PLoS ONE: polymorfier i Radio-Responsive Gener og dens tilknytning til Akut toksicitet blandt hoved- og halscancer Patients

Abstrakt

Cellulær og molekylære metoder er ved at blive undersøgt for at finde en biomarkør, der kan forudsige udviklingen af ​​stråling fremkaldt akut toksicitet før strålebehandling. SNPs i stråling responsive gener kan betragtes som en tilgang til at udvikle værktøjer til at finde den nedarvede grundlag af kliniske radiosensitivitet. Den aktuelle undersøgelse forsøger at screene enkelt nukleotid polymorfier /deletioner i DNA skade responset, DNA-reparation, profibrotic cytokin samt antioxidant respons gener og dens prædiktive potentiale med de normale væv bivirkninger fra kræftpatienter 183 hoved og hals undergår platinbaseret kemostråleterapi eller strålebehandling alene. Vi analyserede 22 polymorfier i 17 gener med funktionel relevans for stråling respons. Strålebehandling induceret mundtlige mucositis og hud erytem blev betragtet som slutpunktet for klinisk radiosensitivitet. Direkte korrelation af heterozygote og mutante alleler med akutte reaktioner samt haplotype korrelation afslørede NBN varianter at være prædiktiv betydning i at analysere oral mucositis før strålebehandling. Desuden fandtes genetiske koblingsuligevægt i XRCC1 polymorfier for grad 2 oral mucositis og hudreaktion angiver den komplekse arv mønster. Den aktuelle undersøgelse viser en forening for polymorfi i NBN med normalt væv radiosensitivitet og yderligere warrants replikation af sådanne undersøgelser i en stor mængde stikprøver

Henvisning:. Venkatesh GH, Manjunath VB, Mumbrekar KD, Negi H, Fernandes DJ, Sharan K, et al. (2014) polymorfier i Radio-Responsive Gener og dens tilknytning til Akut toksicitet blandt hoved- og halscancer patienter. PLoS ONE 9 (3): e89079. doi: 10,1371 /journal.pone.0089079

Redaktør: Jian Jian Li, University of California Davis, USA

Modtaget: August 23, 2013; Accepteret: 14 januar 2014; Udgivet: 4 marts 2014

Copyright: © 2014 Venkatesh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansieret af Institut for Bioteknologi, Indiens regering, give BT /01 /COE /06/02/07 (https://dbtindia.nic.in/index.asp). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

præcise stråling levering metoder har væsentligt forbedret tumor kur og overlevelsesraten på grund af den seneste udvikling, men det har været på bekostning af betydelige stigning i normalt væv toksicitet. Heterogenitet i normalt væv radioresponse er observeret blandt patienter behandlet med identiske doser af stråling, hvilket yderligere fører til en dynamisk og kumulativ proces af normalt væv toksicitet. I hoved- og halscancer (HNC) patienter, oral mucositis og erythem er de store komplikationer i løbet af kemo- og stråleterapi. Det påvirker smerter kontrol og tilstrækkelig levering behandling, hvilket fører til uventede strålebehandling (RT) pauser, gå på kompromis med behandlingseffekt [1]. Tidligere kliniske erfaringer har vist, at kun 20% af variationen var på grund af stokastisk eller tilfældige begivenheder, mens resten 80% var på grund af patientens relaterede genetiske [2] faktorer. Sammenhængen mellem alvorlig radiosensitivitet og genetiske syndromer som Ataksi-telangiectasia, Fanconis anæmi, og Bloom syndrom, etc., giver os et bevis for princippet om inddragelse af genetisk komponent bag normale væv akutte reaktioner [3]. Også tidligere resultater demonstrerer genotype-afhængig anledning til akutte og sene virkninger af RT ses i normale væv [4] [5]. Bortset fra molekylære aspekter, vores tidligere undersøgelser tyder på, at der eksisterer et cellulært grundlag for normalt væv strålefølsomhed [6]. To tredjedel af de gennemførte undersøgelser indtil dato rapport sammenslutningen af ​​genetisk variation i kandidatgener med stråling induceret toksicitet, men de fleste af disse undersøgelser er med små patient tal og mangler uafhængig validering [7]. Selvom undersøgelser er blevet udført for at knytte polymorfi i udvalgte kandidatgener med klinisk observerede normale væv bivirkninger, dets kliniske anvendelighed som biomarkør /s er stadig tvivlsom [8] [9]. Derfor veldesignede kliniske studier med hundredvis af prøver er nødvendige for at søge en biomarkør for udviklingen af ​​den enkelte behandlingsprotokoller [10] [11].

I den foreliggende undersøgelse, single-polymorfier /deletioner i udvalgte kandidatgener relateret til DNA-skader og reparation, antioxidant respons og afgiftning enzymer og profibrotic cytokin blev analyseret. SNPs i kandidat stråling responsive gener som ATM, XRCC1, XRCC3, XRCC4, Ku70, Ku80, LIG4, OGG1, NBN, RAD51, TGFp1, SOD2, CAT og GST blev udvalgt. Sværhedsgraden af ​​oral mucositis og hudreaktion blev registreret i henhold til strålebehandling Oncology Group (RTOG) kriterier [12] og sammenhængen mellem genetisk polymorfi og oral mucositis og hudreaktion blev evalueret for den øgede risiko for at udvikle disse normale væv bivirkninger.

Materialer og Metoder

patienter og kliniske data

undersøgelsen blev foretaget fra 183 HNC patienter, der gennemgår kemostråleterapi på Kasturba Hospital, med en forudgående godkendelse af University Etisk Udvalg (UEC /15/2007) og en skriftlig informeret samtykke fra patienterne før opsamling af blod før RT. Alle patienter blev behandlet ved 3-Dimensional Conformal strålebehandling. Brutto tumor volumen (GTV), Clinical Target Volume (CTV) og Planlægning target volumen (PTV) blev defineret ved hjælp af disse planlægge CT-scanning. Gross tumor volumen omfattede alle kendte brutto sygdom som defineret af kliniske fysisk undersøgelse og billedbehandling resultater. Patienter med grov sygdom blev behandlet ved Linac 6-MV X-ray lineær accelerator (Elekta Præcis digital, Stockholm, Sverige) med den totale tumor dosis på 70 Gy (2 Gy per dag i 5 dage om ugen). Patienter efter kirurgisk resektion har positive margener fik en dosis på 66 Gy i 33 fraktioner. Patienter med ingen positive margener blev givet 60 Gy på 30 fraktioner. Dosis til ørespytkirtlen, submandibulære spytkirtlerne, konstriktor muskler og andre strukturer blev ikke begrænset i betragtning af 3-Dimensional planlægning behandling i alle patienter. Cisplatin kemoterapi (100 mg /m

2 for én gang i 3 uger) blev givet til flertallet af de patienter, når serum-kreatinin var normal. Ældre patienter fik en ugentlig dosis på 40 mg /m

2 i 6 uger og patienter med borderline forhøjet serum kreatinin modtaget carboplatin (areal under kurven (AUC) @ 1.5) på en ugentlig basis i 6 uger. I alt 148 patienter fik samtidig kemostråleterapi og de resterende patienter blev modtaget strålebehandling alene. Patienter med tilbagevendende tumor og fjernmetastaser blev udelukket. Akutte bivirkninger (oral mucositis og hud reaktion) blev registreret under og efter afslutningen af ​​behandlingen i henhold til RTOG kriterier [10]. Detaljerne i HNC patientkarakteristika er beskrevet i tabel 1.

Genotypning, haplotype og koblingsuligevægt analyse

Genomisk DNA isolation blev udført ved at anvende den konventionelle procedure phenol chloroformekstraktion og ethanolfældning . Genotypebestemmelse blev udført ved polymerasekædereaktion baseret restriktionsfragmentlængde-polymorfisme. Detaljerne findes i tabel 2. Fem procent af prøverne blev tilfældigt udvalgt og re-genotypebestemmes vurdere konsekvensen i resultaterne.

Statistisk analyse

Hver polymorfi blev testet for afvigelse fra Hardy-Weinberg ligevægt. Statistisk signifikans blev analyseret ved Fisher eksakt test. Odds-forholdet blev anslået til at teste, om en forening eksistere mellem graden af ​​akut toksicitet og udvalgte SNP /haplotyper. Haplotypeanalyse og koblingsuligevægt estimater blev gjort ved hjælp SHEsis software [13]. Alle statistiske tests blev udført ved hjælp af Prism v.5.0 (GraphPad Software, San Diego, Californien, USA) og Statistisk Package for Social Science (Version 16,0, Chicago, USA).

Resultater

fordeling af patienter baseret på histopatologisk sortering, tumor scenen og akut toksicitet kvaliteter findes i tabel 1. den gennemsnitlige alder gruppe af patienterne behandlet i undersøgelsen var 54,74 år. Strålingsdoser fra 60 til 70 Gy (median = 66 Gy) i 30 til 35 fraktioner blev givet til patienterne. I alt 148 patienter gennemgik platinbaseret kemostråleterapi, mens de resterende fik strålebehandling alene. Ud af 183 patienter, 71 (38,79%) patienter oplevede svær mucositis (grad 3 og 4) og 44 (24,04%) oplevede alvorlige hudreaktioner. Vi analyserede tilstedeværelse af forstyrrende faktorer som diabetes, hypertension, rygning, alkohol, kirurgi og kemoterapi og fandt, at patienter med alkoholisme var forbundet med grad ≤2 mucositis (p = 0,02) (tabel 3).

Ifølge stråling onkologer, er toksicitet op grad 2 normalt tolereres af patienter uden nogen terapeutisk intervention, men grad 3 og 4 kræver indgriben med terapeutiske midler. Baseret på dette, og overvejer rapporter fra tidligere undersøgelser [14] [15], vi grupperet patienten normale væv toksicitetsdata som grad ≤2 eller 2. Da den dosis, udsat for mundhulen /svælg region varierer fra 0-40% i hypopharynx, strubehoved, skjoldbruskkirtlen og region af ukendt oprindelse, er data fra kræft i disse regioner udelukket til analyse oral mucositis. Af alle de polymorfier testet, blev RAD51 (rs1801321) Ku70 (rs2267437) og XRCC4 (rs1805377) fundet at afvige fra Hardy-Weinberg ligevægt. Univariate analyse viste, at ingen af ​​de polymorfier fremlagt nogen signifikant forbindelse til hudreaktion (tabel 4). Det anførte dog, at odds for patienter, der oplever svær oral mucositis (grad 2) med recessive allel af NBN (rs1805794) var 3,75 gange højere skulle et konfidensinterval på 1,201 til 11,70 og p = 0,023. Også, heterozygote varianter i CAT (rs7943316) vises 0,452 (odds værdi) gange mindre tilbøjelige til at opleve svær oral mucositis (grad 2) med et konfidensinterval på 0,206-0,993 og p = 0,048. I forlængelse, multivariat analyse viste, at odds for patienter, der oplever svær oral mucositis (grad 2) med recessive allel af NBN (rs1805794) var 4,72 gange højere skulle et konfidensinterval på 1,384 til 16,151 og p = 0,013 (tabel 5). Men når vi kategoriseret dataene som kemostråleterapi og strålebehandling som separate grupper, vi ikke observere en sådan signifikant sammenhæng med normalt væv toksicitet i strålebehandling gruppe (tabel S1 og tabel S2). Endvidere, som det prøvenummer er mindre i strålebehandling alene (n = 35) er det vanskeligt effektivt at afslutte resultaterne.

haplotypebestemmelse og kombination af risikofaktorer alleler

haplotype analyse blev udført for 4 SNP’er i XRCC1, 2 polymorfier i RAD51 samt 2 polymorfier i NBN at udforske associering den kombinatoriske virkning af disse varianter med forøget normalt væv radiosensitivitet. Haplotypeanalyse af NBN (rs1805787, rs1805794) gen viste G-C-haplotypen at være forbundet med udviklingen af ​​oral mucositis (odds ratio på 1,687 og 95% CI af 1,005-2,831 med p = 0,047) (tabel 6). Endvidere kan afgøre, om nogen flere SNP har en additiv virkning på oral mucositis samt hudreaktion, det gennemsnitlige antal variante alleler per patient i hver RTOG gruppe blev analyseret (figur 1). Baseret på den allel frekvens rapporteret i dbSNP databasen, har vi rapporteret vildtype, heterozygote og recessive genotyper. Vi overvejede den mindre allel i denne gruppe, da risikoen allel og talte antallet af risikofaktorer alleler hos hver patient. Resultaterne antyder, at antallet af variante alleler har ingen virkning på sværhedsgraden af ​​normalt væv toksicitet

Resultaterne af Kruskal-Wallis-test viser, at sammenligningen mellem grupperne er ikke-signifikante (p 0,05).. Fejlbjælkerne viser den mindste til maksimale værdier for risiko allel repræsenteret i hver gruppe.

Derudover analyserede vi bindingsuligevægt mønster for SNPs i XRCC1 og fandt, at rs3213245, rs1799782, rs25489 og rs25487 var forbundet med svær oral mucositis mens, rs1799782 og rs25489 var forbundet med svær hudreaktion. Også, at validere denne linkede SNP’er blev analyseret for bindingsuligevægt mønster separat i normale væv overreactor og ikke-overreactor fænotyper. De d ‘værdier var markant større i normale væv radiosensitive fænotyper (figur 2).

Tallene inde hver boks repræsenterer R2 værdier (%) af bindingsuligevægt.

Diskussion

Selv den voksende mængde af SNP data tyder det genetiske grundlag for modtagelighed for radioterapi induceret akutte effekter, er det mindre klart, om SNP kan tjene som en biomarkør til forudsigelse det normale væv toksicitet. Identificere de genetiske profiler associeret med en forøget eller reduceret risiko for strålebehandling komplikationer synes at være en meget lovende faktor til at forbedre effektiviteten af ​​strålebehandling [9] [16]. Mængden af ​​menneskelige genetiske mangfoldighed er enorm, og vi er netop nu begyndt at forstå, hvordan sådanne ændringer påvirker den specifikke fænotypiske udtryk. Bemærkelsesværdig genetiske variationer findes blandt befolkningerne og forstå denne variation vil hjælpe os til at skræddersy behandlingen med en personlig tilgang for sikrere og effektivt resultat.

Baseret på den funktionelle betydning af gener i stråling reaktion, vi analyserede sammenslutning af nogle af de vigtige genvarianter, der tilhører DNA skade responset, DNA-reparation, profibrotic cytokin, antioxidant gener med normalt væv overreactor fænotype (grad 2 toksicitet). Vi fandt ikke nogen signifikant association til enten de valgte SNPs eller for haplotyper med risikoen for at udvikle orale mucositis og hudreaktion i HNC patienter. Men observerede vi en forening for NBN (rs1805794) polymorfi i univariate samt multivariat model for analyse. Desuden blev en af ​​NBN haplotype forbundet med alvorlige orale mucositis. NBN er en komponent af MRE kompleks (MRE11-RAD50-NBN), som er involveret i skader sensing, signalering og reagere på DSBs [17]. Denne polymorfisme medfører ændringen i Nibrin proteinet ved 185. kodonposition fra glutaminsyre til glutamin og den funktionelle betydning af denne ændring er stadig uklart [18]. Det blev rapporteret, rs1805794 ikke var forbundet med akutte bivirkninger af strålebehandling hos brystkræftpatienter [18] [19]. Der er også undersøgelser, der rapporterer ingen sammenhæng for rs1805794 og sene stråling toksiciteter [20] [21].

I øjeblikket er der kun få undersøgelser i forbindelse med normale væv toksicitet og genotype analyse i HNC patienter, og det er mindre klart, om de SNP’er kan tjene som en biomarkør for predicitng det normale væv toksicitet. Werbrouck og medarbejdere [22] rapporterer, at SNPs i DNA reparation gener XRCC3 (rs861539) og Ku70 (rs2267437) kan hjælpe med at bestemme risikoen for akut dysfagi. Undersøgelse udført af Pratesi et al. [23] har foreslået, at patienter med XRCC1 (rs25487) og RAD51 (rs1801320) har højere sandsynlighed for at udvikle oral mucositis og dysfagi i HNC patienter. I modsætning til tidligere rapporter, null varianter af GSTM1 og GSTT1 viste også ingen sammenhæng med udviklingen af ​​akutte reaktioner [24]. Også, har en storstilet analyse til screening 3.144 SNPs fra 156 brystkræftpatienter afsløret, at ABCA1 og IL12RB2 polymorfi er stærkt modtagelige for stråling-induceret dermatitis [25]. Omvendt flere undersøgelser formål at validere effekten af ​​TGFp1 [26], [27], ATM, GSTP1, SOD2, TGFp1, XPD og XRCC1 [28] har angivet en sådan forening for risikoen for at udvikle normale væv toksicitet. Tidligere rapporter med tilgangen i haplotypeanalyse har afsløret adskillige haplotyper med omfattende dokumentation for at forudsige akutte reaktioner af strålebehandling [4] [29] [30]. Vores analyse for XRCC1 haplotype ikke forbinder med risiko for øget akutte reaktioner, men NBN haplotype havde en forening for oral mucositis .. Undersøgelser tyder på, at SNP’er eller haplotyper i funktionelt vigtige kandidatgener alene kan ikke bidrage til stråling induceret akutte reaktioner. Desuden omfattende litteraturgennemgang [8], [31] har tilkendegivet en modstridende forening for modtagelighed for stråling induceret toksicitet, hvilket understøtter behovet for yderligere undersøgelser.

Som konklusion, vi rapportere, at genvarianter og haplotyper af NBN er forbundet med risikoen for at udvikle orale mucositis hos patienter med hoved- og halscancer undergår kemostråleterapi /strålebehandling. Ud over screening for sjældne varianter have store effekter og almindelige varianter med små effekter, er vi nødt til at identificere andre typer af variation og udforske gen miljø interaktioner for at udvikle prognosemodeller. Yderligere replikation af vores resultater i store datasæt med sti tilgang og store genom-brede associationsstudier med metodiske tilgang kan være til stor nytte for at udvikle prædiktive biomarkører for denne komplekse træk og resultaterne skal være uafhængigt bekræftet i forskellige populationer.

Støtte Information

tabel S1.

univariat analyse af kandidat enkelt nukleotid polymorfier og stråling-induceret hudreaktioner efter kategorisere prøverne baseret på kemostråleterapi og strålebehandling alene

doi:. 10,1371 /journal.pone.0089079.s001

(DOCX)

tabel S2.

univariat analyse af kandidat enkelt nukleotid polymorfier og stråling-induceret oral mucositis efter kategorisere prøverne baseret på kemostråleterapi og strålebehandling alene

doi:. 10,1371 /journal.pone.0089079.s002

(DOCX)

Tak

Vi er taknemmelige for alle de deltagende patienter for deres samarbejde. Vi står i gæld til Dr. K. Satyamoorthy, direktør, School of Life Sciences for hans opmuntring og Manipal University for at levere de faciliteter, mens virksomheden denne undersøgelse. Vi takker Prof. P. Gopalakrishna Bhat, Prof. Padmalatha Rai S. og Dr. Saadi Abdul Vahab for nyttige kommentarer til manuskriptet.