PLoS ONE: Capsaicin Viser Anti-proliferativ aktivitet mod human småcellet lungekræft i cellekultur og nøgne mus Modeller via E2F Pathway

Abstrakt

Baggrund

Lille celle lungekræft (SCLC) er kendetegnet ved hurtig progression og lave overlevelsesrater. Derfor er et presserende behov for nye terapeutiske midler for denne sygdom. Capsaicin, det aktive stof i chili peber, viser anti-proliferativ aktivitet i prostata og epidermoid kræft

in vitro

. Imidlertid har den anti-proliferative aktivitet af capsaicin ikke undersøgt i humane SCLCs. Den nuværende manuskript udfylder dette tomrum af viden og udforsker anti-proliferative effekt af capsaicin i SCLC

in vitro

in vivo

.

Metodologi /vigtigste resultater

BrdU assays og PCNA ELISA’er viste, at capsaicin viser robust anti-proliferative aktivitet i fire humane SCLC-cellelinier. Desuden capsaicin kraftigt undertrykt væksten af ​​H69 humane SCLC tumorer

in vivo

som konstateres ved CAM assays og nøgne mus modeller. Den anden del af vores undersøgelse har forsøgt at give indsigt i molekylære mekanismer bag den anti-proliferative aktivitet af capsaicin. Vi fandt, at anti-proliferative aktivitet af capsaicin er korreleret med et fald i ekspressionen af ​​E2F-responsive proliferative gener som cyclin E, thymidylatsyntase, Cdc25A og Cdc6, både på mRNA og protein niveauer. Transkriptionsfaktoren E2F4 medieret anti-proliferative aktivitet af capsaicin. Ablation af E2F4 niveauer ved siRNA metodik undertrykt capsaicin-induceret G1 anholdelse. Chip assays viste, at capsaicin forårsagede rekrutteringen af ​​E2F4 og p130 på E2F-responsive proliferative initiativtagere, og derved hæmmer celledeling.

Konklusioner /Betydning

Vores resultater tyder på, at anti-proliferative virkninger af capsaicin kunne være nyttigt i terapien af ​​human SCLCs

Henvisning:. Brown KC, Witte TR, Hardman WE, Luo H, Chen YC, Carpenter AB, et al. (2010) Capsaicin Viser Anti-proliferativ aktivitet mod human småcellet lungekræft i cellekultur og nøgne mus Modeller via E2F Pathway. PLoS ONE 5 (4): e10243. doi: 10,1371 /journal.pone.0010243

Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 8. januar 2010; Accepteret: 24 marts 2010; Udgivet: 20. april, 2010

Copyright: © 2010 Brown et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en center of Biochemical Research Excellence Pilot Research Grant fra National Institutes of Health (tilskud nummer 5P20RR020180); Det Farmaceutiske Manufacturers Association Fondens Forskningsenhed Starter Grant; Marshall University ADVANCE fællesskab; en Grant-in-Aid bachelor forskningsbevilling fra National Aeronautics and Space Administration; og en Unge Klinisk Scientist Award fra Flight Attendant Medical Research Institute (tilskud nummer 82.115). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lille celle lungekræft (SCLC) er en aggressiv malignitet udgjorde 13% af alle tilfælde af lungekræft, med en samlet 5-års overlevelse på mindre end 5% [1], [2]. Sådanne statistikker understreger behovet for nye strategier for denne sygdom behandlingsmuligheder. Nylige fremskridt i den grundlæggende forståelse af molekylære begivenheder involveret i SCLC progression har ført til identifikation af potentielle agenter for terapeutiske indgreb [2], [3], [4], [5]. Disse strategier omfatter vækstfaktor /receptor-specifikke inhibitorer, proteinkinaseinhibitorer og ernæringsmæssige midler. Identificeringen af ​​næringsmidler, der viser antiproliferativ aktivitet kan repræsentere en hidtil ukendt terapeutisk avenue i human SCLC.

Capsaicin, den væsentligste aktive bestanddel i chili peppers, anvendes topisk til behandling af smerter og inflammation i forbindelse med en række forskellige sygdomme [6], [7]. Kemoforebyggelse undersøgelser viser, at capsaicin kan undertrykke carcinogenese af huden, colon, lunge, tungen og prostata [8], [9], [10], [11], [12]. Selv om disse undersøgelser har behandlet kemoforebyggende potentiale capsaicin, kun nogle få har rettet sit potentiale som et anti-cancer middel. For eksempel har capsaicin blevet vist at inducere apoptose i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), T-celle leukæmi, esophageal carcinoma, astroglioma, prostata-, tyktarms- og mavecancer celler i cellekulturmodeller [13], [14], [15], [16], [17]. Desuden har administration af capsaicin blevet vist at undertrykke prostatakræft tumorvækst i nøgne musemodeller [10], [18].

Udover at forårsage apoptose, capsaicin har vist sig at inducere standsning af cellecyklus i human cancer celler. Adskillige konvergerende undersøgelser har vist, at capsaicin-induceret G1 standsning i CE 81T /VGH humane epidermoide carcinomaceller og prostatacancerceller ske via induktion af p53 og cyclin-afhængig kinase (cdk) inhibitor p21 [10], [17], [19 ], [20], [21]. Behandlingen af ​​HL-60 humane leukæmiceller med capsaicin forårsaget G1 arrest via hæmning af cdk2 aktivitet. Den antiangiogene aktivitet af capsaicin tilskrives dets evne til at forårsage G1 arrest i endotelceller. Capsaicin-induceret G1 arrest korreleret med undertrykkelse af cyclin D1 niveauer, inhibering af cdk4 aktivitet og Rb-phosphorylering i endotel- og brystcancerceller [21], [22]. Disse data hæve den mulighed, at den anti-proliferative aktivitet af capsaicin medieres af dens virkninger på E2F-Rb vej.

E2F transkriptionsfaktorer, som består af otte medlems gener (E2F1-E2F8) spiller en central rolle i reguleringen af ​​cellecyklusprogression og celledeling [23], [24], [25], [26]. Disse E2F’ere er blevet yderligere underklassificeres i to grupper baseret på deres transkriptionelle regulatoriske egenskaber på genpromotorer. E2F1, E2F2 og E2F3 omtales ofte som “aktivator” E2F’ere fordi de transkriptionelt aktivere E2F target proliferative gener, såsom cyclin E, Cdc25A og Cdc6 [25], [27], [28], [29]. Disse målgener derefter inducere optagelse af celler i S-fase, og derved fremme cellecyklusprogression. Den anden underklasse, E2F4 og E2F5, benævnes de “repressor” E2F’ere fordi de undertrykker transkriptionen af ​​E2F målrette proliferative gener. E2F familiemedlemmer E2F6, E2F7 og E2F8 er også repressorer. E2F7 og E2F8 er de senest identificerede medlemmer af denne familie, og meget mindre om deres funktion og regulering [25]. På trods af at alle transskriptionelt aktive E2F’ere binder til det samme DNA-genkendelsesstedet på target promotorer, de har forskellige funktionelle roller i cellen [26], [29].

Studier i de senere år har vist, at aktiviteten af E2F’ere er strengt reguleret af lommen protein familien, nemlig Rb, p130 og p107. E2F’ere 1-3 kan binde til Rb-proteinet, men E2F’ere 4 og 5 fortrinsvis at binde til p107 og p130-proteiner [24], [25], [26], [29], [30]. Rb familie proteiner binder til en del inden for den transkriptionelle aktivering region E2F’ere, effektivt undertrykke deres aktivitet. Således hvilende celler indeholder høje niveauer af E2F proteiner bundet til Rb, p130 og p107. Indtræden af ​​mitogene stimuli forårsager phosphorylering af Rb, p130 og p107 ved cyclin D og E og deres tilknyttede kinaser. Phosphoryleringen af ​​Rb, p107 og p130 resultater i deres inaktivering og dissociation fra E2F proteiner [25]. Disse frie E2F’ere efterfølgende binde til target proliferative promotorer såsom cyclin E, thymidylatsyntase (TS), Cdc25A og Cdc6, som regulerer cellecyklusprogression [31], [32]. Af disse E2F1-3 stimulere transskription af de førnævnte gener, mens E2F4 og E2F5 undertrykke transskription [25]. Et flertal af human SCLC er mangelfuld i Rb-proteinet [3]. Derfor er det sandsynligt, at de øvrige to pocket proteiner, p107 og p130, spiller en afgørende rolle i E2F regulering og celledeling i humane SCLCs.

Den anti-proliferative aktivitet af capsaicin er ikke undersøgt i humane SCLCs . Den nuværende manuskript udfylder dette hul af viden og viser for første gang, at capsaicin potent kan hæmme udbredelsen af ​​menneskelige SCLCs bruger multiple cellekultur og

in vivo

modeller. Tidligere undersøgelser har vist, at et flertal af humane SCLCs har mutationer i Rb og p53, samt en dysregulering i E2F-Rb pathway [3], [4], [5]. Data fra microarrays, vævsprøver fra patienter med lungecancer og menneskelige lungekræft cellelinier viser, at cellecyklusregulerende molekyler, ligesom E2F1-5, p130, Skp2, cyklin D1 og p16, bidrage til væksten og udviklingen af ​​lungetumorer [33] . Derfor fremsatte vi den hypotese, at capsaicin viser antiproliferativ aktivitet i humane SCLCs ved at regulere aktiviteten af ​​E2F transkriptionsfaktorer.

Den foreliggende manuskript er en indledende undersøgelse med henblik på at undersøge den anti-proliferative aktivitet af capsaicin i human SCLC i både cellekultur og dyremodeller. Her viser vi for første gang, at capsaicin viser potent anti-proliferativ aktivitet i fire humane SCLC cellelinjer

in vitro

. Desuden er vores resultater viser, at capsaicin undertrykker væksten af ​​humane SCLC-tumorer i CAM og nøgne musemodeller. Vi har også undersøgt bidrag E2F transkriptionsfaktorer i vækstinhiberende virkninger af capsaicin i SCLC celler. Vi observerede, at capsaicin inhiberer proliferationen af ​​humane SCLCs via et bestemt medlem af E2F-familien, nemlig E2F4. Ablation af E2F4 niveauer af to uafhængige siRNA viste sig at vende den anti-proliferative virkning af capsaicin. Endvidere blev capsaicin-induceret vækststandsning forbundet med et fald i ekspressionen af ​​E2F målgener cyclin E, TS, Cdc25A og Cdc6-. Endelig kromatin IP (chip) analyse af humane SCLC celler viste, at behandling af capsaicin faldt rekruttering af aktivator E2F’ere, nemlig E2F2 og E2F3, at proliferativ initiativtagere som cyklin E, TS, Cdc25A og Cdc6. På den anden side, blev rekrutteringen af ​​repressor E2F4 forbedret ved capsaicin behandling. Tilsammen vore data antyder, at capsaicin viser potent anti-proliferative aktivitet i humane SCLC celler ved differentielt at regulere E2F transkriptionsfaktorer. Desuden er vores resultater rejser den mulighed, at ernæringsmæssige midler, såsom capsaicin kan være nyttige til terapi af humane SCLC.

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

Nøgne mus blev opnået fra Charles River Laboratories og akklimatiseret i en uge. De blev anbragt i autoklaverede bure med

ad libitum

adgang til mad og vand i HEPA-filtreret stativer og nøje overvåget af dyr facilitet personale. Alle procedurer, der involverer nøgne mus blev udført i overensstemmelse med Animal Care og Brug retningslinjer på en facilitet akkrediteret af Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC) International og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University (protokol # 371).

Cell Kultur og transfektion

De humane SCLC cellelinjer NCI-H69, NCI-H82 (herefter kaldet H69 og H82, henholdsvis), DMS53 og DMS114 blev opnået fra American Type Culture Collection, Rockville, MD. Disse cellelinier blev valgt, fordi de er blevet omfattende undersøgt, og deres fysiske og molekylære karakteristika ligner SCLC i patienter. Gazdar et al., (1985) oprindeligt isoleret og karakteriseret de H69 og H82 cellelinier [34], [35]. De fandt, at morfologien og vækstkarakteristika af H69 og H82-celler var typiske for SCLC tumorceller fundet i patienter. Endvidere blev den biokemiske profil af disse celler (tilstedeværelse af L-dopa-decarboxylase, neuroendokrine markører, bombesin-lignende immunreaktivitet, neuron-specifik enolase og høje koncentrationer af hjernen isoenzym af kreatinkinase) fundet at være identisk med humane SCLC-tumorer hos patienter . Ligeledes blev DMS53 og DMS114 celler først isoleret fra humane SCLC-biopsier og karakteriseret ved Pettengill et al., (1980). De fandt, at både DMS53 og DMS114 beholdt de fysiske, morfologiske og biokemiske profil af humane SCLC tumorer observeret i klinikken [36].

H69 og H82 blev opretholdt i RPMI-1640 suppleret med 2 mM glutamin, 100 enheder /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS). DMS53 humane SCLC celler blev dyrket i Waymouth s MB752 /1 medium indeholdende 2 mM glutamin, 100 enheder /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin og 10% FBS. Den kulturmedier til DMS114 humane SCLC celler var identisk med DMS53, bortset fra, at medierne indeholdt yderligere 2% natriumbicarbonat.

Primære normale humane bronchiale epithelceller (NHBE) og små luftvejs-epitelceller (SAEC) blev opnået fra Lonza Technologies, Schweiz. NHBEs blev holdt i BEBM medier, der indeholder vækstfaktorer. Tilsvarende SAECs blev holdt i SABM medium suppleret med vækstfaktorer. Både BEMB og SABM medier blev fremstillet ifølge producentens instruktioner. Alle eksperimenter under anvendelse NHBEs og SAECs blev udført mellem passagerne 3-8 [31].

MTT assay

MTT-assays blev udført som beskrevet af Heo et al., (1990). H69 og H82 celler blev udpladet i plader med 96 brønde ved en densitet på 50.000 celler /brønd. DMS53 og DMS114 celler blev udpladet i plader med 96 brønde ved en densitet på 5000 celler /brønd. Pladerne blev inkuberet i 24 timer for at tillade fuldstændig refiksation af cellerne. Efterfølgende blev celler behandlet med 50 pM capsaicin i 24 timer, 48 timer eller 72 timer. Efter de angivne tidspunkter blev 50 pi MTT-opløsning (5 mg /ml) tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet i 4 timer ved 37 ° C [37]. Derefter blev medierne aspireret, og 150 pi DMSO blev tilsat til hver brønd for at opløse formazan-krystaller. Absorbansen af ​​pladerne måltes på en ELISA-læser (Benchmark, BioRad) ved en bølgelængde på 540 nm. Hver prøve blev udført tre gange, og hele eksperimentet blev gentaget to gange.

BrdU og PCNA proliferationsassays Salg

bromdeoxyuridin (BrdU) mærkning enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) kits blev opnået fra Roche Biochemicals og blev brugt til at undersøge effekten af ​​capsaicin på spredning af fire humane SCLC-cellelinjer, H69, H82, DMS53 og DMS114. BrdU er en thymidin nukleotid analog, der er indarbejdet i S-fasen (i stedet for thymidin) kun i DNA af prolifererende celler [31], [32], [38].

H69 og H82 celler blev forgyldt med plader med 96 brønde ved en densitet på 50.000 celler /brønd. DMS53, DMS114, SAEC og NHBE-celler blev udpladet i plader med 96 brønde ved en densitet på 10.000 celler /brønd. DMS53 og DMS114 blev inkuberet med serum-frit medium i 36 timer for at fjerne virkningen af ​​endogene vækstfaktorer. Efter 36 timer, disse celler blev derefter restimuleret med 10% FBS i nærvær eller fravær af angivne koncentrationer af capsaicin i 18 timer, hvilket er den nødvendige tid til S-fase entry [31], [32], [38] . Den NHBEs og SAECs blev gjort hvilende i basale medier indeholdende ¼ beløbet (v /v) af vækstfaktorer i 24 timer (CIT). Efterfølgende blev cellerne stimuleret med komplette medier indeholdende den fulde mængde af vækstfaktorer i 18 timer som beskrevet tidligere. Hastigheden af ​​BrdU-inkorporering blev målt ved ELISA-teknik, og procentdelen af ​​celler i S-fasen kvantificeret ved kolorimetrisk evaluering (λ = 405 nm). Absorbansen af ​​celler behandlet med 10% FBS eller fuldstændige medier blev antaget at være 100%, og capsaicin-inducerede fald i S-fasen blev beregnet som en procentdel af kontrol FBS behandlede celler. Hver prøve blev testet i tre eksemplarer, og assayet blev gentaget to gange.

Celleproliferation blev også vurderet ved at måle niveauerne af prolifererende cellekerneantigen (PCNA) med en PCNA ELISA-kit fra Calbiochem. H69, H82, DMS53 og DMS114 blev udsået i 96-brønds plader og behandles på samme måde som BrdU assay beskrevet ovenfor. Efterfølgende blev mediet fjernet, og resuspension buffer (50 mM Tris, pH 8, 5 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 1 ug /ml pepstatin, 0,5 ug /ml leupeptin) sattes til cellerne. Niveauet af PCNA i cellerne blev kvantificeret ved måling af absorbansen ved 405 nm, ifølge fabrikantens protokol. Hver prøve blev testet in duplo, og assayet blev gentaget to gange for hver celletype.

cellecyklusanalyse

H69 SCLC-celler blev anvendt til cellecyklusanalyse, ved anvendelse af en modifikation af propidiumiodid teknik [15], [39]. Kort fortalt blev 5 x 10

5-celler anvendes per prøve. Hver prøve blev inkuberet med serum-frit medium i 36 timer for at fjerne virkningen af ​​endogene vækstfaktorer. Efter 36 timer blev cellerne derefter igen stimuleret med 10% FBS i nærvær eller fravær af 50 uM capsaicin i 18 timer, hvilket er den nødvendige tid til S-fase entry [30]. Celler blev høstet, vasket to gange i puffer (1 mM EDTA i DPBS uden calcium og magnesium, suppleret med 1% ultra low IgG FBS, Invitrogen Corporation), fikseret i iskold 70% ethanol og resuspenderet i propidium iod farvningsopløsning (50 pg /ml propidiumiodid, 25 ug /ml RNase A i DPBS /EDTA-buffer) i 30 minutter ved 37 ° C. Prøverne blev analyseret ved en BD FACS Aria II flowcytometer (BD Biosciences).

Lysater og Western Blotting

Lysater for hver cellelinje blev fremstillet under anvendelse af NP-40-baserede lysis-protokol [ ,,,0],31], [38], [40]. DMS114 celler blev dyrket i 100 cm skåle til cirka 70% sammenløb. Cellerne blev gjort hvilende ved inkubering i serumfrit medium i 36 timer. Efterfølgende blev cellerne igen stimuleret med 10% FBS i nærvær eller fravær af angivne doser af capsaicin i 18 timer. Celler blev høstet og vasket tre gange med iskold PBS. Celler blev derefter lyseret med M2 lysepuffer (20 mM Tris, pH 7,6, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 3 mM EGTA, 3 mM EDTA, 4 uM DTT, 5 mM PMSF, 1 mM natriumfluorid, 1 mM natrium orthovanadat, 25 ug /ml leupeptin, 5 ug /ml pepstatin, 5 ug /ml aprotinin, 25 ug /ml trypsin-chymotrypsininhibitor). Halvfjerds mikroliter lysepuffer blev tilsat for hver 20 pi hæmatokrit. Lysatet blev roteret ved 4 ° C i 30 minutter og efterfølgende centrifugeret ved 15000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev opsamlet til yderligere analyse. Koncentrationen af ​​lysatet protein blev målt ved anvendelse af et Bradford-reagens (Bio-Rad Labs). Et hundrede halvtreds mikrogram alikvot af proteinet blev kørt på en 10% SDS-PAGE-gel og overført til nitrocellulosemembraner (BioRad Labs).

Den relative ekspression af de angivne proteiner blev analyseret ved Western blotting. E2F1 monoklonale og polyklonale E2F2-6 antistoffer blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology. Monoklonale antistoffer mod TS, Cdc25A og Cdc6 blev også opnået fra Santa Cruz Biotechnology. Monoklonalt antistof mod cyclin E blev opnået fra BD Biosciences. Monoklonalt β-actin-antistof blev opnået fra Sigma Chemical Company, USA. Polyklonalt GAPDH-antistof blev opnået fra Trevigen blev Inc. De sekundære antistoffer opnået fra Pierce Biotechnologies. Opnået i de vestlige blot eksperimenter signal blev registreret af SuperSignal West Dura Extended Duration Substrat (Pierce Biotechnologies). Resultaterne af de vestlige blotting assays blev kvantificeret ved densitometrisk analyse (BioRad Gel Documentation System) ved hjælp af analyse software Mængde 4.5.2.

Chicken chorioallantoisk membran (CAM) assay

Specifik pathogen- (SPF) frugtbare hønseæg (Charles River Laboratories, North Franklin, CT) blev inkuberet ved 37,5 ° C med 75% relativ fugtighed, og roteres kontinuerligt langsomt ved en automatisk æg Turner (GQF Manufacturing Company, Savannah, GA). På dag 9 blev æg lyses og vinduer åbnes på skallen for at blotlægge CAM [41]. H69-celler (3 x 10

6) blev suspenderet i 100 pi kold serum-frit medium, blandet med 100 pi kold BD Matrigel matrix (BD Biosciences, San Jose, CA) og 50 pM capsaicin. Disse celler blev anvendt til CAM’en af ​​hver kylling embryo. Æg blev inkuberet ved 37 ° C i 4 dage før tumor implantater blev fjernet, fotograferet og vejet. I alt 12 æg blev analyseret for hver gruppe [41].

Antitumor Studies i nøgne mus Salg

Otte 4 uger gamle mandlige nøgne mus blev opnået fra Charles River Laboratories og akklimatiseret i én uge. De blev anbragt i autoklaverede bure med

ad libitum

adgang til mad og vand i HEPA-filtreret stativer og nøje overvåget af dyr facilitet personale. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Animal Care og Brug retningslinjer på en facilitet akkrediteret af Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC) International og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University (protokol # 371).

H69 celler blev høstet og re-suspenderet i en 01:01 (v /v) opløsning af serum-frie medier og Matrigel matrix (BD Biosciences). To millioner celler i 100 pi blev injiceret subkutant mellem skulderbladene på hver mus [42]. Efter tumorerne nåede 100 mm

3, musene blev skiftet til styre AIN-76A kost indeholdende 10% majsolie, indtil tumorerne nåede 800 mm

3. Efterfølgende blev musene inddelt i to grupper. Den behandlingsgruppe (N = 4) blev ændret til en diæt indeholdende 50 mg capsaicin /kg fødevarer (som er ca. 10 mg capsaicin /kg legemsvægt af mus per døgn). Kontrolgruppen (n = 4) blev fortsat på kontroldiæten. Mus blev vejet en gang om ugen. Deres fødeindtagelse blev overvåget ved vejning madrester gang om ugen. Administrationen af ​​capsaicin forårsagede ingen ubehag eller vægttab hos mus. Derudover fødeindtagelse var ens mellem kontrol og capsaicin-behandlede mus.

lægemiddelbehandling fortsattes indtil tumorer i kontrolgruppen nåede 2000 mm

3. Tumor længder (l), bredder (W) og højden (h) blev målt dagligt (i 6 dage ud af en uge) for hver mus. Tumorvolumener blev beregnet som (L x B x H) /2 [43], [44]. Efter euthanizing musene blev tumorerne skåret ud. Halvdelen af ​​tumoren blev lynfrosset i flydende nitrogen og anvendes til at fremstille lysater. Tumorlysater blev fremstillet ved anvendelse T-Per lysepuffer (Pierce Biotechnology), ifølge producentens protokol [38]. Den anden halvdel af tumoren blev fikseret i formalin og anvendt til immunhistokemi.

Caspase KLØVNINGSASSAY

Caspase spaltning blev udført med tumor lysater fremstillet fra kontrolmus og capsaicin-behandlede mus ved anvendelse af caspase -3 spaltning kit (Chemicon, Temecula). Tumorlysater blev fremstillet ved anvendelse T-Per-lysepuffer som beskrevet ovenfor. En portion på 60 pi lysat blev anvendt til hver reaktion. Derudover 60 pi cisplatin-behandlede H69 lysat (lavet af behandling H69-celler med 30 uM af cisplatin i 72 timer) blev anvendt som den positive kontrol, ifølge producentens protokol. Hver prøve blev testet in duplo, og assayet blev gentaget to gange for hver celletype.

Immunhistokemi

Immunfarvning blev udført under anvendelse af M.O.M. farvning kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Paraffinindlejrede H69 xenograft mus vævssnit (4 um) blev afvokset i xylen og derefter rehydreret i ethanol. Sektioner blev udsat for antigen-genvinding behandling anvendelse af antigenet Retrival kit (Biogenex Inc.) ifølge producentens protokol. Snittene blev derefter behandlet med proteinase K-behandling (20 ug /ml) i 15 minutter og standset af endogene peroxidaser i 0,3% H

2O

2-opløsning i methanol i 30 minutter. Snittene blev blokeret ved anvendelse af avidin-biotin blokering kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Snittene blev inkuberet med anti-PCNA (Biogenex Inc.) monoklonalt primært antistof (1:100 fortynding) i en time ved stuetemperatur. Snittene blev vasket i PBS for at fjerne overskydende antistof og udviklet ved hjælp af M.O.M. og peroxidase DAB kit, opnået fra Vector Laboratories (Burlingame, CA). Sektioner blev modfarvet med hæmatoxylin, dehydreret, monteret i Permount Mounting Medium (Fisher Biotech) og fotograferet under Olympus BX41 lyse felt mikroskop. Hemotoxylin og eosin (H og E) billeder blev fotograferet ved 40X forstørrelse. PCNA farvning blev fotograferet ved 1000X forstørrelse med anvendelse olie. PCNA positive celler, som er de prolifererende celler, blev kvantificeret ved at tælle 5 felter på 100 celler. Data præsenteres som den procentdel af PCNA positive celler.

siRNA Transfektion og Analyser

Kemisk syntetiseret, dobbeltstrenget siRNA for E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5 og E2F6 blev købt fra Santa Cruz Biotechnology. Transfektionen blev udført i H69 og DMS114 celler [31], [45]. Asynkrone celler blev høstet og genudpladet i 96-brønds plader ved ca. 40% konfluens i vækstmedier indeholdende 10% FBS i fravær af antibiotika. Transfektionen af ​​ovennævnte siRNA blev udført ved anvendelse Oligofectamine reagens (Invitrogen Corporation), ifølge fabrikantens protokol. Atten timer post transfektion, cellerne blev gjort hvilende i 36 timer ved inkubering i serumfrie medier. Efterfølgende blev cellerne behandlet med 10% FBS i nærvær af 50 uM capsaicin i 18 timer. Den capsaicin blev tilsat 30 minutter før tilsætning af de medier, der indeholdt 10% FBS. Efter 18 timer blev procentdelen af ​​celler i S-fasen målt ved BrdU ELISA kit (Roche Laboratories). En ikke-targeting siRNA-sekvens (Santa Cruz Biotechnology) blev anvendt som en negativ kontrol for transfektionsforsøg. Hver transfektion blev udført i dobbeltbestemmelse, og hele assayet blev gentaget to gange.

Resultaterne af E2F4 transfektionsforsøg blev verificeret ved anvendelse af et andet sæt af uafhængige siRNA opnået fra Ambion Biotechnologies [31], [45]. Protokollen for transfektionen var samme som tidligere beskrevet. En ikke-targeting kontrol-siRNA blev anvendt som negativ kontrol i alle eksperimenter. Hver transfektion blev udført i dobbeltbestemmelse, og hele assayet blev gentaget to gange.

Western blotting-forsøg blev udført for at vurdere ekspression af proteiner efter siRNA transfektion [31], [45] i både H69 og DMS114 celler. Hver transfektion i H69-celler blev udført under anvendelse af 5 x 10

5-celler podet i T-10 kolber (Midwest Scientific) i RPMI indeholdende 10% FBS uden antibiotika. I tilfælde af DMS114 celler blev transfektionsblandingen udført i 6-brønds plader ved anvendelse af 5 x 10

5 celler /brønd. I både H69 celler og DMS114 celler blev hver transfektion blev udført to gange, og det hele eksperimentet blev gentaget to gange. Transfektion af det angivne siRNA blev udført under anvendelse Oligofectamine reagent (Invitrogen Corporation), ifølge fabrikantens protokol. En ikke-targeting kontrol-siRNA blev anvendt som den negative kontrol. Efter 36 timers transfektion blev lysater fremstillet som beskrevet ovenfor, og ekspressionen af ​​E2F-familien af ​​proteiner blev bestemt ved western blotting-analyse.

Real-time PCR

H69 celler blev underkastet serumudsultning i 36 timer og derefter stimuleret med 10% FBS i 8 timer [46]. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse RNeasy miniprep kit fra QIAGEN. Et mikrogram af RNA var DNase behandlet ved RQ1 DNase (Promega), efterfulgt af første streng cDNA-syntese under anvendelse af iScript cDNA syntese kit (Bio-Rad). En fraktion (1/20) af det endelige cDNA reaktionsvolumen blev anvendt i hver PCR [46]. Primer sekvenser [46], [47] er som følger:

cyclin E (forward primer): 5’TTCTTGAGCAACACCCTCTTCTGCAGCC3 «.

cyclin E (revers primer): 5’TCGCCATATACCGGTCAAAGAAATCTTGTGCC3″.

TS (fremad primer): 5’CTGCCAGCTGTACCAGAGAT3 ‘

TS (revers primer):. 5’ATGTGCATCTCCCAAAGTGT3 «.

Cdc6 (forward primer): 5’CCCCATGATTGTGTTGGTAT3«.

Cdc6 (omvendt primer): 5’TTCAACAGCTGTGGCTTACA3 ‘

18S (fremad primer):. 5’CTCAACACGGGAAACCTCAC3′

18S (omvendt primer):. 5’AAATCGCTCCACCAACTAAGAA3 ‘ .

Real-time PCR blev udført på en Bio-Rad iCycler.

chromatin Immunfældning (chip) Indhold

H69 var serum-udsultet i 36 timer ved at inkubere dem i serum-frit RPMI-1640 [31], [32], [40], [48]. Efterfølgende disse hvilende H69 celler blev restimuleret med 10% FBS i nærvær eller fravær af 50 uM capsaicin i 8 timer. Femogtyve millioner celler blev anvendt pr IP reaktion. Celler blev behandlet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur for at tværbinde proteinerne og DNA’et. Tværbinding blev afsluttet ved tilsætning af 0,125 M glycin. Kanin-anti-muse-sekundært antistof blev anvendt som kontrol for alle reaktioner. PCR-reaktioner blev udført under anvendelse af 5 pi af DNA fra immunudfældningsundersøgelser reaktioner eller 1 pi DNA fra input reaktion som template. PCR cykling betingelser for TS og Cdc6 var som følger: 94 ° C i 2 minutter; derefter 35 cykler ved 94 ° C i 30 s, 56 ° C i 30 s og 65 ° C i 30 s; efterfulgt af 65 ° C i 2 min. PCR cycling betingelser for cyclin E var som følger: 94 ° C i 2 min; derefter 35 cykler ved 94 ° C i 30 s, 66 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s; efterfulgt af 72 ° C i 2 min. Primeren for cyclin E omfattede to af tre E2F bindingssteder på promotoren som beskrevet i Nevins et al., (1994). Disse bindingssteder omfatter højaffinitets E2F bindingssteder på den humane cyclin E-promotor [49]. PCR for c-Fos promoter (som ikke reguleres af E2F) blev anvendt som en negativ kontrol for alle forsøg. Sekvenserne af PCR-primerne anvendt i PCR’er var som følger:

cyclin E (forward primer): 5’CCCCGTCCCTGCGCCTCGCTG3 «.

cyclin E-promotor (reverse primer): 5’CGGCGGCGGCGACGGCAGTGG3 ‘ .

Cdc6 promotor (forward primer): 5’GGCCTCACAGCGACTCTAAGA3 «.

Cdc6 promotor (revers primer): 5’CTCGGACTCACCACAAGC3 ‘

TS promotor (forward primer).: 5’TGGCGCACGCTCTCTAGAGC3 ‘.

TS promotor (reverse primer): 5’GACGGAGGCAGGCCAAGTG3′

Cdc25A, er c-fos primere og PCR-betingelserne beskrevet i [29]

Statistisk analyse

Alle data blev udtrykt som middelværdien ± SEM og repræsenteres ved hjælp Graph Pad Prism 5. Forskelle mellem kontrol- og behandlede prøver blev analyseret ved variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af en Dunnetts multiple sammenligningstest . De tumor vækstrater i athymiske mus blev analyseret ved ANOVA efterfulgt af Neuman-Keuls test. I immunhistokemi eksperimenter blev alle PCNA positive kerner tælles i fem uafhængige felter af to uafhængige observatører i et randomiseret dobbeltblind mode.