PLoS ONE: LIV-1 Fremmer prostatakræft Epithelial-til-Mesenchymale Overgang og Metastase gennem HB-EGF Kaste og EGFR-medieret ERK Signaling

Abstrakt

LIV-1, en zink transportør, er et effektormolekyle nedstrøms fra opløselige vækstfaktorer. Dette protein er blevet vist at fremme epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) i human pancreas, bryst og prostata kræftceller. Trods konsekvenserne af LIV-1 i cancervækst og metastase, har der ikke været undersøgelse for at fastlægge den rolle LIV-1 i prostatakræft progression. Desuden var der ingen klar afgrænsning af den molekylære mekanisme bag LIV-1 funktion i cancerceller. I denne meddelelse, fandt vi øget LIV-1-ekspression i godartet, PIN, primær og knogle metastatisk menneskelig prostatakræft. Vi kendetegnet den mekanisme, hvormed LIV-1 drev human prostatacancer EMT i en androgen-ildfast prostatacancerceller (ARCaP) prostatacancer knoglemetastaser model. LIV-1, når overudtrykt i ARCaP

E (afledte celler ARCaP med epitelial fænotype) celler, forfremmet EMT irreversibelt. LIV-1 overudtrykt ARCaP

E celler havde forhøjede niveauer af HB-EGF og matrixmetalloproteinase (MMP) 2 og MMP 9 proteolytisk enzym aktiviteter, uden at påvirke intracellulær zink koncentration. Aktiveringen af ​​MMP’er resulterede i afgivelse af heparinbindende-epidermal vækstfaktor (HB-EGF) fra ARCaP

E-celler, som fremkaldte konstitutiv epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) phosphorylering og dens nedstrøms ekstracellulært signal reguleret kinase (ERK) signalering. Disse resultater antyder, LIV-1 er involveret i prostatakræft progression som et intracellulært mål for vækstfaktorreceptor signalering som fremmede EMT og cancermetastase. LIV-1 kunne være en attraktiv terapeutisk mål for udryddelse af allerede eksisterende menneskelige prostatakræft og knogle og blødt væv metastaser

Henvisning:. Lue HW, Yang X, Wang R, Qian W, Xu RZH, Lyles R, et al. (2011) LIV-1 Fremmer prostatakræft Epithelial-til-Mesenchymale Overgang og Metastase gennem HB-EGF Kaste og EGFR-medieret ERK Signaling. PLoS ONE 6 (11): e27720. doi: 10,1371 /journal.pone.0027720

Redaktør: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, USA

Modtaget: Juni 22, 2011; Accepteret: 23. oktober 2011; Udgivet: November 16, 2011

Copyright: © 2011 Lue et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af forskningsbevillinger 2PO1CA098912 og 5RO1CA122602 (LWKC) af National Institutes of Health /National Cancer Institute (https://www.nih.gov) og W81XWH-07-0172 (LWKC) af det amerikanske forsvarsministerium i USA (https://cdmrp.army.mil/pcrp). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

LIV-1, et celleoverfladeprotein, og en kandidat mediator af vækstfaktoren-fremkaldt signalmolekyle, er blevet forbundet med flere vigtige biologiske processer ved at tjene som en transportør for zink og andre ioner [1], [ ,,,0],2], [3], [4], [5]. Som en prototype af LIV-1 underfamilie af ZIP metal transportører [5], [6], LIV-1 aktier sekundær struktur med lynlås transportører og kan have evnen til at transportere metalioner. LIV-1 viste sig at være en mediator nedstrøms signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3) og sneglen, der samvirker med sneglen i undertrykkelsen af ​​epitelial markør E-cadherin (E-cad) gentranskription [7]. LIV-1 viste sig også at være et interagerende partner for østrogenreceptoren (ER) i hormon-følsomme væv [3], [8]. I ER-positive ZR-75-1 brystcancercellelinje, er LIV-1 transskription induceres af østrogener [9]. I brysttumorer, er LIV-1-ekspression er forbundet med ER status [10], [11], og er positivt korreleret med spredning af kræft til regionale lymfeknuder [12]. I livmoderhalskræft, ekspression af LIV-1 viste sig at være højere i tumoren end normalt væv; RNAi-medieret suppression af LIV-1 inhiberede signifikant celleproliferation, kolonidannelse, og reducerede vandrende og invasive evne til HeLa-celler [13]. LIV-1 er også blevet rapporteret at være forhøjet i klinisk pancreas carcinom og induceret EMT i bugspytkirtelkræftceller [14]. I zebrafisk, LIV-1 er afgørende for den nukleare lokalisering af Snail, en mester transkriptionsfaktor fremme epitelial til mesenkymale overgang (EMT), der forårsager migration af gastrula organisere celler [15]. LIV-1 er således en obligatorisk co-faktor, der regulerer EMT-associerede gener [14], [15], [16].

Den potentielle diagnostiske og prognostiske værdi af LIV-1 i human prostatacancer har ikke været undersøgt. Da zink spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af ​​prostata epitelcelle homeostase [17], og Sneglen er en central transkriptionsfaktor kontrollerende prostatacancercelle EMT [18], [19], [20], LIV-1 kan være en aktiv deltager i fremme af EMT under prostatakræft progression og knoglemetastaser. I denne undersøgelse bestemte vi niveauet for LIV-1 i human prostatacancer-cellelinier og vævsprøver kliniske at definere forholdet mellem LIV-1 og prostatakræft progression og metastase. Den ARCaP human prostatacancer progression celle model blev brugt til at evaluere rollen LIV-1. Vores undersøgelse viste, at LIV-1 overekspression fremmer prostatacancercelle EMT og letter metastaser til knogler og blødt væv. Yderligere mekanistisk undersøgelse viste, at LIV-1 overekspression kunne opregulere HB-EGF og MMP2 og MMP9 udtryk. Sidstnævnte kunne enzymatisk spalter membranbundne HB-EGF, til at producere opløselige HB-EGF som konstitutivt aktiveret EGFR via øget EGFR phosphorylering og dens downstream ERK signalering. Resultaterne fra denne undersøgelse viser, at unormalt forøget LIV-1-ekspression er en markør for prostatacancer progression, og aktiveret LIV-1 er ansvarlig for konstitutiv aktivering af EGFR, som driver EMT. LIV-1 kunne være en attraktiv ny terapeutisk mål for hæmning af prostatakræft EMT og knogler og blødt væv metastaser.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle dyr arbejde blev gennemført i henhold til de relevante nationale og internationale retningslinjer, og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af Emory University School of Medicine (Permit nummer 254-2008).

cellelinjer og cellekultur

human prostatacancer ARCaP

E og ARCaP

M-celler (afledte celler af ARCaP med epitel- og mesenkymale fænotype, henholdsvis) blev etableret i vores laboratorium [21]. Cellerne blev dyrket i T-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS, Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). Humane embryoniske nyre HEK293-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i DMEM (Invitrogen) suppleret med 10% FBS. RPMI-1640 blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Alle dyrkningsmedier blev suppleret med penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml). Cellekulturer blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære suppleret med 5% CO

2.

Antistoffer og reagenser

Polyklonalt kaninantistof mod LIV-1 blev genereret i vores laboratorium. Kaniner blev immuniseret ved standard immunisering protokol med konjugeret peptid KLH-CPDHDSDSSGKDPRNS, svarende til resterne 146-161 af LIV-1-protein (GenBank accession nummer NM_012319). Blod blev taget 2 uger efter den fjerde boost og IgG blev oprenset og testet for specifik immunreaktivitet. Polyklonalt antistof mod E-cadherin (E-cad), monoklonalt antistof mod vimentin og phospho-EGFR-antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Monoklonalt antistof mod N-cadherin (N-cad) og EGFR var fra BD Transduktion Laboratories (San Diego, CA). Antistoffer mod p44 /42 MAP-kinase og de phosphorylerede isoformer var fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Monoklonalt antistof mod p-actin var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1) og transformerende vækstfaktor-β1 (TGF-β1) blev erhvervet fra Diagnostic Systems Laboratories (Webster, TX). Epidermal vækstfaktor (EGF) var fra R 5′-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3 ‘og 5′-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3′ til E-cad; ; 5’-CCATCACTCGGCTTAATGGT-3 ‘og 5′-GATGATGATGCAGAGCAGGA-3′ for N-cad; 5’-CGAAAGGCCTTCAACTGCAAAT-3 ‘og 5′-ACTGGTACTTCTTGACATCTG-3′ for sneglen; 5’-TGCCCGGCGGAATCTCCTGA-3 ‘og 5′-GATGCAGGAGGGAGCCCGGA-3’ for HB-EGF; 5’GCTGTCTGCGTGGTGGTGCT -3 ‘og 5’TGGTGTGGTGGGTCCAGGGC -3 “for EGF; og 5’-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3 ‘og 5′-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3’ for GAPDH. Reaktionerne blev initieret med 4 minutters inkubering ved 94 ° C, efterfulgt af 30 cykler ved 94 ° C i 30 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 1 minut. Reaktionen blev afsluttet med en 7 minutters forlængelse ved 70 ° C i 7 minutter. PCR-produkter blev visualiseret efter elektroforese gennem en 1,2% agarosegel og farvet ved ethidiumbromid (0,5 ug /ml).

Western blotting

celler ved 80% konfluens blev lyseret i en hel-celle lysisbuffer som tidligere beskrevet [22]. Lysaterne blev inkuberet på is i 30 minutter og centrifugeret ved 10.000 rpm ved 4 ° C i 10 minutter. Fra hver prøve, blev 35 ug protein i supernatanten opløst ved SDS-PAGE og blottet på en nitrocellulosemembran (BioRad, Hercules, CA), som blev blokeret i 5% skummetmælk i PBST (137 mM NaCl, 12 mM phosphat, 2,7 mM KCI og 0,1% Tween 20) ved stuetemperatur i 20 minutter og inkuberet med primært antistof ved 4 ° C natten over. Membranerne blev derefter vasket tre gange i PBST og inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Efter fem vaskninger i PBST, blev specifikke signaler detekteret ved at inkubere membranen med ECL-reagens (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Måling intracellulære koncentration af zink

To metoder blev anvendt til at bestemme intracellulær zink koncentration. At fremstille prøver til analyse total intracellulær zink ved induktivt koblet plasma massespektrometri (ICP-MS), dyrkede celler ved 80% konfluens blev trypsinbehandlet og vasket i PBS og derefter inkuberet i 300 pi 70% salpetersyre ved 37 ° C i 2 timer. Cellerne blev derefter anbragt i 2% salpetersyre og underkastet ICP-MS med et Varian instrument. En standardkurve blev genereret med serielle fortyndinger af zink instrument standarder. At fremstille prøver til analyse intracellulær labile zink ved fluorometrisk metode blev celler podet ved 3 x 10

5 celler per brønd i 6-brønds plader dagen før målingen. Cellerne blev ladet med 2 uM FluoZIN-3 AM (Invitrogen) i 1 time i Opti-MEM indeholdende 0,02% Pluronic F127 (Invitrogen). Efter vask i PBS blev de fyldte celler inkuberet i indikator-fri Opti-MEM i 30 min. Fluorescens af FluoZin-3 blev målt ved hjælp af et PE Victor

3 V pladelæser.

Scratch sårheling assay

ARCaP

M-celler transficeret forbigående med LIV-1 siRNA eller universal siRNA kontrol blev anvendt til bestemmelse vandringsadfærd. Cellerne blev forsigtigt og langsomt ridset med en 10 pi pipettespids hen over midten af ​​brønden 48 timer efter transfektion. Efter skrabe blev vel forsigtigt vasket to gange med medium for at fjerne løsrevne celler. Boringen blev efterfyldt med frisk medium. Billeder blev taget 48 timer efter at ridse. Flere over hver brønd blev dokumenteret, og blev udført tre uafhængige forsøg.

migration Trans-brønd og invasion assays

For at udføre en trans-brønd migration assay, 2,5 × 10

4 celler i det øverste kammer i 24-brønds transwell plader af 8 um porestørrelse (BD Biosciences) blev inkuberet i 16 timer i komplet medium, der blev tilsat til den nederste kammer. Celler blev derefter fikseret med formalin og farvet med 0,5% krystalviolet. De ikke-migrerede celler inde i kammeret blev fjernet ved pensling. Crystal violet for de migrerende celler blev solubiliseret i Sorensons buffer (0,1 M natriumcitrat og 50% ethanol, pH 4,2) og målt for absorbans ved OD

590. Invasionen assay blev udført under anvendelse af BD BioCoat Matrigel invasion kamre (BD Biosciences; 8 um porestørrelse). De samme procedurer som beskrevet ovenfor, blev anvendt, bortset fra filtrene blev præ-belagt med 100 pi Matrigel ved en 1:04 fortynding i RPMI-1640.

Vurdering af tumorigene og metastatiske potentialer

Den funktionelle roller LIV-1 i prostata tumordannelse og metastase blev vurderet som tidligere [23] rapporterede. For at vurdere lokal tumorvækst, 4 uger gamle athymiske hanmus (Ncr-nu /nu, National Cancer Institute, Frederick, MD) blev podet subkutant med ARCaP

E-celler (1 x 10

6 i 50 pi PBS) stabilt transduceret med LIV-1. Tumor dimension blev målt med en passer på dag 23, 32, 43, og 50 efter injektion, og tumorvolumen blev beregnet som længde x bredde x højde x 0,5236 [24]. For at vurdere kræft metastaser blev atymiske hanmus podet intracardiacally med ARCaP

E-celler (2 × 10

6 i 100 pi PBS) stabilt transduceret med LIV-1 til venstre ventrikler. Dyrene blev observeret i 4 måneder for udvikling af metastatiske læsioner. Knoglemetastaser blev registreret ved hjælp af røntgen røntgen og blødt væv metastaser blev bekræftet ved histopatologi

Immunhistokemi (IHC) af væv microarray (TMA)

De normale og syge prostata væv analyseret var fra.: 1) En skræddersyet TMA med normale prostata væv fra 4 raske mænd; matchet kræft, godartede, og PIN væv fra 12 prostata kræfttilfælde; matchede benigne og cancer væv fra 11 tilfælde; matchede PIN-kode og kræft fra en sag; godartet prostatahyperplasi (BPH) fra 2 tilfælde; og prostatakræft knoklet metastaser fra 3 prostata kræfttilfælde. 2) En skræddersyet TMA bestod af 47 knoglemetastaser væv fra 11 prostata cancer patienter. 3) Fire TMA’er hver indeholder 66 tilfælde af prostatakræft og godartede prostata lidelser (US Biomax. Rockville, MD).

IHC-protokollen for at vurdere genekspression er blevet rapporteret [22]. Kort fortalt blev prøver deparaffineret, rehydreret og underkastet antigen-genvinding. Efter endogen peroxidase blokering blev prøverne inkuberet med primært antistof ved 4 ° C natten over, efterfulgt af 30 minutters inkubering med DakoCytomation EnVision + HRP reagens. Signaler blev detekteret ved tilsætning af diaminobenzidin som chromogen og kontrastfarvning med hematoxylin. Pre-immunisering kaninserum tjente som negativ kontrol. IHC-farvning blev scoret af to forskere uafhængigt baseret på fire farvningsintensiteter fra 0 til +++ som tidligere rapporteret [22].

gelatinezymografi

Alle gelatinezymografi reagenser blev købt hos Invitrogen. Celler blev dyrket i serumfrit RPMI1640 medium i 24 timer og konditioneret medium blev opsamlet. Protein i mediet blev opkoncentreret med en AmiconUltracel 30 kDa filter (Millipore, Billerica, MA). Lige store mængder protein (10 ug /prøve) blev blandet med 2 x Novex Tris-glycin SDS-prøvebuffer, og fraktioneret på en 10% gelatine-gel under ikke-reducerende betingelser. Gelen blev derefter inkuberet ved 37 ° C i renaturering buffer i 30 minutter og i udviklingen af ​​buffer i 30 minutter. Endelig blev gelen farvet i SimplyBlue SafeStain, og bands repræsenterer gelatinase aktivitet MMP2 og MMP9 blev kvantificeret.

enzymmaerket assay (

ELISA

) for HB-EGF

Celler blev dyrket i serumfrit RPMI1640 medium i 24 timer. Konditioneret medium blev opsamlet og analyseret for koncentrationen HB-EGF med Human HB-EGF DuoSet ELISA-kit (R og 2) knoglemetastaser vs godartet, PIN, og primær lokaliseret kræft. Denne test svarer til parameterværdien t-test anvendes, når der kun er to grupper, der sammenlignes. Logistisk regression blev anvendt til at modellere sammenhængen mellem binære Gleason scorer som var inddelt i binære variabler af veldifferentieret (GI≤6) vs. moderat til dårligt differentierede (GI≥7) prostatacancer. SAS og Minitab blev anvendt i denne analyse.

Resultater Salg

human prostatacancer ARCaP celler etableret i vores laboratorium [21] kan let fremmes til at undergå EMT som respons på opløselige faktorer og matrixproteiner stede i tumoren mikromiljø [20], [25], [26], [27]. At belyse den molekylære mekanisme regulerer EMT blev epitel ARCaP

E analyseret for differentiel genekspression som respons på opløselige faktorer, i forhold til dens ARCaP

M modstykke, som udviste en mesenchymal fænotype. LIV-1 var en af ​​de differentielt udtrykte gener identificeret [27]. I den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi rollen som LIV-1 i reguleringen EMT i ARCaP celler til at vurdere den mulige mekanisme LIV-1 indsats til fremme af prostatakræft knogle og blødt væv metastaser.

LIV-1 var involveret i at fremme EMT i ARCaP celle model

Vi har tidligere rapporteret, at ARCaP

E-celler undergik EMT når de behandles med opløselige faktorer, herunder IGF-1, EGF, TGF-β1 og β-2-mikroglobulin (β -2 mio) [20], [25], [26], [27]. I den foreliggende undersøgelse, når ARCaP

E-celler blev behandlet med enten TGF-β1 eller IGF-1, blev en induktion af LIV-1-ekspression detekteres ved både RT-PCR og Western blotting analyser (figur 1A). Når forskellige koncentrationer af IGF-1 blev tilsat til induktion medium, blev reaktionsevne LIV-1-ekspression sig at være dosisafhængig (figur 1A). IGF-1-induceret LIV-1-ekspression i ARCaP

E-celler forekom samtidig med en omskifter af cellemorfologi og genekspression mod mesenchymal fænotype,

dvs.

, tabet af tæt klæbende polariseret epithelmorfologi at blive løst dispergeret fibroblastceller med forøget ekspression af N-cad og vimentin men nedsat ekspression af E-cad, kendetegnende tilbageholdt af polariserede epithelceller (figur 1b). Aktiveret LIV-1-ekspression syntes at opstå i takt med overgangen fra ARCaP

E til ARCaP

M, en ARCaP mesenkymale variant [21].

rolle LIV-1 blev vurderet ved dens ændrede ekspression under EMT. A, ARCaP

E-celler blev behandlet i 48 timer med vækstfaktorer til induktion EMT. RT-PCR og Western blotting blev brugt til at vise øget LIV-1-ekspression (venstre panel), og dosis reaktionsevne udtrykket (højre panel). B, Western blotting blev anvendt til at bekræfte EMT-lignende udtryksmæssige ændringer i den behandlede ARCaP

E-celler. C, mesenchymal celle-lignende ARCaP

M-celler blev udsat for siRNA knockdown for LIV-1-ekspression i 48 timer. RT-PCR og Western blotting blev brugt til at detektere udtryksmæssige ændringer, der afspejler tilbageførsel af EMT i de behandlede celler. D, Scratch sårheling og transwell invasion assays blev anvendt til at bestemme vandrende og invasive adfærd i siRNA behandlet ARCaP

M-celler. * Viser statistisk signifikans sammenlignet med con1 kontrol klonen (P 0,05). E, blev ARCaP

E-celler transficeret med LIV-1-ekspressionskonstruktion. RT-PCR og western blotting blev udført 48 timer efter transfektion for at detektere udtryksmæssige ændringer, der afspejler EMT-lignende begivenheder. GAPDH tjente som en intern kontrol for RT-PCR-reaktioner, og β-actin blev anvendt som en belastning kontrol i Western blotting.

For at definere den rolle, LIV-1 i medierende EMT, vi forbigående reduceret den LIV-1 niveau i mesenchymale-lignende ARCaP

M celler ved siRNA knockdown. ARCaP

M celler behandlet med specifikke LIV-1 siRNA viste markant reduceret LIV-1 udskrifter (figur 1C). Vigtigere, de behandlede celler viste reduceret ekspression af mesenchymale markører N-cad og snail, men forøget ekspression af E-cad-genet i både RT-PCR og Western blotting analyser (figur 1C). Desuden ARCaP

M celler behandlet med specifikke LIV-1 siRNA udstillet meget reduceret vandrende og invasive evne scratch sårheling og Transwell invasion assays (Figur 1D). Disse resultater antydede, at LIV-1-ekspression er associeret med EMT og faldt LIV-1-ekspression, der fører til mesenchymal til epitel overgang (MET), en tilbageførsel af EMT. Tilstedeværelsen af ​​LIV-1 viste sig at være nødvendig for opretholdelse af en mesenchymal fænotype.

Vi undersøgte dernæst, om forhøjet LIV-1 i de epiteliale-lignende ARCaP

E celler ville være tilstrækkelig til at indlede EMT, som bedømt ved molekylære analyser. Efter transient transfektion med en LIV-1-ekspressionskonstruktion, ARCaP

E-celler blev undersøgt ved både RT-PCR og Western blotting assays til ekspression af EMT-associerede markører. Den transficerede ARCaP

E celler vises markant forøget LIV-1-ekspression (figur 1E), ledsages af øget N-cad og Snail men en nedsat E-cad udtryk. Disse udtryksmæssige ændringer var i overensstemmelse med dem, der ses i vækstfaktor-fremkaldte EMT (figur 1B). Resultater fra LIV-1 siRNA knockdown og LIV-1 overekspression studier i ARCaP

M og ARCaP

E celler foreslog, at LIV-1 tjener en vigtig regulator af EMT i humane prostata kræftceller.

Produktion og karakterisering af polyklonale antistoffer mod humant LIV-1

for at vurdere, om LIV-1-ekspression er associeret med klinisk progression af human prostatacancer, vi rejste polyklonale antistoffer ved at immunisere kaniner med en KLH-konjugeret LIV-1 peptid. Specificitet af LIV-1-antistoffer blev bekræftet ved Western blotting af de helcelleekstrakterne fra celler, der overudtrykker eksogent LIV-1. Fra HEK293-celler transient transficeret med LIV-1, observerede vi en enkelt immun-reaktiv LIV-1-protein, ved 110 kDa (figur 2A). Da den beregnede molekylvægt af LIV-1-protein er 90 kDa [5], differentialet 20 kDa mellem den detekterede og de forudsagte størrelser blev sandsynligvis tilskrives N-koblet glycosylering af LIV-1-protein, som tidligere rapporteret [5]. Vigtigt er det, så er der detekteret af LIV-1-antistoffer signal afskaffes ved antistofferne blev præ-adsorberet med LIV-1 peptid, der anvendes i immunisering. Desuden blev forøget signalintensitet detekteret i ARCaP

E-celler transient transficeret med LIV-1-ekspressionskonstruktion, mens en reduktion af signalet blev set i ARCaP

M-celler behandlet med en transient LIV-1 Knockdown vektor i både Western blotting og IHC assays (figur 2B og 2C). Disse resultater viste, at de LIV-1 antistoffer produceret kunne specifikt detektere LIV-1-protein, som blev modificeret i de testede cellelinier.

De producerede antistoffer mod LIV-1 blev underkastet validering for specificitet. A blev HEK293-celler transient transficeret med LIV-1-ekspressionskonstruktion underkastet Western blotting-analyse med antistoffer mod LIV-1 (øvre panel). Antistofspecificitet blev bestemt ved præ-absorberende antistoffet med det immuniserende peptid (midterste panel). B, blev ARCaP

E-celler transient transficeret med LIV-1-ekspressionskonstruktion at overudtrykke LIV-1 og ARCaP

M-celler med det specifikke siRNA at undertrykke LIV-1-ekspression. I de øverste 2 paneler, blev Western blotting udført 48 timer senere med antistofferne mod LIV-1. I de lavere 2 paneler blev disse celler undersøgt ved RT-PCR for at bekræfte LIV-1-ekspression. β-actin blev anvendt som kontrol i Western blotting og GAPDH blev anvendt som kontrol for RT-PCR-analyse. C, IHC blev udført for yderligere at bekræfte LIV-1 Ab specificitet i ARCaP

E-celler transient transficeret med LIV-1-ekspressionskonstruktion og ARCaP

M-celler transient transficeret med det specifikke siRNA (200 ×).

Stabil LIV-1 overekspression induceret EMT i ARCaP

E celler

Efter forbigående knockdown af LIV-1 i ARCaP

M-celler, en forventet vending af mesenkymale fibroblastisk celle form til epithelmorfologi blev observeret. Disse morfologiske switche var let påviselige ved genekspression ændringer (figur 1C). I modsætning hertil forbigående overekspression LIV-1 i ARCaP

E celler inducerede ikke mesenchymale morfologiske overgang, trods samordnede udtryksmæssige ændringer, som indikerer i EMT (figur 1E). Vi mistænkes at manglen på morfologiske forandringer kan tilskrives arten af ​​den forbigående transfektion. Følgelig blev stabile ARCaP

E-kloner etableret for at evaluere, om LIV-1 er et kritisk regulator forbundet med morfologisk samt udtryksmæssige og adfærdsmæssige overgang fra en epitelial til en mesenchymal fænotype.

Vi isoleret 4 ARCaP

E kloner (LIV # 8, 12, 14 og 17), der stabilt udtrykker høje niveauer af LIV-1-protein som påvist ved Western blotting (figur 3A). To kontrolgrupper kloner (con1 og CON2) blev også isoleret fra transfektion med kontrolvektoren. Dem overudtrykker LIV-1 udviste typiske EMT-lignende udtryksmæssige forandringer, med nedsat E-cad-ekspression, men steg N-cad og sneglen udtryk (figur 3A). Betydeligt, viste alle kloner markant ændret cellulær morfologi: i stedet for den lille cellestørrelse med brosten-lignende form med stramt arrangeret intercellulær kontakt typisk for den epitelcelle-lignende ARCaP

E, alle fire kloner tilpasset bemærkelsesværdigt ændret morfologi viser et tab af intercellulær kontakt og typisk spindel-formet mesenchymal celle morfologi (figur 3B). Den morfologiske overgang var permanent og irreversibel, vedvarende efter mere end 30 passager i kontinuerlig kultur, mens de to vektor-transficerede kloner forblev epitelcelle-lignende. Det ser ud til, at stabil LIV-1 overekspression kunne frembringe både morfologiske og biokemiske EMT overgang. LIV-1 er således en potent promotor af EMT i ARCaP

E celler.

ARCaP

E-kloner overekspression LIV-1 vises EMT-lignende ændringer i genekspression, cellulære morfologi og adfærd. A, alle fire LIV-1 overekspression ARCaP

E kloner viste EMT-lignende udtryksmæssige ændringer som detekteret ved Western blotting, mens de to vektorkontrolceller kloner (1 og 2) bevaret en epitelcelle-lignende ekspressionsprofil. B, cellulære morfologi af LIV-1 overekspression celler viste markante ændringer fra kontrol- kloner (200 ×). C, Liv-1 overekspression celler (LIV # 8 og LIV # 14 blev sammenlignet med vektor kontrol kloner 1 og 2 og forældrenes ARCaP

E og ARCaP

M celler til ændret vandrende kapacitet i Transwell analyser. Hvert resultat er middel ± standardafvigelse for et tredobbelt analyse. D, den LIV-1 overudtrykkende # 8 og # 14 kloner blev sammenlignet med vektor kontrol kloner 1 og 2 og forældrenes ARCaP

E og ARCaP

M celler til ændret invasionsevne. * angiver statistisk signifikans sammenlignet med con1 kontrol klon (

P

0,05).

virkningerne af LIV-1 på adfærdsændringer blev vurderet for sin fremme af celle migration og invasion i Boyden kammer assays. Mens kontrol neo transficerede ARCaP

E-kloner viste lignende migration og invasion kapaciteter tæt efterligner de af forældrenes ARCaP

E celler, gentagne analyser afslørede, at LIV-1 overekspression tillagt signifikant øget vandrende kapacitet (figur 3C) og invasive potentiale til at trænge ekstracellulære matricer (figur 3D). Tilsammen understøtter disse data opfattelsen af, at øget LIV-1-niveauer fremmer motilitet og invasive adfærd af prostata kræftceller.

LIV-1 overekspression forfremmet prostata tumor dannelse og fjernmetastaser

in vivo

Vi undersøgte rolle LIV-1 stabilt udtrykt i ARCAP

E-celler i modulering efterfølgende tumorigene og metastatiske adfærd hos mus. Vi sammenlignede lokal og fjern metastatisk vækst ARCaP

E tumorer ved subkutan og intrakardielle tumorcelleinokulering protokoller som tidligere beskrevet [21], [23].

Efter subkutan implantation, LIV-1 overekspression kloner inducerede en lignende forekomst af tumordannelse til vektor-transficerede kontroller, hver gruppe har 6 tumorer fra i alt 8 podninger.