PLoS ONE: Angivelse af Cyr61, CTGF, og WISP-1 korrelerer med kliniske funktioner i Lung Cancer

Abstrakt

Baggrund

CCN familie, bestående seks medlemmer (Cyr61, CTGF, nov, WISP-1, WISP-2, WISP-3), er involveret i stimulering af celledelingen, migration, adhæsion, angiogenese, og tumorigenese. Flere undersøgelser har vist, at ekspression af Cyr61, CTGF og WISP-1 påvirker tumorigene potentiale lungecancerceller in vitro. Men korrelationen af ​​ekspressionen af ​​CCN familie proteiner og kliniske træk ved lungekræft er stadig ukendt.

Metode og vigtigste resultater

I det foreliggende arbejde, vi kvantificeret mRNA niveauerne af

Cyr61

,

CTGF

, og

WISP-1

i prøver fra 60 primære lungekræft og deres matchede normale lungevæv ved kvantitativ real-time PCR-analyse. Nedregulering af

Cyr61

CTGF

gener og opregulering af

WISP-1

genet blev fundet i primære lungekræft sammenlignet med de parrede normale lungevæv. Immunhistokemi-analyse beskrevet en lignende ekspressionsmønster af Cyr61, CTGF og WISP-1 protein i parrede lungekræft væv. Statistisk analyse viste signifikante sammenhænge mellem udtryk for enten

Cyr61

eller

CTGF

med tumor fase, tumor histologi, metastase, rygning, og familiens historie på diagnosetidspunktet. En signifikant korrelation også eksisterede mellem WISP-1-ekspression med tumor histologi, og patientens alder. Desuden ekspressionsniveauerne af

Cyr61

CTGF

korreleret med overlevelse af patienter de lunge-cancer.

Konklusioner

Vores resultater tyder på, at

Cyr61

,

CTGF

, og

WISP-1

kan være impliceret i udviklingen og progressionen af ​​primære lungekræft, og deres niveauer kan tjene som værdifulde prognostiske markører, samt potentielle mål for terapeutisk intervention

Henvisning:. Chen PP, Li WJ, Wang Y, Zhao S, Li DY, Feng LY, et al. (2007) Angivelse af

Cyr61

,

CTGF

, og

WISP-1

korrelerer med kliniske funktioner i lungekræft. PLoS ONE 2 (6): e534. doi: 10,1371 /journal.pone.0000534

Academic Redaktør: Anja-Katrin Bielinsky, University of Minnesota, USA

Modtaget: Marts 16, 2007; Accepteret: 24 maj 2007; Udgivet: 20 Jun 2007

Copyright: © 2007 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation of China (nr 30.370.690, 30.470.847, og 30.528.003 for Xie, D .; No. 30.200.143 for Tong, X.), Chinese Academy of Sciences (One Hundred Talents programmet Grant KSCX-YW-R -73 til Xie, D.), Science Teknologi Kommissionen for Shanghai Kommune 04DZ14007 og 05DJ14009 (Xie, D.); Kina Postdoc Science Foundation (Wang, Y.), og kinesiske videnskabsakademi K.C. Wong Post-ph.d.-stipendier (Wang, Y.)

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den mest almindelige. årsag til kræft dødsfald i verden [1]. Størstedelen af ​​lungekræft er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som er opdelt i adenocarcinom (AC), pladecellekræft (SC), og store celle carcinom [2]. Den høje dødelighed forbundet med NSCLC er delvis på grund af metastase før kirurgisk fjernelse af den primære tumor. Tumormetastase indebærer frigørelse af tumorceller fra den primære tumormasse, microinvasion af tumorceller i stromale væv, intravasation af tumorceller i blodkar og ekstravasation og vækst af tumorceller i sekundære steder [3], [4]. For at blive metastatisk skal tumorceller øge ekspressionen af ​​metastase-fremmende gener og /eller formindske ekspressionen af ​​metastase-undertrykke gener. Anvendelse af humane lungecancer-cellelinjer har cystein-rige protein 61 (Cyr61) og bindevæv vækstfaktor (CTGF) blevet påvist at inhibere metastase og invasion af cancerceller, og derfor er de blevet betragtet som potentielle suppressorer af metastase [5], [6].

Både CTGF og Cyr61 tilhører CCN familien, opkaldt efter de tre første beskrevne medlemmer – Cyr61 (CCN1), CTGF (CCN2), og Nov (nefroblastom overudtrykkes, CCN3) [7]. CCN familie har seks medlemmer: Cyr61, CTGF, Nov, WISP-1 (Wnt-1-induceret secerneret protein 1) (CCN4), WISP-2 (CCN5) og WISP-3 (CCN6) [8] – [11]. Disse proteiner er modulopbygget i struktur, bestående af en N-terminal signalsekvens efterfulgt af domæner med sekvenslighed for insulin-lignende vækstfaktor-bindende protein, von Willebrand-faktor C, thrombospondin type 1, og en cystein knude ved C-terminalen med en undtagelse af WISP-2, som mangler C-terminalen region [12]. Alle CCN molekyler udskilles, ekstracellulær matrix-associerede proteiner og involveret i interne og eksterne cellulær signalering at regulere celleadhæsion, migrering, mitogenese, differentiering og overlevelse [13]. De regulerer også angiogenese [13] – [15]. Tidligere undersøgelser tydede på, at Cyr61 inducerer celleproliferation, celleadhæsion og angiogenese gennem aktivering af integrin (avp3) i endotelceller [16]. CTGF spiller en nøglerolle nedstrøms for TGF-β og SMAD signalering og stimulerer produktionen af ​​fibronectin og collagen, hvilket er vigtigt for sårheling [17], [18]. WISP-1 udtrykkes kraftigt i fibrovaskulær stroma af brysttumorer udviklingslande i Wnt-1 transgene mus [10]. Tvungen overekspression af WISP-1 i normale rotter nyrefibroblaster (NRK-49F) var tilstrækkeligt til at inducere deres transformation [11]. Desuden har stigende beviser, at der CCN proteiner er involveret i tumorigenese, og variationen af ​​ekspressionen af ​​disse molekyler er blevet observeret i flere typer af cancere [8], [9].

Vi har vist, at Cyr61 handlet som en tumorsuppressor i væksten af ​​NSCLC-celler. Cyr61 undertrykte væksten af ​​NSCLC-celler ved at udløse en signaltransduktionsvej via opregulering af p53 [6], [19]. CTGF og WISP-1 også påvirket tumorgenicitet af lungekræft celler [5], [20] – [22]. Men korrelationer mellem de tre molekyler med kliniske funktioner i lungekræft er uudforsket. Vores tidligere arbejde antydet, at ekspressionen af ​​CCN familiens proteiner har prognostisk værdi for gliom progression og samlet patient overlevelse [23]. I de foreliggende undersøgelser, udførte vi real-time kvantitativ RT-PCR og immunohistokemi til at måle mRNA og protein niveauerne af tre CCN-gener i primære NSCLC prøver og deres matchede normale lungevæv. Desuden vi fastslået, om niveauer af disse CCN gener blev korreleret med kliniske funktioner i NSCLC prøver af flere statistiske analysemodeller.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

Denne undersøgelse analyseret den primære cancer og matchede normale væv fra 60 NSCLC patienter behandlet på First Affiliated Hospital i Zhengzhou Universitet (Henan, Kina) 2002-2005, efter deres skriftligt informeret samtykke. Kræft prøver blev resektion kirurgisk uden neo-adjuverende behandling og tilsvarende ikke-kræft væv, der var mindst 3-4 cm væk fra kræft, blev også opnået. Hver prøve blev delt i 2 dele: en blev sektioneret og undersøgt histologisk ved traditionel H den anden blev frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Vores arbejde blev godkendt af Institutional Review Board for Institut for Nutritional Sciences, Chinese Academy of Sciences.

RNA ekstraktion og cDNA-syntese

Total RNA blev ekstraheret fra frisk-frosne NSCLC prøver og matches normale lungevæv efter TRIzol-reagens (Life Technologies, Inc.) ifølge fabrikantens protokol. Kvaliteten af ​​RNA-prøver blev bestemt ved elektroforese gennem agarosegeler og farvning med ethidiumbromid blev 18S og 28S RNA-bånd visualiseret under UV-lys. 2 ug totalt RNA blev behandlet direkte til cDNA ved revers transkription med Superscript II (Life Technologies, Inc.) ifølge fabrikantens protokol i et samlet volumen på 50 pi.

Real-time revers transkription-PCR (RT -PCR)

RT-PCR blev karakteriseret ved det punkt under cykling når amplifikation af PCR-produktet først blev detekteret, snarere end mængden af ​​PCR-produkt akkumuleret efter et fastsat antal cykler. Parameteren Ct blev defineret som den fraktionerede cyklusnummer hvor fluorescensen genereret ved at lede en fast tærskelværdi over baseline. Niveauet af målgen i ukendte prøver blev kvantificeret ved måling af Ct-værdi: Level (mål) = 2

Ct (mål). Den Ct værdi β-

actin

blev også målt som den endogene RNA kontrol: Niveau (β-

actin

) = 2

Ct (β

actin

). Niveauerne af target gener i hver prøve blev normaliseret på grundlag af sin β

actin

indhold gennem formlen: Normaliseret niveau (NL) = Niveau (mål) /niveau (β-

actin

) = 2

Ct (mål) /2

Ct (β-

actin

) = 2

Ct (mål) -Ct (β-

actin

) = 2

ACt. Desuden blev de relative niveauer (RL) af målgener i prøver kræft versus matchede normale væv beregnes efter formlen: RL = NL (kræft) /NL (normal) = 2

ACt (kræft) /2

ACt (normal) = 2

[ACt (kræft) -ΔCt (normal)] = 2

ΔΔCt. Fordi både NL og RL er repræsenteret som 2

Ct vi derfor brugt ACt og ΔΔCt som NL og RL, henholdsvis for klinisk statistisk analyse.

Primere for real-time PCR til

Cyr61

(5′-GAGTGGGTCTGTGACGAGGAT-3 ‘og 5′-GGTTGTATAGGATGCGAGGCT-3’),

CTGF

(5′-CGACTGGAAGACACGT TTGG-3 ‘og 5′-AGGCTTGGAGATTTTGGGAG-3’),

WISP -1

(5′-AGAGCCGC CTCTGCAACTT-3 ‘og 5′-GGAGAAGCCAAGCCCATCA-3’) og β-

actin

(5′-G ATCATTGCTCCTCCTGAGC-3 ‘og 5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’ ) blev designet ved hjælp af software PRIMER3 og købt fra Shanghai Sangon Biological Engineering Technology Services CO., Blev Ltd Amplification reaktioner udført i et 20 pi volumen af ​​LightCycler-DNA Master SYBR Green Ι mix (Roche Diagnostics Ltd., Applied Science, Penzberg, Tyskland) med 10 pmol af hver primer, MgCl

2 koncentration optimeret mellem 2 og 5 mM, 200 μΜ af hver dNTP, 0,5 U Taq DNA-polymerase og 1 x buffer. Alle reaktionerne blev udført tredobbelt i et iCycler iQ-system (Bio-Rad, Hercules, CA), og indledende denaturering ved 95 ° C i 3 minutter blev efterfulgt af 40 cykler af en denaturering ved 95 ° C i 30 s, et annealingstrin mellem 55 ° C og 58 ° C i 20 s, og en forlængelse ved 72 ° C i 30 s. En endelig ekstension ved 72 ° C i 7 min blev tilsat. For at bekræfte specificiteten af ​​amplifikation blev PCR produkterne fra hvert primerpar underkastet en smeltekurveanalyse og efterfølgende inspektion efter agarosegelelektroforese.

Statistisk analyse

T-test og ANOVA blev vedtaget til undersøge ekspressionen af ​​60 par af NSCLC og normale lungevæv for hver CCN gen og deres tilknytning til enkelte kliniske faktorer (familiens historie, metastaser, rygning, tumor stadie, histologi, tuberkulose, køn, tumor størrelse og patientens alder). Pearsons korrelationsanalyse blev anvendt til at estimere relativ grad af mængden af ​​ekspression af de tre gener. Pearsons korrelation afspejler graden af ​​lineær sammenhæng mellem to variable. Det spænder fra en til -1. De relative værdier (tumor /kontrol) i forhold til actin plottes. For hvert gen, Kaplan-Meier-overlevelseskurver for patienter med forhøjet genekspression

versus

lav genekspression blev plottet og log-rank test blev anvendt til sammenligning af lighed mellem de to overlevelseskurver. Multivariable analyser med Cox proportional hazards model blev anvendt til at estimere virkningerne af de kliniske karakteristika og ekspressionen af ​​de tre gener på overlevelse. Resultaterne blev betragtet signifikant ved P 0,05 eller meget signifikant ved P 0,01. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af programmet SPSS for Windows (SPSS, Chicago, IL).

Immunhistokemi

I immunhistokemi, kræft og tilsvarende normale lungevæv blev frosset i en kryostatkammeret og 10 um snit blev opsamlet på objektglas. Snittene blev fikseret i iskold acetone i 30 minutter, vasket i 0,01 M PBS i 3 × 5 min, blokeret i 1 time i 0,01 M PBS suppleret med 0,3% Triton X-100 og 5% normalt serum og derefter inkuberet med kanin-anti-human Cyr61 (polyklonale, 1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), gede-anti-human CTGF (polyklonale, 1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), eller ged anti-humant WISP-1 (polyklonale, 1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), henholdsvis ved 4 ° C natten over. Efter korte vaskninger i 0,01 M PBS blev snit inkuberet i 2 timer i 0,01 M PBS med peberrodsperoxidasekonjugeret gede-anti-kanin-IgG eller kanin-anti-gede-IgG (1:1000; Chemicon, Temecula, CA, USA), efterfulgt af visualisering med 0,003% H

2O

2 og 0,03% DAB i 0,05 M Tris-HCl (pH 7,6). Negative kontroller bestod af substitution af det primære antistof med normalt serum ved den samme fortynding. Immunhistokemi for hver enkelt blev udført mindst 3 gange og alle snit blev modfarvet med hematoxylin. Scoring af immunhistokemisk farvning blev gennemført uafhængigt af tre patolog blindet for patientens kliniske parametre. Alle farvede sektioner blev scoret både i tumoren og tilstødende ikke-tumor områder i det mindste i 10 high-power field områder med mindst 300 bevarede celler vurderet i hvert område. Procentdelen af ​​celler, der udtrykker målproteinet blev estimeret ved at dividere antallet af positive celler med antallet af totale celler pr høj effekt markareal. Lungeepitelceller bærer indlysende brun signal i cytoplasmaet i forhold til negativ kontrol blev defineret som positive celler. Forbundne-prøver t-test blev anvendt til at evaluere forskellen mellem proteinniveauer af Cyr61, CTGF, eller WISP-1 i tumor prøver sammenlignet med matchede normale lungevæv. Resultater blev betragtet som statistisk meget signifikant ved P 0,01. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af programmet SPSS for Windows (SPSS, Chicago, IL).

Resultater

Angivelse af

Cyr61

,

CTGF

, og

WISP-1

gener i NSCLC og matchede normale lungevæv

for at undersøge ekspressionen mønster af CCN gener i NSCLC, niveauer af

Cyr61

,

CTGF

og

WISP-1

mRNA blev kvantificeret i 60 par af tumorer og deres matchede normale lungevæv ved real-time PCR. Expression niveau blev vist som et forhold mellem

Cyr61

,

CTGF

, eller

WISP-1

og henvisningen genet β-

actin

at korrigere for variationen i mængden af ​​RNA. Nedregulering af

Cyr61

CTGF

mRNA fandt sted i 48 af 60 (80%) og 39 af 60 (65%) NSCLC prøver sammenlignet med de parrede normale lungevæv hhv. I modsætning hertil opregulering af niveauer af

WISP-1

mRNA blev observeret i 50 af 60 (83%) NSCLC prøverne i forhold til deres normale væv (fig. 1). Univariate analyse viste, at mRNA niveau af enten

Cyr61

,

CTGF

, eller

WISP-1

gener var signifikant forskellige mellem kræft prøver og parrede normale dem (tabel 1) . Angivelse af

Cyr61

og

CTGF

i primære lungekræft var signifikant lavere end i matchede normale lungevæv (P 0,001 og P = 0,016, henholdsvis). I modsætning hertil niveauer af

WISP-1

i kræft var betydeligt højere end i de matchede normale dem (P 0,001) (tabel 1). Pearsons korrelationsanalyse viste yderligere, at ekspressionen af ​​

Cyr61

CTGF

var stærkt positivt korreleret (R = 0,604; P 0,001), mens ekspressionen af ​​

WISP-1

CTGF

viste en signifikant negativ sammenhæng (R = -0,299; P = 0,020). Angivelse af

WISP-1

og

Cyr61

var ikke signifikant korreleret (R = -0,182; P = 0,164) (Tabel 2). Fordi de tre gener er alle medlemmer af CCN familie, er det muligt, at deres udtryk kan blive kontrolleret af nogle almindelige regulatorer (for

Cyr61

CTGF

) eller antagoniseres af hinanden (for

WISP-1

og

CTGF

).

relative mRNA ekspressionsniveauer af

Cyr61

,

CTGF

, og

WISP -1

er vist i 60 par af primære NSCLC væv og matchede normale lunge prøver. Expression vises som et forhold mellem ekspressionen af ​​CCN gener i cancer

versus

matchede normale væv. Hver søjle er log2 værdi for forholdet af CCN ekspressionsniveauer mellem lungetumorer (t) og matchede normale væv (N) fra de samme patienter. Mindre end 2-gange ændring: forholdet mellem tumor og normal er 2. Fordi log2 2 = 1, bar værdi 1 repræsenterer 2-fold stigning (T N), mens bar værdi -1 repræsenterer 2-fold fald (T N).

Immunhistokemi blev anvendt til at overvåge protein ekspression af Cyr61, CTGF og WISP-1 i 60 par af lungevæv. Forbundne-prøver t-test viste, at protein ekspression af Cyr61 (P 0,001) og CTGF (P 0,001) dramatisk blev nedreguleret i cancervæv sammenlignet med deres normale modstykker (figur 2). Desuden blev signifikant opregulering af WISP-1 fundet i cancer prøver (P 0,001) sammenlignet med matchede normale væv (figur 2). Repræsentative fotografier viste, at Cyr61 blev højt udtrykt i cytoplasmaet i lungeepitelceller i de normale lungevæv hos patienter med lungekræft (fig. 3A), men niveauerne var bemærkelsesværdigt reduceret i de ondartede modstykker (fig. 3B). Især nedreguleringen af ​​Cyr61 skyldes især den store reduktion af Cyr61 ekspressionsniveau i individuelle celler snarere end en nedsættelse af Cyr61-positive lungeepitelceller. CTGF viste højere intensitet af farvning i cytoplasmaet af normale lunge epiteliale celler (figur 3D.) End i lungecancerceller (figur 3E.); forholdet mellem CTGF-positive til -negative celler i cancervæv var klart lavere i sammenligning med de tilsvarende normale lungevæv. Selvom ekspression af WISP-1 var lav i cytoplasmaet af epitelceller afledt fra normale lungevæv (Fig. 3G), blev det bemærkelsesværdigt forøget i matchede lunge-cancer væv (fig. 3h). Tilsammen er resultatet af immunhistokemi parallel dem af real-time RT-PCR.

Grafen skildrer distributioner af prøver i henhold til den procentdel af cellerne positive for Cyr61, CTGF, og WISP-1 i 60 par af NSCLC og matches ikke-kræft lungevæv. P-værdier (parret-prøver t-test) er anført tyder forskellen mellem NSCLC prøver versus matchede normale væv.

I ikke-kræft lungevæv fra patienter med NSCLC, intens Cyr61 immunoreaktivitet (brun) er observeret i cytoplasmaet i celler såvel som ekstracellulære rum (A). I tilsvarende NSCLC væv, Cyr61 immunoreaktivitet er mindre (B) sammenlignet med normalt lungevæv. Svarende til Cyr61, mange CTGF-positive celler (brun) er synlige i ikke-tumor-lungevæv (D), og positive signaler kun sparsomt fordelt i NSCLC væv (E). WISP-1 immunhistokemi imidlertid viser en anden ekspressionsmønster. WISP-1 immunreaktivitet (brun) er næppe påvises i normale lungevæv fra NSCLC-patienter (G), men er markant forøget i NSCLC væv (H). C, F og I er negative kontroller af Cyr61, CTGF og WISP-1 hhv. Alle objektglas modfarvet med hematoxylin (blå). Scale bar = 60 um.

Forholdet mellem ekspressionen af ​​Cyr61 i lungekræft og de kliniske og patologiske træk ved de enkelte

univariat analyse viste, at en signifikant sammenhæng eksisterede mellem udtryk for

Cyr61 versus

tumor stadie, metastase, histologisk undertype, rygning og familiær disposition (tabel 3). Niveau af

Cyr61

udtryk faldt betydeligt i høje fase tumorer i forhold til tumorer lave fase (P = 0,014). Multiple sammenligning (LSD t-test) viste, at ekspression af

Cyr61

mellem tumorer af fase I og III var signifikant forskellige (P = 0,004); men ingen signifikant forskel i

Cyr61

ekspression forekom i NSCLC prøver at sammenligne enten trin I og II (P = 0,063) eller trin II og III (P = 0,17). Histologisk analyse viste, at en signifikant forskel fandtes blandt SC, AC, adeno-pladecellecarcinom (ASC) og andre patologiske type niveau af ekspression af

Cyr61

(P = 0,001). Desuden multipel sammenligning (LSD t-test) viste, at ekspressionen af ​​

Cyr61

mellem SC

versus

ASC (P = 0,009) eller SC

versus

anden patologisk type (P = 0,001) var signifikant forskellig. Tilsvarende signifikante forskelle i

Cyr61

udtryk blev også observeret mellem AC

versus

ASC (P = 0,015) eller AC

versus

anden patologisk type (P = 0,002). Rygning var forbundet med lav udtryk for

Cyr61 Hotel (P = 0,009). I modsætning hertil udtryk for

Cyr61

var ikke korreleret med tuberkulose, køn, alder, og tumorstørrelse (tabel 3).

Forholdet mellem udtryk for

CTGF

i lungekræft, og de kliniske og patologiske træk ved de enkelte

Statistisk analyse viste, at ekspressionen af ​​

blev CTGF

stærkt forbundet med nogle kliniske funktioner i NSCLC, herunder tumor stadie, metastase, histologi, rygning , og familiens historie (tabel 3). Niveau af

CTGF

faldt betydeligt i høj fase tumorer i forhold til lav-trins tumorer (P = 0,040). Desuden signifikant forskel på

CTGF

udtryk eksisterede mellem tumorer, scene I

versus

fase III (P = 0,013) og fase II

versus

fase III (P = 0,024) ; blev dog ikke observeret nogen signifikant statistisk forskel mellem tumorer, fase I og II (P = 0,077). For metastase, udtryk for

CTGF

i metastatisk NSCLC var betydeligt lavere end i ikke-metastatisk NSCLC (P = 0,039); betydeligt, rygning var associeret med en fremtrædende undertrykkelse af

CTGF

ekspression i NSCLC (P = 0,017) (tabel 3). Derudover en signifikant forskel forekom blandt SC, AC, ASC og andre patologiske typer i niveauet af CTGF (P = 0,005). Desuden niveau af

CTGF

hos patienter var signifikant lavere end dem, hvis familie medlemmer ikke havde kræft (P = 0,038). Men køn, tumorstørrelse, alder og histologi af tuberkulose viste ingen signifikante sammenhænge med ekspressionen af ​​

CTGF Hotel (tabel 3).

Forholdet mellem udtryk for

WISP-1

i NSCLC og de kliniske og patologiske træk ved de individer Salg

Statistisk analyse viste, at ekspression af

WISP-1

var signifikant associeret med tumor histologi, samt alder af NSCLC-patienter på diagnosetidspunktet ( tabel 3). En-vejs ANOVA-analyse viste, at signifikante forskelle eksisterede blandt SC, AC, ASC og andre histologiske typer i deres udtryk for

WISP-1 Hotel (P = 0,017). Niveau af

WISP-1

i ASC var meget højere end i enten SC (P = 0,002) eller AC (P = 0,015). Desuden yngre patienter (i alderen, 35-50) havde en signifikant højere niveau af

WISP-1

i deres tumorer end ældre personer (aldre, 50-65 eller ≥65) (P = 0,018 og P = 0,036 , henholdsvis). I modsætning hertil blev der andre kliniske parametre (familiens historie, metastase, historie af rygning, tuberkulose, køn, tumortype, og tumorstørrelse) ikke er forbundet med udtryk for

WISP-1

.

Expression af

Cyr61

,

CTGF

,

WISP-1

gener og klinisk resultat af NSCLC

univariat overlevelse analyse viste, at ekspressionen af ​​

Cyr61

,

CTGF

, metastaser, og rygning var signifikant associeret med overlevelse (tabel 4). Kaplan-Meier-kurver foreslået, at patienter med høj ekspression af

Cyr61

viste en signifikant forlænget gennemsnitlig overlevelsestid i sammenligning med de andre patienter (fig. 4A) (P = 0,001). Tilsvarende høje niveauer af

CTGF

var forbundet med forlænget overlevelse (fig. 4B) (P = 0,031). I modsætning hertil ingen signifikant association af

WISP-1

udtryk og overlevelse blev bemærket (fig. 4C) (P = 0,214). Efter at kontrollere de kliniske og patologiske karakteristika (alder, køn, metastase, røg, tumor stadie, tuberkulose, tumor størrelse), blev multivariat (Cox regression) overlevelse analyse udført for at vurdere de potentielle virkninger af de tre CCN gener på kræft prognose. Resultatet viste, at både

Cyr61

CTGF

var signifikant uafhængige positive prognostiske faktorer for overlevelse af patienter med NSCLC, og den relative risiko var 0,047 for

Cyr61

og 0,0357 for

CTGF

(tabel 5). Men sket nogen signifikant sammenhæng mellem

WISP-1

udtryk og overlevelse (tabel 5). Vejviser

Diskussion

Cyr61, CTGF, og WISP-1 spiller en vigtig rolle i celleproliferation, migration og differentiering. Deres ekspression synes at være reguleret forskelligt i forskellige typer af tumorer. At undersøge korrelationen mellem ekspression af CCN gener og NSCLC, vi brugte realtids-PCR og immunohistokemi at vurdere mRNA og protein niveauerne for disse tre gener i NSCLC og deres tilpassede normale lungevæv. Nedregulering af

Cyr61

CTGF

og opregulering af WISP-1 fandt sted i NSCLC prøverne i forhold til deres normale modparter, hvilket tyder på, at disse molekyler kan være forbundet med tumordannelse og progression i NSCLC.

Cyr61 er det første klonede medlem af CCN familien og dens regulatoriske roller i tumorceller er blevet meget omtalt i mange typer af kræft. I brystcancer, Cyr61 er overudtrykt og kan stimulere tumorprogression [24] – [27]. En gastrisk adenocarcinom cellelinie blev mere tumorgene, når cellerne blev genetisk manipuleret til at udtrykke høje niveauer af Cyr61 [16]. Ekspression af Cyr61 var høj i rhabdomyosarcomer og cellelinjer afledt maligne melanomer, kolon adenokarcinomer og blærepapillomer [16], [28]. Maligne gliomer har ofte høje niveauer af Cyr61 associeret forbedret tumorgenicitet medieres via integrinet-linked kinase signalvej [29]. Opregulering af Cyr61 udtryk blev for nylig identificeret i peritoneale metastaser fra human bugspytkirtelkræft [30]. Paradoksalt nok synes Cyr61 til at have den modsatte rolle i lungekræft. Vi har beskrevet at Cyr61 blev nedreguleret i fire af 5 prøver af lungecancer og lungecancerceller stabilt transficeret med en Cyr61 ekspressionsvektor var mindre tumorigene end vektoren alene transficerede kontrolceller [19]. Vore yderligere undersøgelser viste, at tvungen ekspression af Cyr61 i lungecancerceller resulterede i deres celle-cellecyklusstandsnings i G1-fasen medieret af p53 [6]. Her fandt vi, at ekspressionen af ​​

Cyr61

er faldet i NSCLC prøver i forhold til deres matchede kontroller, som i høj grad understøtter vores tidligere hypotese. Cyr61 blev også rapporteret at inhibere væksten af ​​prostatacancer [31], endometriecancer [32] og leiomyomas [33]. Taget sammen foreslår dataene, at Cyr61 kan opføre sig som en tumorsuppressor under visse omstændigheder i flere vævstyper, herunder NSCLC.

CTGF blev identificeret som et mitogen findes i det konditionerede medium af humane umbilical vene endotelceller [34 ]. Den koder et protein på 349 aminosyrer med 43% sekvensidentitet med Cyr61, og alle 38 cysteiner i CTGF og Cyr61 er fuldstændigt bevaret. CTGF blev fundet at være overudtrykt i brysttumorer [26], [35], melanomer [36], pancreascancer [37], sarkomer inklusive chondrosarcomer [38], [39]; mens en omvendt korrelation er blevet rapporteret mellem den maligne fænotype og niveauet af CTGF-ekspression i fibroblaster og endotel- celle tumorer [40]. I vores eksperimenter, fandt vi, at niveauet for ekspression af

CTGF

i NSCLCs var lavere end i de matchede normale lunge prøver, hvilket indebærer dens potentiale tumor-undertrykke funktion. I overensstemmelse med vores fund, en nylig undersøgelse fra Chien

et al.

[20] viste, at CTGF undertrykt lungekræft cellevækst ved induktion af p53, såvel som ved hæmning af insulin-lignende vækstfaktor-I afhængige Akt phosphorylering og epidermal vækstfaktor-afhængige ekstracellulært signal-regulerede kinase 1/2 fosforylering.

på den anden side, fandt vi, at

WISP-1

blev overudtrykt i NSCLC prøver i forhold til deres normale lung tissue modstykker, hvilket antyder at WISP-1 kan virke som en onkoprotein i NSCLC. WISP-1 blev identificeret som et gen, der blev opreguleret i Wnt-1 transformeret C57 MG musebryst epitelceller; det har fuldstændig beskyttelse af alle 38 cysteinrester med dem af Cyr61 og CTGF [10]. WISP-1 er blevet forbundet med enten forøges eller inhibere væksten af ​​tumorer. For eksempel er det stærkt udtrykt i humane bryst- og coloncancerformer [10]. Tvungen overekspression af WISP-1 i normale rotter nyrefibroblaster (NRK-49F) var tilstrækkeligt til at inducere deres transformation [11]. I modsætning hertil blev WISP-1-ekspression omvendt korreleret med proliferation, metastase og vækst af melanomceller [41], [42]. Derudover vores resultat, at opregulering af WISP-1 var positivt korreleret med lungecancer metastase var i overensstemmelse med resultater fra en musemodel [21]. Paradoksalt nok snart

et al., Fundet, at

in vitro

overekspression af WISP-1 faldt motilitet af lungekræft celler [22]. Da WISP-1 er et udskilt protein og fungerer primært ved interaktion med ECM, kan forskellen i resultater afspejler forskellen i ECM

in vivo

in vitro

.

univariate statistisk analyse yderligere oplyses, at lave niveauer af enten

Cyr61

eller

CTGF

blev relateret til udviklingen af ​​NSCLC, og nedregulering af

Cyr61

og

CTGF

var mere bemærkelsesværdig hos patienter med arvelig end dem uden familiens historie. Disse data antydede, at Cyr61 og CTGF kan være tumorsuppressorgener i lungekræft. Gennem multipel lineær regressionsanalyser desuden fandt vi, at de kliniske funktioner er tæt forbundet med niveauer af ekspression af

Cyr61

,

CTGF

WISP-1

. Expression niveau af

Cyr61

i 71% lungekræft prøver blev bestemt ved otte uafhængige variable, primært ved AC, SC og alder. Niveauer af

CTGF

i NSCLCs blev også markant i forbindelse med kliniske funktioner, men med visse forskelle. Køn syntes at spille en rolle i udtryk for

CTGF

, men ikke

Cyr61

.