfererende RNA (siRNA). B. Multiple aminosyresekvensalignment af N-terminalen af ​​de WNT5A precursorproteiner. Den blå M betegner den mest sandsynlige startkodon WNT5A-L mens den røde Ms betegner mest sandsynligt startkodoner af WNT5A-S. De grå pile angiver positionerne af signalpeptid spaltningssteder for begge isoformer som forudsagt af SignalP 4.1 (https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Blå og røde pile viser positionen af ​​de observerede første aminosyrer af det modne WNT5A-L og WNT5A-S-proteiner, henholdsvis og dermed positionen af ​​den observerede signalpeptidspaltningsstedet for hver isoform. C. Påvisning af oprensede WNT5A isoformer. Venstre panel: Immuno-blot for WNT5A viser, at begge isoformer er af tilsvarende molekylvægt (

≈43kDa). Højre panel: Coomassie farvet gel viser, at det rensede WNT5A præparater er rene med stort set målbart forurenende proteiner. D. Et anti-muse Wnt5a antistof detekterer begge isoformer (venstre panel), mens et anti-kanin WNT5A-L-specifikt antistof (højre panel) detekterer WNT5A-L, men ikke WNT5A-S isoform.

E. Triton

X-114 faseadskillelse viser, at både WNT5A isoformer partition til den hydrofobe /organiske fase. WNT5A proteiner blev detekteret ved immuno-blot-analyse med et anti-Wnt5a antistof. F. Inkubation af oprensede WNT5A isoformer ved 37 ° C for de angivne tider viser, at deres

i

vitro

stabilitet er ens. WNT5A proteiner blev detekteret som i E og band intensiteter blev kvantificeret ved hjælp ImageJ software.

Den overordnede exon-intron struktur af den menneskelige

WNT5A

genet er stærkt konserveret i andre hvirveldyr, herunder mus, kylling og zebrafisk (fig S2A).

WNT5A

gen er opdelt i 5 bevarede exons. Længden sekvens og splejsningssteder i kodoner tværs exon 2 – 5 er stærkt konserverede. Den utranslaterede region af exon 1 er mere divergeret, men splejsningsstedet er konserveret. Denne exon-intron arrangement er også bevaret i den nært beslægtede

WNT5B

gen, som kommenteret i mammale genomer. Interessant nok alternativ exon 1β, som er indlejret i den første intron, er også til stede i disse hvirveldyr. Hos mus er exon 1β påvist i alternative Wnt5a transkripter og deler signifikant homologi med den humane sekvens. I en parvise alignment, elementet omfatter den opstrøms regulatoriske region og exon 1 β er 95% konserveret mellem mennesker og mus (figur S2B). Hos fugle (kylling og zebra Finch), er dette alternativ exon ikke er blevet kommenteret, men tilstedeværelsen af ​​et højt konserveret sekvens med en splejsningsdonor ved 3′-enden angiver, at denne exon 1β er til stede. Den parvise alignment mellem kylling og zebra finke af dette element viser 96% bevarelse. Endvidere er to korte sekvenser i disse elementer stærkt konserveret mellem pattedyr (mus og menneske) og fugle (kylling og zebra Finch) (figur 2B). Fisk (zebrafisk og hundestejle) indeholder også en stærkt bevaret element i denne region. Selv om dette punkt ikke er kommenteret som et exon i nogen database, det forhøjede bevaring (74%) tyder på tilstedeværelsen af ​​et yderligere exon i fisk (Figur 2B). Sammen den observerede høje grad af genomisk sekvenskonservering tyder på, at alternative Wnt5a transkripter, der ligner dem beskrevet her, er til stede i multiple vertebrate arter. Endelig er opstilling af aminosyre terminale aminosyrer af menneske, mus og kylling Wnt5a viser, at startkodonen M21 (position i forhold til startkodon af WNT5A-L) fuldstændigt bevaret (figur 1B), hvilket antyder, at WNT5A-S initierer ved denne position.

Begge WNT5A proteiner blokerer Wnt3a-aktivering af β-catenin /TCF-drevet transkriptionel aktivitet i HEK 293 (TOP-Luciferase, A.) og MDA-MB-231 (TOP-GFP reporter, B.). Celler blev behandlet med renset Wnt3a og en stigende koncentration af WNT5A i 24 timer (A) eller 48 timer (B). C. Ved transfektion begge til WNT5A isoformer interferere med endogent (MDA-MB-231, venstre felt) og WNT1-induceret (HeLa, højre panel) β-catenin /TCF-drevet transkription i MDA-MB-231 (venstre panel) og HeLa-celler (højre panel). Celler blev transficeret med kontrol, WNT5A-L eller WNT5A-S ekspressionsvektorer alene, eller sammen med en WNT1 ekspressionsvektor og analyseret for β-catenin /TCF-drevet TOP-Luciferase reporter-aktivitet. En ekspressionsvektor der koder for et dominant negativ form af TCF4 (ΔNTCF4) blev anvendt til at interferere med den endogene reporter aktiviteten i MDA-MB-231-celler. D. Begge WNT5A isoformer fremmer DVL phosphorylering. L-celler (venstre felt) og C2C12-celler (højre panel) blev behandlet med WNT5A isoformer (10 nm, 2 timer) og hele cellelysater blev immuno-blottet med de angivne antistoffer. Begge WNT5A isoformer, samt Wnt3a (10 nm, 2 timer), førte til en mobilitetsforskydning af Dvl1 og Dvl2 proteiner, hvilket antyder, at DVL proteiner er posttranslationelt modificeret ved phosphorylering som reaktion på både kanoniske (Wnt3a) og ikke-kanoniske Wnt (WNT5A) signalering. Kun Wnt3a induceret akkumulering af β-catenin-protein. Bemærk: p-catenin akkumulering i afhængighed Wnt3a i C2C12-celler er ikke detekterbar i disse helcellelysater fordi disse celler indeholder store mængder af membran /adherens junction associeret β-catenin

Som det er tilfældet. for de fleste secernerede proteiner, er Wnt forstadier spaltes i aminoterminalen at fjerne signalsekvensen derved frembringer det modne polypeptid. Et signal peptid spaltning forudsigelse algoritme (

SignalP 4.1

– https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) forudsiger, at begge WNT5A forstadier giver proteiner af enten 343 aminosyrer (start med QVVIEA … ) eller 338 aminosyre (start med ANSWWS …). Sidstnævnte forudsagte kløvningssted har den højeste spaltning score (Y-score på 0,625 for WNT5A-S [start på M21] og 0,246 for WNT5A-L). amino-terminal sekventering af muse Wnt5a imidlertid anført, at signalsekvensspaltning forekom ved en position 24 rester nedstrøms fra det forudsagte sted [3]. Da endvidere 15 aminosyrer forskel i den N-terminale sekvens af WNT5A-L og WNT5A-S forstadier kan påvirke positionen af ​​signalpeptidspaltning, vi eksperimentelt bestemt identitet aminoterminalen af ​​de modne proteiner.

For at identificere positionen af ​​signalpeptidspaltning og den første aminosyre af de modne proteiner, vi oprenset begge WNT5A isoformer. Anvendelse af en tidligere udviklet CHO ekspressionssystem [30], vi uafhængigt overudtrykt hver WNT5A isoform og oprenset dem fra konditionerede medier (CM) ifølge offentliggjorte protokoller [3,31]. Begge WNT5A isoformer blev udskilt i CM i lige store niveauer (data ikke vist), og blev oprenset til næsten homogenitet (~ 95% rent, som bedømt ved Coomassie-farvning, Fig 1C). Amino-terminal sekventering viste det oprensede WNT5A-L-protein til at starte én aminosyre nedstrøms for den forudsagte signalpeptid-spaltningssted, hvorved der genereres et 337 aminosyrer langt protein starter med sekvensen NSWWS … (Figur 1B Figur S1B og S1c). Det secernerede WNT5A-S-protein manglede en yderligere aminoterminal 18 aminosyre til frembringelse af et protein af 319 aminosyrer begyndende med sekvensen IIGAQ … (Figur 1B Figur S1B og S1c). Derfor er de to isoformer generere proteiner med forskellige aminoterminale sekvenser. Den WNT5A-S aminoterminus passer til den muse Wnt5a, som tidligere blev identificeret ved amino-terminalt peptid-sekventering [3]. Interessant har signalpeptidspaltningsstedet algoritme ikke forudsige denne position som en sandsynlig sted for signalsekvensspaltning til enten WNT5A-L eller WNT5A-S (Y-score på 0,16 til WNT5A-S og 0,113 for WNT5A-L).

for at bekræfte den særskilte aminoterminale sammensætning af både modne WNT5A isoformer, genereret vi et antistof rettet mod den WNT5A-L-specifikke 18 aminosyre (NSWWSLGMNNPVQMSEVY). Til immun-blots, kun WNT5A-L-specifikt antistof anerkendt WNT5A-L og ikke WNT5A-S (figur 1D). Dette viser, at exon 1- og exon 1β-initieret

WNT5A

udskrifter producere distinkte WNT5A proteiner, der er forskellige i deres amino termini. Den mekanisme, ved hvilken disse to forstadier differentielt behandlet til opnåelse distinkte modne proteiner er endnu uklart, men vi spekulere, at forskelle i aminoterminalen påvirke valget af den maskiner til at spalte proteinerne i forskellige positioner. Der er behov for yderligere undersøgelser for at løse disse spørgsmål.

Wnt proteiner er stærkt hydrofobe, en egenskab bibragt af kovalent binding af mindst ét ​​lipid molekyle til en konserveret rest [31,32]. Denne modifikation er vigtig for korrekt behandling og sekretion [32,33]. Hertil kommer, som afsløret af Wnt-FZD co-krystalstruktur, lipidenheden er kritisk for receptorbinding [34]. For at løse, om de to WNT5A isoformer afveg i deres hydrofobe egenskaber, og dermed i deres lipid modifikationer anvendte vi faseseparation egenskab af detergenten Triton X-114. Vi observerede ingen forskel mellem de to isoformer, som de begge delt ligeligt til den organiske fase (figur 1E), hvilket antyder, at begge isoformer ligeledes modificeres. For at teste, om de to isoformer afveg i deres stabilitet, inkuberede vi hvert protein ved 37 ° C i op til 60 timer. Immuno-blot-påvisning viste, at begge proteiner nedbrudt med lige store rater (Figur 1F). Derfor er de to WNT5A isoformer opfører sig på lignende med hensyn til deres

in vitro

stabilitet og hydrofobicitet. Det er dog muligt, at hver isoform har forskellige biokemiske egenskaber i en

in vivo

indstilling, en mulighed vi har ikke behandlet.

Virkninger af WNT5A-L og WNT5A-S isoformer på signalering pathways

Adskillige Wnt signalveje er blevet beskrevet og foreslået. De mest almindeligt studerede og bedst etablerede pathway, der ofte omtales som den kanoniske WNT pathway, involverer β-catenin som en central mediator. Andre ikke-kanoniske veje, der fungerer uafhængigt af β-catenin, er dårligt forstået. I det mindste, er disse to veje menes at dele følgende komponenter: Wnt ligander, FZD receptorer og Dishevelled (DVL) signal transducere. Selvom WNT5A overvejende er associeret med ikke-kanoniske WNT signalering, har det også vist sig at aktivere kanoniske β-catenin signalering i visse betingelser [3]. Vi undersøgte, om WNT5A isoformer differentielt påvirke β-catenin /TCF signalvej. Til dette formål frembringes vi to cellelinjer, HEK 293- og MDA-MB-231, der bærer en WNT /β-catenin specifikke reporter system. Denne reporter system består af en WNT responsive element består af 7 multimeriserede TCF-bindingssteder (benævnt TOP for TCF Optimal Promoter [35,36]), som regulerer ekspressionen af ​​et reportergen, enten Luciferase for HEK 293-celler (HEK293- TOP-Luciferase, figur 2A, figur S3A) eller GFP for MDA-MB-231-celler (MDA-MB-231-TOP-GFP, figur 2B, figur S3B). Disse reporter-celler kraftigt aktiveres af Wnt3a (figur 2A og B), en WNT protein almindeligvis anvendes til at stimulere den kanoniske signalvejen. I modsætning hertil hverken WNT5A isoform aktiveret eller konstant modulerede den basale aktivitet af disse reportere (Figur S3A og S3B), hvilket indikerer, at disse cellulære systemer ikke tilvejebringe den passende miljø til at forbinde WNT5A signalering til den kanoniske β-catenin pathway.

Følsomme og robuste cellebaserede assays til ikke-kanonisk WNT signalering er knappe. Men ikke-kanonisk WNT signalering har vist, at modvirke WNT /β-catenin signalering, en aktivitet, der kan analyseres ved hjælp af TOP-reporter-system [3]. Vi fandt, at begge WNT5A isoformer inhiberer Wnt3a-induceret reporter aktivering på en dosis-afhængig måde (Figur 2 A og B). Disse resultater viser, at trods forskellen i deres amino-terminale ender begge til WNT5A proteiner kraftigt antagoniserer WNT /β-catenin signalering. Lignende inhibitoriske virkninger af WNT5A-L og WNT5A-S isoformer på WNT /β-catenin-drevet reporter blev observeret, når celler blev transficeret med ekspressionsvektorer (figur 2C) i stedet behandlet med renset WNT5A-L og WNT5A-S-proteiner. Derfor i disse assays, de WNT5A isoformer udviser lignende biologiske aktiviteter, når de leveres som oprensede proteiner eller transficerede gener.

WNT signalering, kanoniske og ikke-kanoniske, fører til hyperphosphorylering af DVL-proteiner, signalmolekyler, der virker umiddelbart nedstrøms for FZD receptorer. Denne post-translationel modifikation af DVL proteiner kan let detekteres ved en elektroforetisk mobilitet shift [37-39]. Vi fandt, at behandling af to cellelinier (mus L-celler og muse myoblast C2C12-cellelinie) med enten WNT5A isoform, samt Wnt3a, inducerer en mobilitetsforskydning af DVL proteiner som detekteret ved immuno-blotting for Dvl1 og Dvl2 (figur 2D). Men efter aftale med de forskellige aktiviteter Wnt3a og WNT5A isoformer på WNT /β-catenin signalering (figur 2A, 2B, figur S3A, S3B), kun Wnt3a, men ikke WNT5A isoformer, induceret akkumulering af β-catenin protein, som fremgår i L-celler. Denne β-catenin proteinakkumulering fremgår ikke i C2C12-celler, som allerede udtrykker høje niveauer af β-catenin (figur 2D). Tilsammen indikerer vore data, at de to WNT5A isoformer udviser identiske biologiske aktiviteter i det etablerede cellebaserede WNT signalering assays.

Angivelse af WNT5A isoformer i cancer cellelinjer og normale væv

Tidligere undersøgelser af WNT5A udtryk har ikke diskrimineret mellem de to isoformer beskrevet her. Derfor har vi målt deres transkriptniveauer i kræft cellelinjer og i normale væv ved at udføre kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) med isoform-specifikke primere (se tabel S1 og figur S1). Denne analyse viste, at ekspression af disse isoformer varierer meget mellem individuelle cancercellelinier. For eksempel, mens MDA-MB-231 (afledt af et brystcarcinom) og SH-SY5Y (afledt af en neuroblastom) udtrykker overvejende

WNT5A-L

, HeLa-celler (afledt fra en cervix carcinoma) udtrykker overvejende

WNT5A-S Hotel (figur 3A). Andre cellelinjer, herunder MCF-7 (afledt af et brystcarcinom) eller IMR-32 (afledt af en neuroblastom) udtrykker ekstremt lave niveauer af enten WNT5A isoform (fig S4A). Selv mindre kvantitativ, gel analyse af endepunkt RT-PCR-produkter fremstillet af repræsentative cellelinier bekræftede QRT-PCR-data (figur S4A). Vi analyserede næste Udskriften niveauer af WNT5A isoformer i normale voksne væv. Vi har detekteret

WNT5A-L

udtryk i næsten alle væv, undtagen fedtvæv. I modsætning hertil vi opdaget

WNT5A-S

udtryk kun placenta, og i mindre grad i luftrøret og tyndtarmen (figur s4b).

A. WNT5A isoform udtryk i tre cancer cellelinjer. Transkriptniveauer af

WNT5A

isoformer blev bestemt i MDA-MB-231 (brystcarcinom), HeLa (cervix carcinoma), og SH-SY5Y (neuroblastom) ved QRT-PCR og normaliseret ved

EF1-α

mRNA (normalisering af

GAPDH

mRNA og

18S

rRNA produceret lignende resultater). Mean nøgletal (

/

EF1-α

WNT5A

isoformer) ± SEM fra uafhængige målinger vises. B. Virkninger af ektopisk udtryk for WNT5A-L og WNT5A-S isoformer på spredning. De angivne cellelinier blev transduceret med ekspressionsvektorer kodende WNT5A-L (blå linie), WNT5A-S (rød linje) eller ingen WNT (sort linie) og celletal blev bestemt ved 3 og 6 dage. WNT5A-S stiger mens WNT5A-L falder proliferative satser. Data (middelværdi ± SEM fra tredobbelte bestemmelser) fra et repræsentativt forsøg er vist. Hvert forsøg blev udført mindst tre uafhængige gange. C. isoformspecifik siRNA’er reducere ekspression af hvert WNT5A isoform. Effektiviteten af ​​WNT5A-L og WNT5A-S isoform knockdown (KD) blev evalueret i MDA-MB-231, HeLa og SH-SY5Y transficeret med kontrol siRNA og

WNT5A

isoformspecifik siRNA (KD).

WNT5A

isoformer transkriptniveauer blev målt ved kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og normaliseret af

EF1-α

mRNA (normalisering af

GAPDH

mRNA og

18S

rRNA produceret lignende resultater). D. Virkninger af siRNA-medieret knockdown (KD) af WNT5A-L og WNT5A-S isoformer på proliferation. Celler blev transficeret med siRNA’er specifikke for WNT5A-L (blå linie) eller WNT5A-S (rød linje) og celletal blev bestemt ved 3 og 6 dage. En scrambled siRNA tjente som kontrol (sort linie). Co-transduktion af celler med en WNT5A-S ekspressionsvektor redder virkningen af ​​WNT5A-S-specifik siRNA (stiplet rød linje). Data (middelværdi ± SEM fra tredobbelte bestemmelser) fra et repræsentativt forsøg er vist. Hvert forsøg blev udført mindst tre uafhængige gange. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,005; ****

P

0,001. E. Differential regulering af

AXIN2

CDK8

udtryk ved isoformspecifik knockdown af WNT5A. Udskrift niveauer af

AXIN2

CDK8

blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR-analyse (normaliseret ved

EF1-α

mRNA) i kontrol MDA-MB-231 (bryst carcinom ), HeLa (cervix carcinoma) og SH-SY5Y (neuroblastom) celler, og som svar på siRNA-medieret knock-down (KD) af WNT5A-L eller WNT5A-S. Mean nøgletal ± SEM fra uafhængige målinger vises.

WNT5A-S fremmer og WNT5A-L undertrykker væksten af ​​kræft cellelinjer

For at studere de funktioner i WNT5A isoformer, vi manipuleret deres ekspression i adskillige cellelinier, herunder MDA-MB-231, HeLa og SH-SY5Y, og analyseret de fænotypiske konsekvenser (figur 3B-D, figur S5). Da signalering aktiviteter af oprensede Wnt proteiner er kortvarig [30] og biologiske assays generelt kræver lange perioder med stimulation, vi udnyttet transfektion af

Wnt

gener snarere end anvendelse af oprensede proteiner. Ektopisk ekspression af WNT5A-L væsentligt reduceret celleantal i disse cellelinier (figur 3B). Der sås ingen tegn på øget celledød (data ikke vist), hvilket indikerer, at WNT5A-L virker til at inhibere celleproliferation. I modsætning hertil ektopisk ekspression af WNT5A-S fremmet proliferation af MDA-MB-231, HeLa og SH-SY5Y-celler (figur 3B)

Brug isoformspecifik siRNA’er (se figur S1, tabel S2)., Vi forstyrret ekspression af hvert WNT5A isoform (figur 3C). De siRNA’er var i stand til specifikt at Knockdown deres mål op til 80% som bestemt ved QRT-PCR (figur 3C). Vigtigere, blev hver WNT5A isoform selektivt inhiberet af det tilsvarende siRNA uden at påvirke niveauet af den anden isoform. I overensstemmelse med spredning effekter af WNT5A-S ektopisk udtryk, knockdown af WNT5A-S reducerede celletal (figur 3D). Selv i celler, der udtrykker lave WNT5A-S-niveauer, såsom MDA-MB-231 (figur 3A), knockdown af WNT5A-S isoform frembragte en kraftig inhiberende virkning (figur 3D). Cellen inhibering er resultatet af WNT5A-S siRNA blev reddet i alle testede cellelinier ved co-transduktion med en WNT5A-S vektor blottet for siRNA målsekvensen (figur 3D, KD WNT5A-S + redning). Disse redning data viser, at virkningerne af dette siRNA skyldes WNT5A-S-knockdown snarere end ikke-specifikke ikke-tilsigtede virkninger. Desuden WNT5A-S knockdown øget celledød i de tre cellelinier (figur S5A) og inducerede caspase aktivitet i MDA-MB-231 og HeLa (figur S5B). Men den ≥3 gange reduktion i celleantal (figur 3D) overskred den observerede beskedne stigning i celledød (figur S5A), hvilket antyder, at WNT5A-S knockdown hovedsagelig nedsat proliferation. I modsætning hertil knockdown af WNT5A-L havde ingen virkning på celleproliferation (figur 3D), celledød eller caspaseaktivitet i de 3 cellelinier (figur 3D, figur S5A, B). Samlet set viser disse eksperimenter viser, at endogent og ektopisk udtrykte WNT5A isoformer udøver forskellige virkninger i bryst, cervix og neuroblastom tumorcellelinjer, med WNT5A-S fremme og WNT5A-L-inhiberende celleproliferation. Da vi ikke observere særskilte signaling aktiviteter for WNT5A-L og WNT5A-S i WNT /β-catenin og DVL phosphoryleringsbegivenheder assays (figur 2), vi spekulere, at disse vækstfremmende og hæmmende aktiviteter af WNT5A er uafhængige af den kanoniske WNT signalvejen .

I et forsøg på at identificere en mekanisme, hvormed WNT5A isoformer udøver forskellige virkninger på spredning, afskærmet vi udtryk for flere kendte Wnt regulerede gener. Vi fandt, at ekspressionen af ​​to gener,

AXIN2

CDK8

, som begge har været impliceret i forskellige aspekter af WNT signalering [7,40,41], blev forskelligt reguleret af isoform- specifik knockdown af WNT5A. Knockdown af WNT5A-L, men ikke WNT5A-S, førte til et fald i

AXIN2

udtryk i tre testede cellelinier (MDA-MB-231, HeLa og SH-SY5Y, figur 3E). I modsætning hertil knockdown af WNT5A-S, men ikke WNT5A-L, førte til en stigning i

CDK8

ekspression i 2 ud af 3 cellelinier (MDA-MB-231 og HeLa) og et fald i SH- SY5Y (figur 3E). Disse data giver en potentiel molekylær forbindelse mellem de observerede forskellige virkninger af WNT5A isoformer på spredning og genregulering og indikerer, at hver WNT5A isoform indvirker på genekspression i en særskilt måde. Yderligere udtømmende undersøgelser, såsom transkriptom analyse, vil der være behov for at identificere og definere veje, der medierer disse differentierede effekter.

Nedregulering af WNT5A-L og overekspression af WNT5A-S isoform i kræft

For at afgøre, om den pågældende pro- og anti-proliferative funktioner i WNT5A-S og WNT5A-L isoformer er relevante for onkogenese, vi analyserede deres udtryk niveauer ved QRT-PCR i primær tumor prøver fra bryst og livmoderhalsen carcinomer og neuroblastomer. Som sammenlignet med normale bryst væv,

WNT5A-L

blev nedreguleret ≥3 gange i 46% (14 af 30) af brystcarcinomer (

P

= 0,04) (Figur 4A) .

WNT5A-S

var ikke påviselig i normalt brystvæv og overudtrykkes i en lille delmængde af brystcancer (4 af 30, 13%, N. S.) (Figur 4A). I normal livmoderhalsen epitel, både

WNT5A-L

WNT5A-S

blev udtrykt,

WNT5A-L

er den fremherskende isoform (figur 4B). I sammenligning med normal cervix,

WNT5A-L

blev nedreguleret ≥3 gange i 53% (8 af 15) af livmoderhalsen carcinomer (

P

= 0,047). I modsætning hertil

WNT5A-S

blev opreguleret ≥4 gange i 40% (6 ud af 15) af disse tumorer (

P

= 0,045) (figur 4B). Neuroblastomer, pædiatriske cancere i det sympatiske nervesystem, kan inddeles i lav og høj risiko tumorer med 90% og 30% af overlevelse hhv. Halvdelen af ​​den høje risiko neuroblastomer er dødelig inden for 2 år fra diagnose [42]. risiko neuroblastomer Høje viste lav

WNT5A-L

udtryk oftere end risiko tumorer lave (55% -22 af 40- versus 21% -8 af 37-,

P

= 0,004), hvilket hvilket antyder, at WNT5A-L nedregulering korrelerer med høj risiko neuroblastom. 0,01;