PLoS ONE: Novel Kombination af Sorafenib og Celecoxib Giver Synergistisk antiproliferativ og proapoptotiske effekter i Human Liver Cancer Cells

Abstrakte

Molekylær målrettet terapi har vist sig lovende som en behandling for fremskreden hepatocellulært carcinom (HCC). Sorafenib, en multikinasehæmmer hæmmer, for nylig modtaget FDA godkendelse til behandling af fremskreden HCC. Men selv om sorafenib er veltolereret, bekymring for sin sikkerhed er blevet udtrykt. Celecoxib (Celebrex®) er en selektiv cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor, som udviser antitumorvirkninger i humane HCC-celler. Den foreliggende undersøgelse undersøgte samspillet mellem celecoxib og sorafenib i to human lever tumorcellelinier HepG2 og Huh7. Vores data viste, at hver inhibitor alene reduceret cellevækst og kombinationen af ​​celecoxib med sorafenib synergistisk inhiberede cellevækst og forøget apoptose. For bedre at forstå de molekylære mekanismer bag den synergistiske antitumoraktivitet af kombinationen, vi undersøgte udtryk for kombinationen behandlet leverkræft cellelinjer hjælp microarray analyse. Kombinationsbehandling signifikant ændret ekspressionsniveauer af 1.986 og 2.483 transkripter i HepG2 og Huh7 celler. Gener funktionelt involveret i celledød, signaltransduktion og regulering af transkription var overvejende opreguleret, mens gener impliceret i stofskiftet, cellecykluskontrol og DNA-replikation og reparation hovedsagelig nedreguleret efter behandling. Men kombination behandlet HCC cellelinjer viste specificitet i udtrykket og aktivitet af afgørende faktorer involveret i hepatocarcinogenese. Den ændret ekspression af nogle af disse gener blev bekræftet ved semikvantitativ og kvantitativ RT-PCR og ved Western blotting. Mange nye gener opstået fra vores transkriptomisk analyser, og yderligere funktionelle analyser kan afgøre, om disse gener kan tjene som potentielle molekylære mål for mere effektive anti-HCC strategier

Henvisning:. Cervello M, Bachvarov D, Lampiasi N, Cusimano A, Azzolina A, McCubrey JA, et al. (2013) ny kombination af Sorafenib og Celecoxib Giver Synergistisk antiproliferativ og proapoptotiske effekter i Human Liver Cancer Cells. PLoS ONE 8 (6): e65569. doi: 10,1371 /journal.pone.0065569

Redaktør: Manlio Vinciguerra, University College London, England

Modtaget: Februar 11, 2013; Accepteret: April 26, 2013; Udgivet: 12 juni 2013

Copyright: © 2013 Cervello et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra den italienske “Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (ministeriet for uddannelse, universiteter og forskning) – MIUR FIRB427 MERIT n.RBNE08YYBM til MC og G.M .; D. B. er leder af Core Genomisk Facility på CHUQ-Cancer Research Centre, støttet af FRSQ-RR Cancer. Alle de genomiske eksperimenter og data analyser blev udført på denne facilitet; M.C. er også blevet delvist understøttet af et tilskud til CNR fra det italienske økonomi- og finansminister for projektet FaReBio di Qualità. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) repræsenterer den femte hyppigste cancer og den tredje mest almindelige dødsårsag af kræft [1], [2]. Selv om den kliniske diagnosticering og behandling af tidlige fase HCC er forbedret betydeligt, HCC prognosen er stadig ekstremt fattige. Endvidere avancerede HCC er en særdeles aggressiv tumor med en lav eller ingen reaktion på almindelige terapier. Derfor er der et akut behov for nye effektive og veltolereret terapi strategier.

Sorafenib, en multikinasehæmmer, som er rettet mod Raf kinaser samt VEGFR-2 /-3, PDGFR-β, Flt-3 og c-Kit for nylig modtaget FDA og EMEA godkendelse til behandling af patienter med fremskreden HCC. Men de lave tumor svarprocenter og bivirkninger forbundet med denne monoterapi indikerer behovet for at undersøge andre nye terapeutiske muligheder for HCC.

målrettede behandlinger har indtastet inden for antineoplastisk behandling og anvendes enten alene eller i kombination med konventionelle kemoterapeutiske stoffer. Molekylær målrettede terapi rummer lovende for HCC [3]. Men som i de fleste kræftformer, brugen af ​​en enkelt molekylært målrettet agent ville næppe opnå en langvarig remission eller helbredelse i HCC, især for sene sygdom. Kombinationsbehandling skal derfor påkrævet, og det synes rimeligt at spekulere, at en kombination af to eller flere agenter i sidste ende vil øge den terapeutiske gevinst.

HCC er normalt resultatet af kontinuerlig skade og kronisk inflammation. En vigtig mediator af inflammation er den inducerbare gen cyclooxygenase-2 (COX-2). Det er nu veletableret, at COX-2 er en vigtig molekylære mål for anti-cancer terapier. COX-2 er kronisk overudtrykt i mange cancertyper, herunder HCC [4] – [8]. I HCC har vi og andre forskere vist, at COX-2-hæmmere kan have potentielle terapeutiske virkninger [9] – [13]

Begrundelsen for at kombinere sorafenib med COX-2-hæmmere i HCC stammer fra data offentliggjort af. andre forfattere [14], men også fra vores egne publicerede data [12]. Vi viste, at behandling af humane HCC-celler med en COX-2-inhibitor er forbundet med aktiveringen af ​​ERK1 /2, og at inhibering af MEK /ERK signalvejen af ​​en MEK-inhibitor potenserer antitumoraktiviteten af ​​inhibitoren. Samlet tyder vore resultater, at MEK /ERK-vejen ikke mediere cytotoksicitet induceret af COX-2-hæmmere, men kan beskytte celler mod død, som støtter indirekte rolle MEK /ERK pathway i overlevelse signalering af HCC-celler [12].

Derfor baseret på disse resultater, vi testede virkningerne af en kombination af det selektive COX-2-inhibitor celecoxib med sorafenib. Synergistisk anti-proliferative og pro-apoptotiske effekter blev opnået ved brug af en kombination af sorafenib med celecoxib. For bedre at forstå de detaljerede mekanismer de cytotoksiske virkninger af celecoxib og sorafenib, vi også undersøgt og sammenlignet den globale genekspression af HCC celler behandlet med enten celecoxib eller sorafenib, eller de to lægemidler, der anvendes i kombination.

Materialer og metoder

Reagenser, Cell Culture, Cell levedygtighed Klonogen og proliferationsassays

Celecoxib (CLX) var en gave fra Pfizer Corporation Inc. (New York, USA), sorafenib (SOR) blev indkøbt fra Alexis Biochemical (Lausen, CH), og begge lægemidler blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO). Den menneskelige hepatocellulært carcinom cellelinjer HepG2 (en menneskelig hepatocarcinoma cellelinie, ATCC HB-8065) ​​og Huh7 [15] (en gave fra Prof. Massimo Levrero, Sapienza-universitetet i Rom, Rom, Italien), der anvendes i denne undersøgelse var af en lav smal passage nummer og blev opretholdt som tidligere beskrevet [16]. Alle celler blev holdt ved 5% CO

2 og 37 ° C og rutinemæssigt screenes mod forurening med mycoplasma. Celle levedygtighed assays blev udført som tidligere beskrevet [17]. Koefficienten for lægemiddelinteraktion (CDI) blev anvendt til at analysere virkningerne af lægemiddelkombinationer [18]. CDI beregnes som følger: CDI = AB /(A × B). Ifølge absorbansen af ​​hver gruppe, AB er forholdet kombinationsgrupperne med kontrolgruppen; A eller B er forholdet mellem den enkelt middel gruppe med kontrolgruppen. Således CDI værdier mindre end, lig med eller større end 1 indikerer, at narkotika er synergistisk, additiv eller antagonistisk henholdsvis. CDI mindre end 0,7 indikerer, at narkotika er betydeligt synergistisk. Desuden blev statistisk analyse udført under anvendelse af Students T-test (to-halet). Kriterierne for statistisk signifikans var

s

. 0,05

Effekten af ​​forskellige inhibitorkoncentrationer på cellelevedygtighed blev også vurderet ved hjælp af en klongenicitetsassayet. Til denne analyse, 1,0-1,5 × 10

3-celler blev udpladet i seks-brønds plader i vækstmedium, og efter natten vedhæftede celler blev udsat enten til CLX og SOR alene eller kombinationer heraf eller vehikel i 48 timer. Cellerne blev derefter vasket med narkotika-frit medium og lodes vokse i 14 dage i stoffrit betingelser. Kolonier indeholdende mere end 50 celler blev talt. Relativ kolonidannelse blev bestemt ved forholdet mellem det gennemsnitlige antal kolonier i behandlede celler til det gennemsnitlige antal kolonier i celler behandlet med opløsningsmiddel (DMSO). Alle eksperimenter blev udført in duplo og gentaget to gange.

Celleproliferation blev bestemt ved at anslå mængden af ​​bromdeoxyuridin (BrdU) inkorporering i DNA ved en kolorimetrisk immunassay (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland). Kort fortalt, 5 × 10

3-celler blev dyrket i plader med 96 brønde i de forskellige koncentrationer af CLX og SOR alene eller deres kombinationer eller køretøj i 24 timer. BrdU blev derefter tilsat ved 10 pM slutkoncentration. Cellerne blev yderligere inkuberet i yderligere 24 timer og derefter fikseret og behandlet med anti-BrdU peroxidase ifølge producentens instruktioner. Farve blev udviklet ved tilsætning af tetramethylbenzidin-substrat og målt ved 490 nm. Farveintensitet og absorbansværdier direkte korreleret med mængden af ​​BrdU inkorporeret i DNA. Resultaterne blev udtrykt som procent inhibering af BrdU-inkorporering i forhold til kontrollen. Værdier blev udtrykt som middelværdi ± SD af tre separate forsøg, hver udført in triplo.

TUNEL assays Salg

Cellerne blev dyrket i 8-brønds kammerobjektglas natten over. Efter behandling i 24 timer med forskellige koncentrationer af CLX og SOR enten alene eller i kombination, blev cellerne vasket to gange med PBS og fikseret i 4% paraformaldehyd-opløsning i 25 minutter ved stuetemperatur. Apoptotiske celler blev detekteret ved terminal deoxynukleotidyltransferase-medieret dUTP nick endemærkning (TUNEL) assay under anvendelse af deadend ™ Kolorimetrisk TUNEL System Kit fra Promega (Madison, WI) ifølge producentens instruktioner. Antallet af apoptotiske celler blev bestemt ved at tælle procentdelen af ​​brune farver positive celler. Mindst 500 celler fra to forskellige cellepræparater blev talt for hver tilstand. Celler blev visualiseret med en Axioskopmikroskop (Zeiss, Tyskland).

Western blotting Analyser Salg

Til Western blot-analyse blev hele cellelysater opnået under anvendelse RIPA puffer (Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA) og Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [19], med primære antistoffer dannet mod survivin og TRIB3 /TRB3 (Abcam Limited, Cambridge, UK), DDIT3 /CHOP (Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), β- actin, YAP1 og DKK1 (Sigma-Aldrich Srl, Milano, Italien).

Gene Expression Profilering og data analyser

Genekspression analyse blev udført ved hjælp af Agilent 44 K Menneskelig Whole Genome Oligonucleotide Microarrays ( indeholdende ~44,000 gener), som tidligere beskrevet [20] – [23]. Alle microarray eksperimenter blev udført in duplo under anvendelse af farvestof-swap under mærkning. Den GeneSpring software (Agilent, Palo Alto, CA) blev anvendt til at generere lister over udvalgte gener for forskellige statistiske og visualiseringsmetoder. Netværk og sti analyser af microarray data blev afsluttet ved hjælp af Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software (https://www.Ingenuity.com). Den microarray data er blevet deponeret til GEO-database med tiltrædelsen nummer GSE45340.

Semi-kvantitativ RT-PCR (sqrt-PCR) Analyser

Microarray data blev valideret for udvalgte differentielt udtrykte gener ved sqRT- PCR som tidligere beskrevet [21], [23]. Den β-actin-genet blev anvendt som reference gen. Følgende sense og antisense primere blev anvendt henholdsvis til at amplificere human BIRC5 (5′-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3 ‘og 5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′), DDIT3 (CHOP) (5’-ATGGCAGCTGAGTCATTGCC-3 ‘og 5’-TCATGCTTGGTGCAGATTC 3 ‘), FABP1 (5′-CTCTATTGCCACCATGAGTTTC-3′ og 5’-GCTGATTCTCTTGAAGACAAT-3 ‘), HRK (5′-CTGTGTCCTTGGAGAAAGCTG-3′ og 5’-GTGTTTCTACGATCGCTCCAG-3 ‘), LARP6 (5’-GGAACAAGCTGGGATATGTGA- 3 ‘og 5′-GGTGGTCCTCATTCAACTCAA-3′), MT2A (5’-AAGAAAAGCTGCTGCTCCTG-3 ‘og 5′-TGGAAGTCGCGTTCTTTACAT-3′), YAP1 (5’-GGCAAAGACATCTTCTGGTCA-3 ‘og 5′-CATCATATTCTGCTGCACTGG-3′) og β-actin (5’-CACCACACCTTCTACAATGAGC-3 ‘og 5′-AGTACAGCTACGAGCAGTTCTTGTT-3’). PCR-reaktioner blev udført under anvendelse af følgende parametre: 95 ° C i 5 min, 94 ° C i 30 sek, 62 ° C for HRK, LARP6, 60 ° C i BIRC5, β-actin, FABP1, MT2A, YAP1, 58 ° C for DDIT3 og 72 ° C i 1 min efterfulgt af en endelig forlængelse trin på 72 ° C i 8 min. Antallet af cyklusser blev justeret for at muliggøre påvisning i det lineære område. Endelig blev PCR-produkter analyseret ved elektroforese på agarosegel, fotograferet og kvantificeres ved densitometrisk scanning.

Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) Analyser

Ekspression af udvalgte gener blev kvantificeret ved kvantitativ real Time PCR (qPCR) ved hjælp Sybr Grøn fluorescens (Qiagen, Milano, Italien) på StepOnePlus (Applied Biosystem). QuantiTect Primer Analyser for CCND1 (QT00495285), DDIT3 (CHOP) (QT00082278), DKK1 (QT00009093), FGF19 (QT02452289), FNDC3B (QT01882748), KLB (QT02454977), TRIB3 (QT00088543), LARP6 (QT00221445) blev købt fra QIAGEN (Milano, Italien) og forstærkes som anbefalet. Relativ ekspression blev beregnet ved hjælp af sammenlignende C

t metode. Ekspression af genet af interesse blev beregnet som gange induktion sammenlignet med kontrol (DMSO) og blev korrigeret med den kvantificerede ekspressionsniveauet af β-actin (QT00095431).

Resultater

Kombi af celecoxib med sorafenib Synergistisk Reducerer Cell levedygtighed, Cell Proliferation og Colony Dannelse og inducerer apoptose i HCC Celler

Brug af MTS analysen vi først vurderet virkningerne af sorafenib (SOR) og celecoxib (CLX) om levedygtigheden af ​​to menneskelige HCC celle linjer, HepG2 og Huh7, som udviser forskellige karakteristika, herunder differentiering, biologisk adfærd og genetiske defekter, COX-2-ekspressionsniveauer [21], samt Raf /MEK /ERK pathway aktiviteter [23]. Som vist i figur 1, behandling med CLX og SOR i 48 timer reduceres effektivt levedygtighed i begge cellelinier. Efter 72 timers narkotika eksponering, IC

50’erne i CLX var 76 ± 9,9 og 72,5 ± 0,7 uM i HepG2 og Huh7 celler, henholdsvis; IC

50’erne i SOR var 10,3 ± 1,1 og 10,1 ± 1,8 pM i de samme celler. Siden COX-2 mRNA-ekspression er målbart i HepG2-celler [10], [21], vil den væksthæmmende aktivitet af CLX synes at være stort set COX-2 uafhængig i disse celler [21]. Desuden ville det SOR-medierede vækst-inhiberende aktivitet synes at være uafhængig af MEK /ERK pathway inaktivering i HepG2-celler, da som tidligere rapporteret, at ekspressionen af ​​phospho-MEK og phospho-ERK1 /2 er næppe påviselig i denne HCC celle line [23].

Cell vitalitet blev vurderet af MTS analysen. HepG2 og Huh7-celler blev behandlet i 48 timer med de angivne koncentrationer af CLX og SOR enten alene eller i kombination. Data er udtrykt som procentdelen af ​​kontrolceller og er de middelværdier ± SD af tre separate forsøg, som hver blev udført tre gange. *

s

0,05; **

s

0,01 versus sorafenib alene, # p 0,05; ## P. 0,01 versus celecoxib alene

Derefter undersøgte vi, de cytotoksiske virkninger af SOR + CLX kombination i begge HCC cellelinjer under anvendelse MTS assays (figur 1). Den SOR + CLX kombination de viste signifikant forøget cytotoksicitet i forhold til de enkelte agenter. CDI blev anvendt til at bestemme typen af ​​vekselvirkning mellem de midler (tabel 1). I begge cellelinier forekom kraftig synergi, når CLX blev anvendt i kombination med SOR (tabel 1).

De cytotoksiske virkninger af kombinationsbehandlingen blev yderligere bekræftet under anvendelse af et klonogent assay (figur 2). Cellerne blev behandlet i 2 dage med eller uden forbindelser, blev mediet aspireret, og de blev derefter vasket med inhibitor-frit medium. Celler lodes vokse i yderligere 14 dage. Der var en dosis-afhængigt fald i kolonidannende evne grund kombinerede SOR + CLX behandlinger i begge cellelinier. Faktisk SOR + CLX kombination ved et fast forhold dosis resulterede i en signifikant stigning i tumor- celledrab som målt ved kolonidannelse assays sammenlignet med de enkelte midler (figur 2).

Cellevækst af HepG2 og Huh7-celler blev bestemt ved klongenicitetsassayet efter behandling med CLX og SOR enten alene eller i kombination. Celler blev udpladet natten over og udsat for CLX og SOR alene eller i kombination i de angivne koncentrationer i 48 timer. Efter behandling hver brønd blev vasket og forsøget fortsættes i 14 dage i fravær af lægemidler. Overlevende kolonier blev farvet (venstre felt) og tælles (højre panel). Data er udtrykt som en procentdel af koloni i kontrolceller og er de middelværdier ± SD af to separate forsøg, som hver blev udført in duplo. *

s

0,05; **

s

. 0,01 versus alene hver agent

Da anti-vækst virkninger af den enkelte eller kombinerede behandlinger kan skyldes øget celledød og /eller nedsat celle spredning, vi undersøges særskilt stoffets virkninger på apoptose induktion og DNA-syntese. Med hensyn til apoptose, behandling af HepG2 og Huh7-celler med op til 50 uM CLX havde ubetydelige virkninger på apoptose induktion bedømt ved TUNEL-assay (figur 3A). Behandling med 7,5 eller 10 uM SOR øget mængden af ​​apoptotiske HepG2-celler til 3,4 ± 0,85% og 5,5 ± 1,4% hhv. Men SOR + CLX kombination signifikant øget apoptose i HepG2-celler i forhold til behandling med enten agent anvendt alene (

s

0,05), mens der i Huh7 celler blev observeret nogen virkning (figur 3B). BrdU assay blev anvendt til at undersøge virkningerne af kombinationsbehandlingen på celleproliferation. Som vist på figur 3C, SOR + CLX kombination havde en stærk synergistisk virkning på celleproliferation i begge cellelinier, der viser CDI værdier mindre end 0,5 og 0,6 i alle SOR + CLX drugs kombinationer i HepG2-celler og Huh7 celler.

(A) Detektion af apoptose ved TUNEL-assay. Mikrofotografier af HepG2-celler behandlet i 24 timer med de angivne koncentrationer af CLX og SOR enten alene eller i kombination. Apoptotiske celler blev visualiseret ved TUNEL-farvning som beskrevet i afsnittet Materialer og fremgangsmåder. (B) Kvantitativ analyse af TUNEL-positive HepG2 og Huh7-celler. Data udtrykkes som den middel ± SD af to separate forsøg. *

s

0,05, versus alene hver agent. (C) Celleproliferation blev vurderet ved BrdU assay. Celler blev behandlet i 48 timer med de angivne koncentrationer af CLX og SOR enten alene eller i kombination. Data er udtrykt som procentdelen af ​​kontrolcellerne og er de middelværdier ± SD af tre separate forsøg. *

s

0,05; **

s

. 0,01 versus alene hver agent

transkriptom Analyse Identificerer Gene Expression skifter Fælles for begge og Unique til HepG2 og Huh7 Celler Efter kombinationsbehandling

at identificere nye potentielle mekanismer i den kombinerede virkning af celecoxib og sorafenib, blev deres virkninger på global genekspression i begge cellelinier undersøgt og sammenlignet ved hjælp af DNA-microarray-teknologi. Agilent 44 K Humant Whole Genome oligonukleotid mikroanalyse (indeholdende ~44,000 gener) blev anvendt til at identificere de globale genekspression ændringer i HCC-cellelinier, efter samtidig behandling med 50 pM CLX og 7,5 uM SOR i 48 timer. Disse koncentrationer blev empirisk estimeret som den maksimale medikamentkoncentrationer, som ikke forårsager en betydelig reduktion i cellelevedygtighed (mindre end 20-30%) og /eller ændringer i cellemorfologi i behandlingsperioden (data ikke vist). Alle microarray eksperimenter blev udført i to eksemplarer anvender farveri swaps for at undgå mærkning bias. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, i alt 1.986 differentielt udtrykte gener med ekspressionsniveauer ≥2 gange blev identificeret i HepG2 celler og 2.483 gener vises ≥2 fold ekspression i Huh7-celler. Blandt disse, 975 gener eller 1.382 gener var opreguleret og 1.011 eller 1.111 generne blev nedreguleret i HepG2 og Huh7 celler. Det skal understreges, at den kombinerede SOR + CLX behandling i begge HCC-cellelinier producerede en fremherskende reduktion i gener associeret med metabolisme, cellecykluskontrol og DNA-replikation og reparation, som talrige gener involveret i DNA-replikation og reparation var især nedreguleres i HepG2-celler (se tabel 2A og 2C). Gener funktionelt relaterede til celledød, signaltransduktion og regulering af transskription var for det meste opreguleret i både HepG2 og Huh7 celler (Tabel 2B og 2D). Gener involveret i cellevækst og proliferation og transport var proportionalt op- og ned-moduleret i HepG2-celler, mens de hovedsageligt blev induceret i Huh7-celler (tabel 2). Borde S1 og S2 display fuldstændige lister over de differentielt udtrykte gener (≥2-fold) i SOR + CLX-behandlede HepG2 og Huh7 celler.

Vores transkriptom analyser stærkt bekræftede den observerede synergistiske virkninger af den kombinerede behandling i HCC-celler. Vi har tidligere undersøgte de molekylære mekanismer (herunder genekspressionsprofilering) af celecoxib [21] og sorafenib [23] cytotoksicitet i HepG2 og Huh7-celler. Venn-diagram analyse baseret på den tidligere offentliggjorte og ovennævnte gen lister var tegn på et væsentligt antal af differentielt udtrykte gener, som udelukkende blev moduleret i begge HCC-cellelinier kun efter den kombinerede SOR + CLX behandling (figur 4A). Desuden er de fleste af disse entydigt modulerede gener viste tydeligt HepG2 eller Huh7 cellespecificitet upon SOR + CLX behandling (se figur 4B). Disse data er i overensstemmelse med vores tidligere fund om de forskellige molekylære mekanismer for cytotoksiske virkning af celecoxib eller sorafenib i HepG2 og Huh7 celler [21], [23]. Ovenstående analyser også fået os til at vurdere, om SOR + CLX-behandlede HepG2 og Huh7 celler kunne skelnes på grundlag af deres genekspression profiler. Efter filtrering på 2-fold signal intensitet, brugte vi en envejs ANOVA parametrisk test (Welch

t

-test; varianserne ikke antages lig) til at vælge diskriminerende gener. Faktisk

t

test med en

s

-værdi cutoff på 0,005 udvalgt 174 gener for hvilke udtryk afveg i HepG2 og Huh7 celler. Clustering analyse baseret på listen 174 gener blev udført ved hjælp af standard Betingelse Tree algoritme leveres i GeneSpring, afslører dannelsen af ​​to store klynge grupper, der klart skelner HepG2 og Huh7 celler efter behandling (figur 4C). Nioghalvfems gener fra listen 174-gener blev opreguleret i HepG2-behandlede celler sammenlignet med Huh7 celler. Større klassifikationer af disse gener omfattede celleproliferation, signaltransduktion, metabolisme og transport. Gener opreguleret i Huh7-behandlede celler i forhold til HepG2-celler (75 gener) er hovedsageligt involveret i stofskiftet, signaltransduktion, regulering af transskription, immunrespons og DNA-replikation og reparation. Listen 174 gener er vist i tabel S3.

(A) Venn-diagram analyser af gener, differentielt udtrykte (≥2 gange) i HepG2 og Huh7 cellelinier upon CLX (50 uM) behandling, SOR (7,5 uM) behandling, og kombineret SOR + CLX behandling. (B) Venn-diagram sammenligning af fælles og tydelige gener unikt moduleret (≥2 gange) i HepG2 og Huh7 celler kun følgende kombineret SOR + CLX behandling. (C) Hierarkisk klyngedannelse på grundlag af listen 174 gener (2-fold forskel i genekspression;

s

-værdi cutoff på 0,05), som diskriminerer HepG2 og Huh7 celler efter deres svar på kombineret SOR + CLX behandling. Rød betyder opregulering og grønne betegner nedregulering.

Pathway og netværk analyser genereres ved brug opfindsomhed Pathways Analysis (IPA) software bekræftede de fælles og adskilte store funktionelt relateret gen grupper, som viste sig at være differentielt udtrykt i SOR + CLX-behandlede HepG2 og Huh7-celler (figur 5). Især de bedste funktionelle veje nedreguleret i begge cellelinier var relateret til celle- cyklus, DNA-replikation, rekombination og reparation, lipidmetabolisme og lille molekyle biokemi (figur 5B og 5D), mens pathways associeret med celleudvikling og genekspression fandtes at blive almindeligt induceret (figur 5A og 5B). Veje relateret til celledød og cellevækst og proliferation blev begge inducerede og undertrykt i de to cellelinier, selv om, som forventet, i hver HCC cell line celledødsveje blev stærkere induceret end undertrykt (figur 5A-5D). De to HCC cellelinjer vises også nogle forskelle upon SOR + CLX behandling; således, pathways associeret med cellekonstruktion og organisation var overvejende nedreguleret i HepG2-celler (figur 5B), mens pathways funktionelt beslægtet med vitamin, mineral og aminosyremetabolismen meste nedreguleret i Huh7-celler (figur 5D). Følgelig pathways associeret med cellulær bevægelse, cellemorfologi, cellefunktion og vedligeholdelse og cellecyklus var stærkere opreguleret i HepG2-celler (figur 5A), hvorimod Huh7 celler udviste specifik opregulering af reaktionsveje relateret til kulhydratmetabolismen, molekylær transport, lille molekyle biokemi og DNA-replikation, rekombination og reparation (figur 5C).

et netværk analyse identificeret adskillige meget betydelige netværk med en score ≥3 der var ned- eller opreguleret i HepG2 og Huh7 celler ved kombineret SOR + CLX behandling. Som forventet, for både HCC cellelinier de fem bedste-scorer opreguleret netværk blev primært forbundet med funktioner i forbindelse med celledød og genekspression, mens de top-scoring nedreguleret netværk meste knyttet til cellecyklus og metabolisme (tabel S4 ). Også her hver af de to HCC-cellelinier viste nogle specificitet i netværk modulation: dermed for HepG2-celler, blev de fem-scorer opreguleret net meste forbundet med protein biosyntese og molekylær transport (tabel S4A), mens det for Huh7 celler, top-scoring opreguleret netværk var desuden knyttet til celle samling og organisation, celle funktion og vedligeholdelse og cellecyklus (tabel s4b). Funktionelle netværk koblet til DNA-replikation, rekombination og reparation blev specifikt undertrykt i HepG2-celler (tabel S4C), mens Huh7 celler udviste nedregulering af netværk tilknyttet til cellulær funktion og vedligeholdelse, RNA posttransskriptionel modifikation, cellulær samling og organisation, molekylær transport og immunrespons (tabel S4D).

fælles netværk, der genereres ved at samle de fire top-scoring netværk, der omfattede både ned- og op-regulerede gener (≤2 gange), erkendte nogle funktionelt beslægtede gen noder, var specifikt moduleret i de to HCC cellelinjer upon SOR + CLX behandling (figur 6 og 7). Især i HepG2-celler en række gen noder impliceret i cellecyklus kontrol og DNA-replikation, rekombination og reparation (herunder ERBB2, EPO, CCNE1, Cdc25A, CCNB1, BIRC5, NDC80, BUB1, PXN, KPNB1, KITLG, CDCA5, CDCA8 , TCF3, CDH1, CDKN3) var nedreguleret, mens gen-noder forbundet med celledød (herunder NMU, SOX4, EPAS1, S100P, IRS2, LCN2, IGFBP1, TRIB3, PHLDA2, AURKB) var hovedsagelig fremkaldt, med undtagelse af AURKB gen knudepunkt (figur 6). Gene noder specifikt nedreguleret i Huh7 celler omfattede en række cellecyklus og transskription regulatorer (CCND1, CCNE1, TCF3, FANCA, CENPF, FGFR3, ID1, ID2, ID3, MSX1 og medlemmer af NF-KB-kompleks), samt som gener involveret i RNA posttranskriptionel modifikation (CDKN2A, SREK, SRSF1), hvorimod opreguleret knudepunkter (herunder SP1, ATF3, SRSF1, BMP4, MSX1, KLF4, JMJD6) det meste forbundet med styring af celledød (figur 7) .

de fire top-scoring netværk er blevet slået sammen og vises grafisk som knudepunkter (gener /genprodukter) og kanter (de biologiske forhold mellem noder). Intensitet knudepunktet farve indikerer graden af ​​op- (rød) eller ned (grøn) -regulering. Nodes vises under anvendelse af forskellige former, der repræsenterer den funktionelle gruppe af genproduktet (firkant = cytokin; lodret oval = transmembrane receptor; rektangel = nuklear receptor; diamant = enzym; rombisk = transportør; sekskant = oversættelse faktor; vandret oval = transkriptionsfaktor; cirkel = andet). Kanterne vises med forskellige mærker, der beskriver karakteren af ​​forholdet mellem knudepunkterne: –

kun bindende

, →

virker på

. Længden af ​​en kant afspejler dokumentation for, at node-til-node forholdet og kanter, der understøttes af artikler fra litteraturen er kortere. Stiplede kanter repræsenterer indirekte interaktion.

De fire top-scoring netværk er blevet slået sammen og vises grafisk som knudepunkter (gener /genprodukter) og kanter (de biologiske forhold mellem noder). Figur legender er som beskrevet i figur 6.

Validering af Microarray Resultater med Semi-kvantitativ RT-PCR (sqrt-PCR) og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)

For at validere vores microarray resultater, vi vilkårligt udvalgt 13 differentielt udtrykte gener efter kombinationsbehandling. Nogle af disse gener blev tidligere rapporteret at være påvirket af sorafenib og ved celecoxib og er involveret i reguleringen af ​​apoptose, ER stressrespons, DNA beskadigelse respons, celleproliferation og invasion. Disse gener inkluderet BIRC5 (survivin), cyclin D1 (CCND1), Harakiri (HRK), DNA-skader-inducerbare transkriptionsfaktor 3 (DDIT3, også kendt som GADD153 eller CHOP), Tribbles-relaterede protein 3 (TRIB3, også kendt som TRB3 ), metallothionein 2A (MT2A), La ribonucleoprotein domæne familiemedlem 6 (LARP6), Ja-associeret protein 1 (YAP1), fedtsyre-bindende protein 1 (FABP1, også kendt som lever-typen fedtsyre-bindende protein, L- FABP), og Dickkopf 1 (DKK1). Desuden at ekspression af nogle andre gener nylig rapporteret inddrages i hepatocarcinogenese, såsom Klotho-beta (KLB), fibroblastvækstfaktor 19 (FGF19), fibronectin type III domæne-holdige 3B (FNDC3B), blev også analyseret. Genekspression blev kvantificeret ved sqrt-PCR og i nogle tilfælde ved QRT-PCR i kontrol og i behandlede celler. sqrt-PCR og QRT-PCR analyser blev udført i prøver tidligere blev anvendt til de microarray eksperimenter derefter gentaget under anvendelse af RNA ekstraheret fra to andre forskellige eksperimenter. Tabel 3 viser genekspression målinger af alle de validerede gener.

Validering af Microarray Resultaterne med Western blotting

Microarray data viste, at genet, som koder for survivin (BIRC5) var signifikant ned