PLoS ONE: nedregulering af HIPK2 Øger Resistance af blærekræft Cell til cisplatin ved Regulering Wip1

Abstrakt

Cisplatin-baserede kombination kemoterapi er et fornuftigt alternativ til cystektomi i avanceret /metastaserende blærecancer, men erhvervelse af cisplatin resistens er almindelig hos patienter med blærecancer. Tidligere undersøgelser har vist, at tab af homeodomæne-interagerende protein kinase-2 (HIPK2) bidrager til celleproliferation og tumorigenese. Imidlertid er rollen af ​​HIPK2 i regulering kemoresistens af cancercelle ikke fuldt klarlagt. I nærværende undersøgelse fandt vi, at HIPK2 mRNA og protein niveauer er signifikant reduceret i cisplatin-resistente blærekræft celle

in vivo

in vitro

. Nedregulering af HIPK2 øger cellernes levedygtighed på en dosis- og tidsafhængig måde under cisplatin behandling, hvorimod overekspression af HIPK2 reducerer cellelevedygtigheden. HIPK2 overekspression delvis overvinder cisplatin-resistens i RT4-CisR celle. Desuden viste vi, at Wip1 (vildtype p53-induceret phosphatase 1) ekspression opreguleres i RT4-CisR celle sammenlignet med RT4 celle, og HIPK2 regulerer Wip1 ekspression negativt i blærekræft celle. HIPK2 og Wip1 udtryk også negativt korreleret efter cisplatin-baseret kombinationskemoterapi

in vivo

. Endelig viste vi, at overekspression af HIPK2 sensibiliserer kemoterapi blærekræft celle til cisplatin ved at regulere Wip1 udtryk.

Konklusioner

Disse data tyder på, at HIPK2 /Wip1 signalering repræsenterer en ny vej regulerer kemoresistens, hvilket giver et nyt mål for kemoterapi for blærekræft

Henvisning:. Lin J, Zhang Q, Lu Y, Xue W, Xu Y, Zhu Y, et al. (2014) nedregulering af HIPK2 Øger Resistance af blærekræft Cell til cisplatin ved Regulering Wip1. PLoS ONE 9 (5): e98418. doi: 10,1371 /journal.pone.0098418

Redaktør: Thomas G. Hofmann, tysk Cancer Research Center, Tyskland

Modtaget: Januar 24, 2014 Accepteret: Maj 2, 2014 Udgivet: May 20, 2014

Copyright: © 2014 Hu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Menneskelig blærekræft er den tiende mest almindelige malignitet i. kvinder og den fjerde mest almindelige hos mænd [1], [2]. Patologiske undersøgelser viser, at blærekræft omfatter to hovedgrupper. Den mest almindelige blærekræft er urotelial carcinom (UC), der normalt dukker op, men sjældent fremskridt [3], [4]. Desuden invasiv blærekræft er mere aggressiv, og halvdelen af ​​patienter med invasiv blærekræft udvikle fjernmetastase [5], [6]. Chemoradiation er et fornuftigt alternativ til cystektomi i avanceret /metastaserende blærecancer, men modstanden mod cancer kemoterapi er et almindeligt fænomen, især i metastatisk blærekræft [7]. Imidlertid har de fremskridt i kemoterapi med henblik på blærekræft behandling været begrænset, fordi de underliggende mekanismer, der forårsager kemoresistens ikke er kendt. Afslører den molekylære mekanisme af kemoresistens er uundværlig for udvikling af effektive kemoterapeutiske midler.

homeodomæne-interagerende protein kinase-2 (HIPK2) er en serin /threonin-kinase, som er blevet vist at være involveret i tumor suppressor [8], [9], [10]. HIPK2 aktiveres som reaktion på forskellige typer af DNA-beskadigende midler, såsom cisplatin, ultraviolette og roscovitin kemoterapeutiske lægemidler [9]. HIPK2 phosphorylerer p53 til specifik aktivering af proapoptotiske target gener, herunder p53AIP1, pIG3, Bax og Noxa og bidrager til reguleringen af ​​p53-induceret apoptose [11], [12], [13]. Puca

et al

påvist, at HIPK2 er en vigtig regulator af p53 aktivitet som respons på et kemoterapeutisk lægemiddel [14]. HIPK2 udtrykkes forskelligt i følsomme versus kemoresistent celler som reaktion på forskellige kemoterapeutiske lægemidler (dvs. cisplatin og adriamycin). HIPK2 hæmning undertrykker adriamycin-induceret apoptose i kemoterapi kræftceller, mens overekspression af HIPK2 udløser apoptose i kemoterapi celler, der er forbundet med induktion af p53Ser46-target gen AIP1 [14], [15], [16]. Lazzari

et al

viste, at HIPK2 knockdown inducerer resistens over for forskellige anticancerlægemidler selv ved targetingΔNp63α i p53-nul-celler [17].

vildtype p53-induceret phosphatase 1 (Wip1) er en p53-inducerbar serin /threonin-phosphatase, som slukker DNA beskadigelse checkpoint responser ved dephosphorylering af visse proteiner, såsom p38 mitogenaktiveret proteinkinase, p53, checkpoint kinase 1 og checkpoint kinase 2 [18], [19]. Wip1 er målrettet efter HIPK2 for nedbrydning [20]. Emerging data indikerer også, at Wip1 overudtrykkes i forskellige humane tumorer, og er forbundet med kemoresistens [19]. Wang

et al

viste, at Wip1 knockdown forøger DNA-skade signalering og re-sensibiliserer orale pladecellecarcinom (SCC) celler for cisplatin [21]. Brug af xenograft tumormodeller, de påviste, at overekspression af Wip1 fremmer tumorigenese og dets inhibering forbedrer tumor respons på cisplatin [21]. Omvendt, Goloudina

et al

viste, at Wip1 overekspression sensibiliserer kolon kræftceller HCT116 (p53

– /-) til cisplatin i RUNX2-afhængig transskriptionel induktion af proapoptotiske Bax protein [22]. Imidlertid er den rolle, Wip1 i reguleringen cisplatin følsomhed for blærekræft celle ikke fuldt forstået.

På baggrund af disse resultater, vi undersøgt, om HIPK2 regulerer kemosensitivitet ved at målrette Wip1 i blærekræft celle. Her fandt vi, at opregulering af HIPK2 hæmmer Wip1 udtryk, som sensibiliserer kemoterapi blærekræft celle til cisplatin.

Materialer og metoder

cellelinjer og vævsprøver

De protokoller, der anvendes i undersøgelsen blev godkendt af hospitalets beskyttelse af personmotiver Udvalg. Blod enhederne er erhvervet med skriftligt informeret samtykke fra Beijing Friendship Hospital Tilknyttet til Capital University of Medical Sciences. I alt 31 inoperable /metastatiske patienter blærekræft blev inkluderet i undersøgelsen, og alle patienter fik cisplatin-baseret kombinationskemoterapi mellem 12/2011 og 08/2013 (median alder 62,3, interval 51-80).

Menneskelig blærekræft cellelinier med vild type p53 (RT4 og 253J) blev opnået og opretholdt som anbefalet af American type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Den cisplatin-resistente sublinie RT4-resistens (RT4-CisR) blev oprettet ved vedvarende udsættelse for stigende koncentrationer af cisplatin over en periode på 12 måneder, som tidligere rapporteret [23].

Real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler eller væv under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), og revers transkription (RT) reaktioner blev udført ifølge producentens protokol. Real-time PCR blev udført under anvendelse af en standardprotokol fra SYBR Green PCR-kittet (Toyobo, Osaka, Japan). p-actin blev anvendt som referencer for mRNA’er. ACt-værdier blev normaliseret til p-actin niveauer. De 2

-ΔΔCt fremgangsmåde blev anvendt til bestemmelse af den relative kvantificering af genekspressionsniveauer. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer.

Western blot-analyse

Western blot-analyse for at vurdere HIPK2 blev Wip1 og β-actin-ekspression udført som tidligere beskrevet [24]. HIPK2 (ab28507) og Wip1 (ab72000) primære antistoffer blev anskaffet fra Abcam (Cambridge, MA, USA). P-actin primære antistoffer blev anskaffet fra Sigma (MO, USA).

Cellelevedygtighed assay

Celler blev udpladet og dyrket i 96-brønds plade i 0,1 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium indeholdende 10 % (volumen /volumen) føtalt kalveserum ved 37 ° C i 24 timer. Derefter blev mediet ændret, og 0,1 ml frisk medium indeholdende angivet lægemiddel blev tilsat, og cellerne blev inkuberet i yderligere 48 timer. Antallet af levedygtige celler blev bestemt ved anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay som beskrevet [25].

RNAi og overekspression

RNAi blev udført som tidligere beskrevet [26], [27]. De siRNAs anvendt i denne undersøgelse var blandinger af tre siRNAs og blev indkøbt fra Genepharm (Shanghai, Kina). pcDNA-HIPK2 og pcDNA-Wip1 blev konstrueret til at overekspression HIPK2 eller Wip1 ved at indføre et fragment indeholdende HIPK2 eller Wip1 forløber i pcDNA plasmid.

Statistisk analyse

Alle data er udtrykt som middelværdi ± standard afvigelse (SD) fra mindst tre separate forsøg. Forskellene mellem grupperne blev analyseret ved hjælp af Students

t

test. Forskelle blev anset statistisk signifikant på

s

. 0,05

Resultater

HIPK2 udtryk er faldet i kemo-resistente blærekræft celle

Cisplatin er i øjeblikket den mest effektive antitumormiddel mod fremskreden blærekræft. Men modstanden mod cisplatin-baseret kombinationskemoterapi er et almindeligt fænomen, især i metastatisk blærecancer. For at klarlægge de molekylære mekanismer, der ligger cisplatin modstand i blærekræft, blev i alt 31 patienter med metastaserende blærekræft inkluderet, og HIPK2 ekspressionsniveauet blev analyseret efter cisplatin-baseret kombinationskemoterapi. Figur 1A viste, at HIPK2 udtryk i patienter, som er kemo-resistente markant er faldet i forhold til kemo-sensitive patienter. Derefter etablerede vi et cisplatin-resistente sublinie fra den humane blærecancer-cellelinie RT4 (RT4-CisR), og analyseret ekspressionsniveauet af HIPK2. Som vist i figur 1B, HIPK2 mRNA-niveauer var lavere i RT4-CisR celler sammenlignet med RT4 celler. Ligeledes blev HIPK2 protein niveauer nedreguleret i RT4-CisR celler (Figur 1C). Disse data indikerer, at nedregulering af HIPK2 kan være relateret til cisplatin modstand blære cancerceller.

(A) Analysen af ​​HIPK2 ekspressionsniveauet blev udført i blodprøver med cisplatin-sensitive patienter (n = 19) og cisplatin-resistente patienter (n = 12). Totalt RNA blev ekstraheret og underkastet real-time RT-PCR for at analysere det relative niveau for HIPK2 i hver prøve. Relative ekspression blev beregnet og normaliseres med hensyn til p-actin mRNA. Alle data blev udtrykt som gange ændring i forhold til et væv (kontrol, ekspression = 1). Resultaterne blev udtrykt som Log10 (2

-ΔΔCt). *

s

0,05. (B) Den cisplatin-resistente sublinie RT4-CisR blev etableret ved kontinuerlig eksponering for stigende koncentrationer af cisplatin over en periode på 12 måneder, og HIPK2 niveauer blev analyseret ved real-time PCR. Relative HIPK2 niveauer blev beregnet med hensyn til kontrollen. *

s

0,05. (C) Western blot analyse af HIPK2 proteinniveau i RT4-CisR og RT4 celler (op). Vi viste også relativ kvantificering af HIPK2 proteinniveau (bund, n = 3). *

s

0,05

HIPK2 knockdown stiger cellelevedygtighed under cisplatin behandling i blærekræft celle

For at undersøge den rolle, HIPK2 i cisplatin modstand, separat. overekspression og ablation eksperimenter blev udført ved hjælp af enten pcDNA-HIPK2 eller HIPK2 siRNA under cisplatin behandling og levedygtighed celle blev analyseret. 2A viste, at HIPK2 ekspressionsniveauer var nedsat i RT4 celler behandlet med HIPK2-siRNA. Derefter RT4 celle blev inkuberet med forskellige koncentrationer af cisplatin (0, 1, 2, 3, 4, 5 og 6 uM) i 48 timer. Som vist i figur 2B, HIPK2 inhibering markant øger RT4 cellelevedygtighed sammenlignet med negativ kontrol (N.C.). Forventeligt, knockdown af HIPK2 øger RT4 cellelevedygtighed efter cisplatin behandling i tidsafhængig måde (Figur 2C). I RT4-CisR celler, cisplatin behandling resulterede i en beskeden hæmning af cellernes levedygtighed, mens overekspression af HIPK2 re-sensibiliserede RT4-CisR celler til cisplatin (figur 2D og E). Tilsvarende blev HIPK2 ekspression inhiberes i 253J celler efter HIPK2-siRNA behandling (fig S1), og HIPK2 hæmning forøger 253J cellelevedygtighed i tidsafhængig måde (Figur 2F). Disse data antyder, at HIPK2 øger cisplatin følsomhed blære cancerceller.

(A) RT4 celler blev transficeret med HIPK2-siRNA’er og HIPK2 ekspressionsniveauet blev analyseret ved real-time PCR. N.C. = negativ kontrol (krypteret) siRNA. (B) RT4 celler blev behandlet med HIPK2-siRNAs, og cellelevedygtighed blev analyseret ved anvendelse af MTT efter cisplatin behandling (1 til 6 uM). Resultaterne viser data fra seks uafhængige forsøg, udtrykkes som gennemsnit ± SD. *

s

0,05. (C) RT4 celler blev behandlet med HIPK2-siRNAs, og i de angivne tidspunkter, blev cellelevedygtighed undersøgt ved hjælp af MTT efter cisplatin behandling (6 uM). Resultaterne viser data fra seks uafhængige forsøg, udtrykkes som gennemsnit ± SD. *

s

0,05. (D) RT4-CisR celler blev transficeret med pcDNA-HIPK2 og HIPK2 ekspressionsniveauet blev analyseret ved real-time PCR. (E) HIPK2 blev overudtrykt i RT4-CisR celler, og cellelevedygtighed blev analyseret ved anvendelse af MTT efter cisplatin behandling (1 til 6 uM). Resultaterne viser data fra seks uafhængige forsøg, udtrykkes som gennemsnit ± SD. *

s

0,05. (F) 253J-celler blev behandlet med HIPK2-siRNAs, og cellelevedygtighed blev analyseret ved anvendelse af MTT efter cisplatin behandling (6 uM). *

s

. 0,05

HIPK2 regulerer Wip1 udtryk negativt

Tidligere undersøgelser har vist, at HIPK2 regulerer tumor progression og resistens via flere potentielle target gener, såsom som Bax, p53AIP1, Noxa osv [14]. HIPK2 spiller også en afgørende rolle i iværksættelsen af ​​dobbelt-strenget pause reparation signalering ved at kontrollere Wip1 niveauer som reaktion på ioniserende stråling [20]. Nylige undersøgelser viser, at Wip1 overudtrykkes i forskellige humane tumorer, og er forbundet med kemoresistens [19]. Men lidt om, hvorvidt HIPK2 regulerer cisplatin modstand ved at målrette Wip1. Vi først analyseret ekspressionsniveauet af Wip1 i RT4 og RT4-CisR celler. Figur 3A og B viste, at Wip1 mRNA og protein niveauer signifikant blev opreguleret i RT4-CisR sammenlignet med RT4 celle. Vi derefter analyseret, om HIPK2 negativt regulerer Wip1 ekspression. HIPK2 knockdown forøgede Wip1 ekspressionsniveauerne i blære cancer cellelinjer (figur 4A), mens HIPK2 overekspression bemærkelsesværdigt hæmmede Wip1 mRNA-niveau i blære kræft cellelinjer (figur 4B). Western blot analyse viste, at HIPK2 knockdown øger Wip1 proteinniveau (figur 4C).

In vivo

, er en signifikant negativ korrelation også observeret mellem HIPK2 niveauer og de Wip1 niveauer hos patienter med blærekræft efter cisplatin-baseret kombinationskemoterapi (

r

2 = 0,1507,

s

= 0,0063, Figur 4D). Disse data viste, at nedregulering af HIPK2 resulterer i en forøgelse af Wip1 ekspression.

(A og B) Wip1 mRNA og protein ekspressionsniveauer blev analyseret i RT4 og RT4-CisR celler. *

s

. 0,05

(A) Wip1 mRNA-niveauer blev evalueret ved realtids-PCR efter HIPK2 hæmning i RT4 celler og 253J celler. *

s

0,05. (B) Relativ Wip1 mRNA niveau efter HIPK2 overekspression i RT4 celler og 253J celler. *

s

0,05. (C) Western blot analyse af Wip1 niveau efter HIPK2 hæmning i RT4 og 253J celler. (D) negativ sammenhæng mellem HIPK2 niveauer og de Wip1 niveauer i 18 patienter med blærekræft efter cisplatin-baseret kombinationskemoterapi (

r

2 = 0,1507,

s

= 0,0063) . Relativ Wip1 eller HIPK2 ekspression blev beregnet og normaliseres med hensyn til p-actin mRNA. Alle data blev udtrykt som fold ændring i forhold til et væv (kontrol, udtryk = 1).

HIPK2 overekspression sensibiliserer kemoterapi blærekræft celle til cisplatin ved at regulere Wip1 udtryk

Vi næste undersøgt rolle Wip1 i reguleringen cellelevedygtighed under cisplatin behandling. Figur 5A viste, at Wip1 overekspression forøget cellelevedygtighed i RT4 celler under cisplatin behandling. HIPK2 hæmmer Wip1 udtryk og nedsætter cisplatin modstand, og der ses en signifikant negativ korrelation mellem HIPK2 og Wip1. Vi spekulerede derfor, at den rolle HIPK2 i regulering cisplatin resistens medieres af Wip1. Figur 5B viste, at HIPK2 hæmning markant øger RT4 cellelevedygtighed sammenlignet med N.C., mens Wip1 hæmning i HIPK2-nedregulering celler dels reducerer cellernes levedygtighed. Tilsvarende Wip1 inhibering i HIPK2-nedregulering celler reducerer dels 253J cellelevedygtighed (figur 5C). Vigtigere, er cellelevedygtigheden faldet med HIPK2 overekspression, hvorimod Wip1 overekspression øget HIPK2-overudtrykkende celle levedygtighed (figur 5D). Disse data bekræfter, at HIPK2 overekspression sensibiliserer kemoterapi blærekræft celle til cisplatin ved at regulere Wip1 udtryk.

(A) Wip1 blev overudtrykt i RT4 celler, og cellernes levedygtighed blev analyseret ved hjælp af MTT efter cisplatin behandling (6 uM). Resultaterne viser data fra seks uafhængige forsøg, udtrykkes som gennemsnit ± SD. *

s

0,05. (B og C) RT4 og 253J celler blev behandlet med HIPK2-siRNA eller HIPK2-siRNA plus Wip1-siRNA og via de angivne tidspunkter, blev cellelevedygtighed undersøgt ved hjælp af MTT efter cisplatin behandling (6 uM). (D) HIPK2 eller HIPK2 plus Wip1 blev overudtrykt i RT4-CisR celler, og cellelevedygtighed blev analyseret ved anvendelse af MTT efter cisplatin behandling (6 uM). *

s

. 0,05

Diskussion

Menneskelig blærekræft er en af ​​de mest dødelige kræftformer over hele verden, og forekomsten er stigende i mange lande. Udover kirurgiske behandlinger, systematisk kemoterapi, spiller en vigtig rolle i blærekræft behandling, især for patienter med fremskreden og metastatisk blærekræft [28], [29]. Trods en hurtig krympning i tumormasse efter kemoterapeutiske cykler, den kemoresistens af cancerceller ofte resulterer i den efterfølgende gentagelse og metastase af cancer [30], [31]. I betragtning af den dårlig prognose for patienter med blærekræft, primært på grund af sen diagnose og lav respons på kemoterapi, vi har forsøgt at identificere prædiktive markører af terapeutisk respons og molekylære mål for at øge følsomheden over for behandling.

Vores undersøgelser giver et rationale til den potentielle anvendelse af HIPK2 transduktion at sensibilisere kemoresistent blære cancerceller for cisplatin. Vi viste, at HIPK2 ekspressionsniveauerne er signifikant nedreguleret i cisplatin-resistente RT4 celle (RT4-CisR) i forhold til RT4 celle. Nedregulering af HIPK2 forøger cisplatin modstand på en dosis- og tidsafhængig måde i RT4 celle, hvorimod tvungen ekspression af HIPK2 reducerer cellelevedygtigheden under cisplatin behandling. Desuden overekspression af HIPK2 delvist overvinder cisplatin-resistens i RT4-CisR celle. Tidligere undersøgelser har vist, at HIPK2 aktiveres som reaktion på forskellige typer af DNA-beskadigende midler, såsom cisplatin, ultraviolette og roscovitin kemoterapeutiske lægemidler [14], [32], og er en vigtig regulator af p53 aktivitet som respons på et kemoterapeutisk lægemiddel [ ,,,0],11], [14]. Overekspression af HIPK2 i p53 vildtype re-sensibiliserer kemoterapi ovariecancerceller til kemoterapi ved at mediere p53 phosphorylering. Imidlertid er den molekylære mekanisme HIPK2 i regulering kemoresistens af cancercelle ikke fuldt klarlagt.

Wip1 er en p53-inducerbar serin /threonin-phosphatase, som slukker DNA damage checkpoint responser ved dephosphorylering af visse proteiner involveret i DNA reparation og cellecyklus checkpoint [19]. Den Wip1 genet amplificeres i mange tumortyper [33]. Song

et al

viste, at Wip1 interagerer med og dephosphorylerer BAX at undertrykke BAX-medieret apoptose som respons på y-bestråling i prostatacancerceller [19]. Stråling-resistente LNCaP-celler viste dramatiske stigninger i Wip1 niveauer og nedsat BAX bevægelse til mitokondrier efter c-bestråling, og disse effekter blev tilbageført ved en Wip1 inhibitor [19]. Wang

et al

viste, at Wip1 er et effektivt lægemiddel mål for forbedret kræftbehandling [21]. Wip1 hæmning forøger DNA-skade signalering og resensitizes orale SCC-celler til cisplatin. Wip1 opregulering fremmer tumorigenese og dens inhbition forbedrer tumor respons på cisplatin. I overensstemmelse med ovennævnte resultater, fandt vi, at ekspressionsniveauet af Wip1 opreguleres i RT4-CisR celle sammenlignet med RT4 celle, og Wip1 overekspression øger cellernes levedygtighed under cisplatin behandling i RT4 celler. Vigtigere, viste vi, at HIPK2 negativt regulerer Wip1 udtryk i blærekræft celle. HIPK2 og Wip1 udtryk også negativt korreleret efter cisplatin-baseret kombinationskemoterapi

in vivo

. Tvunget udtryk for HIPK2 sensibiliserer kemoterapi blærekræft celle til cisplatin ved at regulere Wip1 udtryk. Konklusion: Disse data viste, at HIPK2 /Wip1 signalering repræsenterer en ny vej regulerer kemoresistens. Således er denne undersøgelse viser, at HIPK2 /Wip1 er et effektivt lægemiddel mål for forbedret kræftbehandling.

Støtte Information

Figur S1.

HIPK2 ekspressionsniveauet blev analyseret ved realtids-PCR i 253J-celler. N.C. = negativ kontrol (krypteret) siRNA. *

s

0,05

doi:. 10,1371 /journal.pone.0098418.s001

(TIF)