PLoS ONE: Ekspression af gliom-associerede Oncogene Homolog 1 (Gli1) i Advanced serøs Kræft i æggestokkene er associeret med Unfavorable Samlet overlevelse

Abstrakt

Nye beviser forbinder afvigende aktivering af Hedgehog (Hh) signalering med patogenesen af ​​flere kræftformer, herunder medulloblastom, glioblastom, melanom samt bugspytkirtlen, colorectal, og prostata carcinomer. Her undersøgte vi rollen af ​​transkriptionsfaktoren Gli1 i ovariecancer. Til dette formål blev udtrykket profil Gli1 undersøgt i normale æggestokke, tumorer i æggestokkene, og æggestokkene kræft cellelinjer, og

in vitro

effekter af en bestemt Hh-pathway blocker, Kaad-cyclopamin, eller en specifik Gli1 inhibitor (GANT58) på celleproliferation og på Hh målgenekspression blev også vurderet. Resultater opnået viste, at epitelceller i ovariecancer væv udtrykker signifikant højere niveauer af nukleare Gli1 end i normalt ovarievæv, hvor proteinet var næsten upåviselig. Desuden viste multivariat analyse, at nuklear Gli1 uafhængigt associeret til dårlig overlevelse i avancerede serøse ovariecancerpatienter (HR = 2,2, 95% CI 1,0-5,1, p = 0,04).

In vitro

forsøg viste Gli1 udtryk i de tre æggestokkene karcinom celle testet, A2780, SKOV-3 og OVCAR-3 linjer. Bemærkelsesværdigt, selvom Kaad-cyclopamin førte til nedsat celleproliferation, denne behandling hæmmede ikke hedgehog målgenekspression i nogen af ​​de tre ovarian cancer cellelinjer, hvilket tyder på, at inhiberingen af ​​celleproliferation var en ikke-specifik eller toksisk virkning. I overensstemmelse med disse data, blev der ikke observeret forskelle på celleproliferation når cellelinjer blev behandlet med GANT58. Samlet set støtter vores kliniske data rolle Gli1 som prognostisk markør i avanceret serøs æggestokkræft og som et muligt terapeutisk mål i denne sygdom. Men vores

in vitro

resultater henlede opmærksomheden på behovet for udvælgelse af egnede forsøgsmodeller, der præcist repræsenterer menneskelig tumor til afprøvning af fremtidige behandlinger involverer Hh pathway hæmmere

Henvisning:. Ciucci A, De Stefano I, Vellone VG, Lisi L, Bottoni C, Scambia G, et al. (2013) Ekspression af gliom-associerede Oncogene Homolog 1 (Gli1) i Advanced serøs Kræft i æggestokkene er associeret med Unfavorable Samlet overlevelse. PLoS ONE 8 (3): e60145. doi: 10,1371 /journal.pone.0060145

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: November 7, 2012; Accepteret: 22 Februar 2013; Udgivet: 28 Mar 2013

Copyright: © 2013 Ciucci et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitelovariecancer er en af ​​de førende årsager til. død hos kvindelige maligniteter i langt de fleste udviklede lande [1]. Faktisk da denne sygdom har få symptomer på tidligere stadier af dets udvikling, de fleste kvinder er diagnosticeret efter den primære tumor allerede har spredt; på trods af den første reaktion på kirurgisk debulking og den første linje behandling med carboplatin og paclitaxel, de fleste tumorer i sidste ende udvikle resistens og 5-års overlevelsen er generelt under 30 [2]%. Selv om der er gjort en stor indsats for at afklare ætiologien af ​​æggestokkene carcinogenese og de molekylære mekanismer, der er involveret i spredning af ovariecancer celler, forbliver denne sygdom blandt mindre forstået store menneskelige maligniteter.

Sonic pindsvin (Shh) signal -transduction pathway er vigtig i reguleringen mønsterdannelse, proliferation, overlevelse og vækst af mange celler og væv, i embryoet og voksne. Binding af sekretoriske Hh-ligander (Sonic, indisk, eller Desert, SHH, IHH eller DHH) til deres transmembrane receptor Patched (Ptch1) indleder den klassiske Hh signalvejen ved at frigive Smoothened (Smo) fra Ptch1-afhængige undertrykkelse. Smo modulerer en cytoplasmatisk kompleks indeholdende Suppressor af smeltet (Sufu), dermed aktivere de 3 gliom-associerede (Gli) transkriptionelle regulatorer. Gli1 inducerer og GLI3 undertrykker Hh målgener, der omfatter

Gli1

,

PTCH1

,

cyclin D1

,

c-myc

, og

Bcl -2

, hvorimod Gli2 kan fungere i enten en positiv eller negativ måde afhængigt posttranskriptionel og posttranslationelle processeringsbegivenheder [3].

Aberrant aktivering af Hh-signalering har været impliceret i flere kræftformer, herunder hud, hjerne , colon, lunger, prostata, blod og pancreas blandt andre, drevet enten af ​​en ligand afhængig eller en ligand-uafhængige vej [4], [5]. Ligand afhængig Hh vej kan enten være autokrin, hvor Hh ligand produceret af tumorceller handle på tilstødende tumorceller forårsager celle-autonom-aktivering, eller kan involvere en parakrin mekanisme, hvor Hh ligand udskilles fra epitel signalerer underliggende stromale rum til at skabe en gunstig mikromiljø, som understøtter tumorvækst. Autokrin signalering ses i tilfælde af lungekræft og prostatakræft, mens parakrin mekanisme i tilfælde af æggestokkene og tyktarmskræft synes udbredt [4], [5]. I ligand-uafhængig signalering bliver HH pathway aktiveres i en celle-intrinsisk måde gennem tab-af-funktion-mutationer i negativt virkende komponenter, såsom Ptch1 og Sufu, eller gennem gain-of-funktion mutationer i positive virkende komponenter såsom Smo [4]. Desuden er Hh-Gli signalering interagerer med andre signalveje i tovejs og kontekst-specifikke måder, og flere linjer af beviser tyder på, at kontekstafhængig regulering af Gli kode ved onkogener og tumor undertrykkere udgør grundlaget for den udbredte inddragelse af Gli1 i humane kræftformer, dette protein understøtter tumor progression og metastatisk overgang [6], [7]. Bemærkelsesværdigt, i ovariecancer, HH-vejen kan også interagere med østrogen signalering i et komplekst netværk modulere fænotypisk plasticitet [8].

I den foreliggende undersøgelse forsøgte vi at bestemme, om Hh pathway aktiveres i æggestokkene kræft. Til dette formål vi først undersøgt immunhistokemisk ekspression af Gli1 protein i normal æggestokkene overflade epitel og i fremskredne serøse æggestokkene kræftformer og korreleret sit udtryk med klinisk-patologiske parametre og patientresultater. Dernæst undersøgte vi udtryk for Gli1 i æggestokkene kræftcellelinjer, og

in vitro

effekter af en bestemt hedghehog vej blocker, Kaad-cyclopamin [9], [10] eller en specifik Gli1 inhibitor, GANT58 [ ,,,0],11], på celleproliferation og på hedgehog målgenekspression. Gli1 er faktisk betragtes som den ultimative og dermed afgørende transkriptionel aktivator af Hh vej; dens transkription induceres af Hh-signalering, hvilket gør det, så langt den bedste pålidelig markør for en aktiv vej, konsekvent transkriberet i Hh-responderende celler [7]. Desuden Gli1 har været betragtet som et passende mål for kræftbehandling, fordi det er nedstrøms af flere signalveje [12].

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse opnået godkendelse fra Etisk Komité katolske universitet i Sacred Heart, Rom, Italien og patienter gav skriftligt samtykke til væv indsamling og analyser.

patienter

undersøgelsen omfattede 56 patienter med fremskreden serøs æggestokkræft optaget på Gynækologisk onkologi Unit, katolske universitet i Rom mellem marts 2000 og december 2008. makroskopisk og histopatologisk normale æggestokke, fjernes til profylaktiske årsager, blev også opnået fra 12 postmenopausale kvinder. Klinisk-patologiske karakteristika samlede serier er opsummeret i tabel 1. Ifølge standard retningslinier, blev forsøgt maksimal kirurgisk indsats hos alle patienter, hvilket resulterer i fuldstændig resektion (residual tumor 0 mm) i 35 (63%) tilfælde. Alle patienter fik platinbaseret kemoterapi (75-100 mg /m

2 for cisplatin, AUC = 5 for carboplatin, per cyklus). Halvtreds patienter (89,3%) modtog også paclitaxel (135-175 mg /m

2 for hver cyklus). Gentagelse af sygdommen blev defineret i henhold til GCIG CA125 kriterier [13], [14] og /eller radiologisk bekræftelse af tumor progression. For at definere kemosensitivitet, brugte vi den fælles definition af platin modstand, definerer som “følsomme” patienter, der tilbagefald 6 måneder eller mere efter forudgående platin-indeholdende kemoterapi og som “resistente” patienter, der tilbagefald mindre end 6 måneder efter kemoterapi blev stoppet, eller der skred under behandlingen [15]. Opfølgende data var tilgængelige for alle 56 patienter (median opfølgning, 35 måneder rækkevidde, 9-127 måneder). Under opfølgningsperioden blev progression og død sygdom observeret i 42 og 23 patienter.

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført som tidligere beskrevet [16]. Kort fortalt blev antigen hentning procedure udføres af mikrobølgeovn opvarmning i citratbuffer (pH = 6). Snit blev inkuberet med 20% normalt gedeserum i 30 minutter ved stuetemperatur for at reducere ikke-specifik binding. Celler, der udtrykker Gli1 (klon H-300, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, fortynding 1:50), blev identificeret efter inkubation natten over ved 4 ° C. Antistof, der anvendes i den foreliggende undersøgelse blev testet for specificitet som beskrevet tidligere [17] – [20]. Snit blev inkuberet med det sekundære antistof (gede-anti-kanin) i 30 min, ved stuetemperatur. Objektglassene blev fremkaldt med diaminobenzidin (DAB-substrat System, DakoCytomation), modfarvet med Mayers Hæmatoxylin, dehydreret i ethanol og xylen, og endelig monteret. Basalcellekarcinom blev anvendt som en positiv kontrol. Farvning uden primært antistof blev anvendt som en negativ kontrol.

Evaluering af immunhistokemisk farvning

Ekspression blev evalueret ved at betragte den procentdel af celler, der udviser immunreaktion i et minimum af 500 histologisk identificerede neoplastiske celler. Gli1 farvning blev observeret både i cytoplasmaet og i kernen i ovariekarcinomceller. Men som Gli1 er en transkriptionsfaktor, blev kun Gli1 ekspression nukleare scoret til efterfølgende dataanalyser og korrelationsundersøgelser. Immunfarvning blev bedømt ved to uafhængige observatører (GFZ og VGV), der var uvidende om patienternes diagnose. For at definere en cut-off værdi for Gli1, vi sammenlignet nukleare immunoreaktivitet målt i normal versus tumorvæv. Immunoreaktivitet var fraværende i epitelceller alle undtagen én normale ovarier, med et enkelt eksemplar viser en svag farvning reaktion i omkring 10% af celler. Tumor sektioner, hvor 10% af cellerne blev farvet blev således overveje at være positiv

Cell Kultur

ovariecancer cellelinjer A2780, SKOV-3 og OVCAR-3 blev købt fra. European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, UK). OVCAR-3 og A2780 celler blev dyrket i RPMI 1640 medium (Lonza, Basel, Schweiz), blev SKOV-3 dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Lonza). Mediet blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Lonza), 2 mM glutamin og antibiotika (100 mg /ml streptomycin og 100 IU /ml penicillin) (Lonza). Alle kulturer blev holdt ved 37 ° C under en fugtig atmosfære af 5% CO2 og 95% luft.

Immuncytokemi

Celler (2,0 til 4,0 × 10

4 celler /brønd) blev udpladet i to brønde kammer slide (Nunc® Lab-Tek® II Chamber slide, Nunc, Inc., Naperville, IL). Cellerne blev dyrket i 24 timer og anvendes til immunfarvning. Objektglas blev vasket to gange med PBS, fikseret med 4% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,5% Triton X-100. Den endogene peroxidase blev blokeret med 3% H

2O

2 i 5 min. Efter vask to gange med PBS blev cellerne inkuberet med en blokeringsopløsning indeholdende 20% normalt hesteserum i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. Overskydende blokeringsopløsning blev drænet, og prøver blev inkuberet med en 1:50 fortynding af anti-Gli1 antistof (klon H-300, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology) natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. Prøverne blev derefter skyllet tre gange med PBS og inkuberet med sekundært antistof, EnVision System-HRP (Dako, Carpinteria, CA) i 30 minutter ved stuetemperatur. Immunoreaktiviteten blev påvist under anvendelse af 3,3′-diaminobenzidin-substrat (DAB-substrat System, Dako). Objektglassene blev modfarvet med Mayers hæmatoxylin, dehydreret i ethanol og xylen, og endelig monteret.

proliferationsassav

A2780 (3,0 × 10

4 per brønd), OVCAR-3 (2,0 × 10

4 per brønd) og SKOV-3 (2,0 x 10

4 per brønd) celler blev podet i plader med 24 brønde i komplet dyrkningsmedium. Efter inkubation natten over blev mediet ændret til 2% FBS indeholdende forskellige koncentrationer af Kaad-cyclopamin (Santa Cruz Biotechnology), eller GANT58 (Calbiochem, San Diego, CA). Stoffer blev opløst i absolut DMSO og fortyndes i passende dyrkningsmedium umiddelbart før brug. Kontrolceller modtog den samme mængde DMSO fortyndingsmiddel. Efter 48 timers inkubation blev cellerne høstet ved trypsinering, og levedygtige celler blev talt under anvendelse Nucleocounter (ChemoMetec, Allerød, Danmark). Alle forsøg blev udført mindst tre gange in duplo.

MTT assay

Alle æggestokkene cancercellelinier blev podet (4,0 × 10

3 pr brønd) i plader med 96 brønde i komplet dyrkningsmedium. Efter inkubation natten over blev mediet ændret til 2% FBS indeholdende forskellige koncentrationer af Kaad-cyclopamin (Santa Cruz Biotechnology) eller GANT58 (Calbiochem). Cytotoksicitet blev kvantificeret ved måling af reduktionen af ​​MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid, en tetrazol) for at fremstille et mørkeblåt formazanprodukt. MTT blev tilsat til hver brønd 48 timer efter begyndelsen af ​​den fornærmelse. Efter 3 timer inkubation blev Solubilisering /Stop Solution tilsat til dyrkningsbrøndene for at opløse formazan produkt, og absorbansen ved 570 nm registreres ved anvendelse af en 96-brønds plade-læser (Victor 1420, Wallac, Perkin Elmer). Alle forsøg blev udført mindst tre gange in duplo.

Western blot-analyse

helcelle ekstrakter blev fremstillet efter lysis i buffer indeholdende 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 0,2 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 10% glycerol tilsat phosphat og proteasehæmmere. Lige store mængder protein (50 ug /prøve) blev separeret ved SDS-gradient polyacrylamidgelelektroforese (4-20%) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), overført på PVDF-membraner (Immobilon-P overførselsmembran, Millipore, Billerica, MA). Membranerne blev blokeret i 1 time med 5% (w /v) fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween 20 (TBST) og inkuberet med primære antistoffer (Gli1: H300, Santa Cruz Biotechnology; p-actin: A5441, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i TBST med 3% fedtfri tørmælk, ved 4 ° C natten over. Efter vask tre gange med TBST blev membranerne mærket med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Specifikke proteiner blev visualiseret med ECL Western blotting ifølge producentens anvisninger (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). β-actin Western blot-analyse blev udført som en kontrol af samme prøve lastning.

mRNA Analyse i Real Time PCR

Samlet RNA blev ekstraheret ved hjælp af Total RNA isolering NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel GmbH annealing og forlængelse ved 60 ° C i 20 s; ved hjælp af Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, USA). PCR reaktioner blev udført i et 20 pi reaktionsvolumen i en MX3000P real time PCR maskine (Stratagene). PCR primere til påvisning af specifikke transkripter var som følger: Gli1, 5′-GCCAGCCAAGAGAGACCAACAG-3 ‘og 5′-CCGACAGAGGTGAGATGGACAG-3′; β-actin-5’-ACG TTG CTA TCC AGG CTG TCC AT-3 ‘og 5′-TTA ATG TCA CGC ACG ATT TCC CGC-3’. Relative mRNA koncentrationer blev beregnet ud fra take-off punkt af reaktioner (tærskelcyklus, CT) ved anvendelse af sammenlignende kvantificering metode udført af Stratagene software og baseret på -ΔΔCt metode. Denne analyse tilnærmer en given prøve mål mRNA (Gli1) niveau i forhold til gennemsnittet af de mål mRNA-niveauer i ubehandlede kontroller ( “kalibrator” værdi), hvilket tillader statistisk analyse af afvigelse fra middelværdien selv blandt kontrollerne. Ct-værdier for β-actin-ekspression tjente som en normaliserende signal. I hvert assay blev PCR effektivitet også beregnet under anvendelse af seriel fortynding af en eksperimentel prøve; effektivitet værdier mellem 80 og 100% blev fundet for hver primer sæt og tages i betragtning for den sammenlignende kvantificering analyse.

Statistisk analyse

udtryk for Gli1 og dens association til klinisk-patologiske parametre blev evalueret ved hjælp af Mann-Whitney ikke-parametrisk test. Sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelse blev beregnet fra datoen for diagnosen til datoen for progression /død, eller den dato sidst set. Den prognostiske virkning af de forskellige parametre på kliniske resultater (dvs. tilbagefald eller død af sygdom) blev testet ved at afbilde overlevelseskurverne ifølge Kaplan-Meier-metoden, og sammenligning af grupper ved hjælp af log rank test, samt ved multivariabel analyse under anvendelse af Cox-modellen . Kaplan-Meier-overlevelse estimater blev genereret fra datoen for histologisk diagnose til tidspunktet for den sidste opfølgning eller død. I univariat analyse blev hver parameter kategoriseret til efterfølgende statistiske analyser. Kun variable med p-værdi ≤0.2 i univariate analyser indgik i multivariat model. Resultater opnået i

in vitro Salg eksperimenter blev udtrykt som middelværdi ± SD og blev analyseret ved to-halet t-test. Forskelle blev betragtet som signifikante, hvis p ≤ 0,05. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism5 Software (San Diego, CA, USA). Cox-analyse blev udført ved hjælp af StatPlus 2009.

Resultater

Gli1 Expression i Advanced Serøse ovariecancer

I alt 56 primære avancerede serøse ovariecancer og 12 normale ovarie væv fra postmenopausale kvinder blev evalueret. Gli1 immunoreaktivitet var fraværende i overfladen epitel, såvel som i stromaceller, af de normale ovarier (fig. 1A) i et enkelt tilfælde, denne sidste viser en svag kernefarvning i omkring 10% af celler. En positiv kernereaktion blev observeret hos 29% af de serøse carcinomer (figur 1B.); cytoplasmatisk immunoreaktivitet blev også observeret i de fleste prøver undersøgt. Disse resultater indikerer, at Hh signalvej aktiveres i ovariekarcinomceller sammenlignet med normale epitelceller.

Repræsentative billeder for Gli1 immunfarvning viser ekspression i normalt ovarie epitel (A), og høj (B) eller lav (C ) udtryk i kræft i æggestokkene væv. Basalcellekarcinom blev anvendt som positiv kontrol (D). Forstørrelse 20x, og 40x. (E) Kaplan-Meier overlevelse kurve for sandsynligheden for sygdomsfri overlevelse og (F) samlet overlevelse efter ekspression af nukleare Gli1 i avancerede serøse æggestokkene kræftpatienter. Positiv ( 10%) Gli1 udtryk i kernen er signifikant associeret med samlede overlevelse ulempe (p = 0,04)

Tabel 2 viser median nukleare immunoreaktivitet af Gli1 i avancerede serøse æggestokkene kræftpatienter efter. klinisk-patologiske parametre. Ingen korrelation blev demonstreret mellem nuklear Gli1 udtryk og nogen af ​​de undersøgte parametre.

prognostiske rolle Gli1 udtryk for både DFS og OS blev testet i univariate og multivariate analyser korrigeret for klinisk-patologiske parametre. Univariate model af DFS ikke afsløre nogen sammenhæng mellem Gli1 udtryk og klinisk resultat (tabel 3, fig. 1E). På den anden side, ved hjælp af Kaplan-Meier-analyse fandt vi, at patienter med positiv Gli1 ekspression havde en ugunstig samlet overlevelse prognose; den mediane samlede overlevelse i denne population var på 35 måneder, mens den forblev udefineret for negative-Gli1 patienter, som mere end 50% af dem stadig var i live på tidspunktet for analyse (P = 0,04) (tabel 4, figur 1F). Især i den flerdimensionale model, Gli1 nukleare udtryk bevaret en selvstændig negativ prognostisk rolle til OS (p = 0,04, tabel 4).

Klassiske prognostiske faktorer i Advance serøs ovariecancer

Den prognostiske rolle alder ved diagnose, histologisk klasse, residual tumor, og kemosensitivitet for både DFS og OS blev testet i univariate og multivariate analyser (tabel 3 og 4). Tilstedeværelsen af ​​enhver resterende tumor ved primær operation ( 0 mm) [21] og platin-modstand viste sig at være forbundet med en højere risiko for fornyet sygdom, i både univariate (p = 0,003 og p 0,0001 henholdsvis) , og multivariate analyser (p = 0,003 og p 0,0001, henholdsvis). Platin-modstand viste sig også at være en ugunstig uafhængig prognostisk variabel til OS (p = 0,002).

Gli1 udtrykkes i æggestokkene karcinom Celler

For at undersøge en formodet rolle for Gli1 i kræft i æggestokkene , vi først bestemt protein niveau i tre humane ovarie karcinom cellelinjer A2780, SKOV-3 og OVCAR-3. Immuncytokemisk analyse viste Gli1 nuklear farvning i de tre cellelinier (fig. 2A). Proteinekspression blev dernæst bekræftet ved Western blot analyse under anvendelse af et kommercielt antistof rejst mod aminosyrerne 781-1080 af Gli1 af human oprindelse (figur 2A). Antistoffet anerkendte forskellige former, som var næsten synlige i alle cellelinjer: 130 kDa isoform sandsynligvis fungerer som aktivator, den svage repressor 100 KDa [22], og yderligere 70 kDa band endnu ikke identificeret, men også rapporteret i malignt pleura mesotheliom celle kulturer [23].

(A) Tre humane ovarie carcinom-cellelinier, A2780, SKOV-3, og OVCAR-3 blev underkastet immunfarvning med antistof mod Gli1. Alle tre cellelinier udtrykker Gli1. Proteinekspression blev også bekræftet ved Western blot analyse. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B) Celler blev dyrket i 2% FBS-medium og behandlet med 2, 5 og 10 uM Kaad-cyclopamin (K) eller GANT58 i 48 timer. Kaad-cyclopaminbehandling inhiberer celleproliferation i alle tre cellelinier henviser GANT58 ikke påvirker cellevækst. Vist er celleantal udtrykt som procentdel af DMSO-behandlede celler (gennemsnit ± SD fra tre forskellige forsøg; * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, t-test). (C) Gli1 mRNA-ekspression blev vurderet ved Q-PCR-analyse i ovariecancerceller behandlet med 10 pM Kaad-cyclopamin i 48 timer. Data er udtrykt som gange ændring vs. hver respektiv Kontrol (CTRL), taget som kalibrator for sammenlignende kvantificering analyse af mRNA-niveauer. Hver prøve blev målt i tre eksemplarer, blev eksperimentet gentaget 2 gange med tilsvarende resultater. Grafik viser middelværdi ± SD.

Behandling med Kaad-cyclopamin Hæmmer Cell Proliferation af ovariecarcinomer Cells

For at undersøge, om den aktiverede Hh vej er afgørende for udbredelsen af ​​ovariecancer celler, A2780, SKOV-3 og OVCAR-3 blev udsat for stigende koncentration af Kaad-cyclopamin, en forbindelse i stand til at inhibere både Hh ligand-afhængige og uafhængige vej aktivering, gennem direkte vekselvirkning med Smo. Direkte tælling af levedygtige celler viste, at Kaad-cyclopamin inducerede en dosisafhængig reduktion af ovarietumor celleproliferation (Fig 2B). Vurdering af cellelevedygtighed ved MTT-assay bekræftede den inhiberende virkning af Kaad-cyclopamin på A2780 cellevækst, hvorimod der ikke blev observeret nogen inhibitorisk virkning for SKOV-3 og OVCAR-3 celler (fig. S1). En over- eller undervurdering af MTT resultater, hvis forhold til celletal resultater er allerede blevet rapporteret af flere Forfattere, idet de store medvirkende faktorer til denne uoverensstemmelse repræsenteret ved forskelle i cellestørrelse, cellemorfologi, cellevækst (klynge eller monolag) eller mitokondrie-aktivitet [24] – [26]

Effekt af Kaad-cyclopamin på Hh Signaling

for at bekræfte, at reduktionen af ​​celleproliferation

in vitro

af Kaad-cyclopamin. skyldtes specifik inhibering af Hh-vejen, analyserede vi ændringen i mRNA og protein Gli1 niveauer i lægemiddelbehandlede ovariecarcinom cellelinier. Q-PCR-analyse viste, at behandling af A2780, SKOV-3 og OVCAR-3 med 10 uM Kaad-cyclopamin ikke signifikant modulerer Gli1 niveauer efter 48 timers eksponering (fig. 2C). Manglen på en effekt af Kaad-cyclopamin på Hh-signalering aktivitet blev yderligere bekræftet ved immunoblotting (data ikke vist). Disse data tyder på, at hæmning af kræft i æggestokkene spredning

in vitro

af Kaad-cyclopamin er ikke en Smo-medieret begivenhed.

Behandling med GANT58 hæmmer ikke Cell Proliferation af ovariecarcinomer Cells

for at bekræfte den manglende effekt af Hh pathway modulation på kræft i æggestokkene celleproliferation, A2780, SKOV-3 og OVCAR-3 blev udsat for stigende koncentration af GANT58, en specifik Gli1 inhibitor. Resultater opnået viste, at GANT58 ikke inducerer nogen reduktion i æggestokkene tumorcelleproliferation (fig. 2B). Disse data blev bekræftet ved MTT assay (fig. S1).

Diskussion

Selv-aktivering af Hh er blevet vist i forskellige typer af maligne sygdomme [5], er der kun få rapporter, der viser det i humane ovariecarcinom prøver [27] – [30], med kun to undersøge den prognostiske rolle Hh signalmolekyler i ovariecancer. Desuden resultater fra disse to undersøgelser var modstridende: Chen og kolleger [27] fandt, at blandt Shh, Dhh, ptch, Smo og Gli1, Dhh var den eneste faktor, der er forbundet med overlevelse resultat, mens der i Liao undersøgelse [29] undersøger prognostiske rolle Shh, ptch, Smo og Gli1, sidstnævnte var den eneste protein uafhængigt associeret til patienternes overlevelse. Der findes ingen data på det tidspunkt, der kunne hjælpe forklare denne uoverensstemmelse, selv om det kan skyldes, at analysen af ​​forskellige befolkning i form af scenen og /eller tumor histotype. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi den prognostiske rolle Gli1 i en homogen population af avancerede serøse ovariecancere viser, at patienter, hvis tumorer udtrykker nuklear Gli1 farvning ( 10%) opleve en kortere OS sammenlignet med negative tilfælde (≤10%). Den uafhængige rolle Gli1 udtryk som markør for dårlig prognose blev opretholdt af multivariat analyse, efter justering for residual tumor ved kirurgi og kemosensitivitet. Samlet vores resultater ikke kun styrke den hypotese, at Gli1 kan repræsentere en ny vigtig prognostisk markør i kræft i æggestokkene, men også foreslå, at Gli1-udtrykkende tumorer dårligt svare på second-line behandlingsformer og dermed understøtte potentiel terapeutisk nytte af kombinationer af Gli målrettet agent med standardbehandlinger i æggestokkene kræftpatienter.

i den forbindelse var vi hurtige til at undersøge, om den aktiverede Hh vej er afgørende for udbredelsen af ​​ovariecancer celler. Til dette formål har vi først vurderet ved immuncytokemisk og immunoblotanalyse ekspressionen af ​​Gli1 i forskellige æggestokkene cancercellelinier, dvs. A2780, SKOV-3 og OVCAR-3, disse undersøgelser afslører lignende proteinekspression i alle 3 celle undersøgte linier. Eftersom cyclopamin inhiberer Hh-signalering ved at binde til og forebyggelse af aktivering af Smo [31], vi næste vurderede bidrag autokrin signalering til tumorvækst ved at undersøge effekten af ​​dette stof på

in vitro

celleproliferation. Især vi fandt, at selv om denne plante alkaloid inducerede en dosisafhængig inhibering af celleproliferation i cellelinierne testet, men denne effekt korrelerede ikke med en inhibering af Hh-signalering, som bedømt ved manglen på Gli1 modulation i behandlede cellekulturer. Disse resultater antyder, at inhiberingen af ​​celleproliferation ikke var resultatet af kanoniske Smo-medieret Hh pathway hæmning, men snarere en uspecifik eller toksisk virkning. I overensstemmelse med disse data, blev der ikke observeret forskelle på celleproliferation når cellelinjer blev behandlet med GANT58, en specifik Gli1 inhibitor. Især den manglende respons af SKOV-3 og OVCAR-3 cellelinier til Hh pathway hæmning er i overensstemmelse med tidligere resultater ved vores og andre grupper, hjælp cyclopamin eller en specifik Gli1 inhibitor [32], [33]. Desuden Kudo

et al

. [34] også for nylig viste, at behandling med anti-Gli1 shRNA ikke påvirkede Gli1 udtryk i A2780 celler. På den anden side, vores

in vitro

data står i kontrast til de undersøgelser af Liao

et al

. [29] og Kandala og Srivastava [35] hvilket viser, at efter behandling med cyclopamin blev Gli1 ekspression faldt i SKOV-3 og OVCAR-3 eller A2780-celler, henholdsvis. Årsagerne til disse modstridende resultater er fortsat uklare, tilføjer endnu et lag af kompleksitet til indsatsen for at tilskrive æggestokkene tumorvækst til overdreven Hh aktivitet. Selv om de kan skyldes forskelle i eksperimentelle systemer (f.eks cellelinier er tilbøjelige til genotypiske og fænotypiske afdrift under deres kontinuerlige kultur) og /eller assaymetoder, er det også tænkeligt, at de faktisk kan afspejle heterogenitet autokrin og parakrin signalering i ovariecancer . I denne forbindelse er det værd at bemærke, at, sammen med farvning af epitelcancerceller, vi også observeret sporadisk nuklear ekspression af Gli1 i det omgivende stroma (data ikke vist), dette fund antyder en cellulær interaktion mellem stroma og epithel, med mulig forekomst af parakrin signalering. Desværre, på grund af den begrænsede stroma komponent normalt er forbundet med high-grade læsioner, var vi ikke i stand til at bestemme omfanget af Gli1 udtryk i tumor mikromiljø, og flere undersøgelser er nødvendige for bedre at præcisere, hvilken rolle paracrine Hh signalering i kræft i æggestokkene.

Faktisk også er blevet rapporteret lignende forskelle i eksperimentelle resultater i andre tumorer, såsom prostata, bugspytkirtel og tyktarm [36], [37]. Yauch og kolleger [38] gjort interessant observation, at Smo-antagonist-medieret vækstinhibering af et stort antal cancercellelinjer epitel oprindelse ikke korrelerer med Hh målgenekspression i disse celler, hvilket antyder, at a) den observerede

in vitro

vækst undertrykkelse kan skyldes off-target effekter, når der anvendes disse forbindelser ved høje koncentrationer, og b) der er en parakrin krav for Hh ligand signalering i tumorigenese af Hh-udtrykkende kræftformer, med stor betydning for