PLoS ONE: Omeprazol Forhindrer spredning og modulerer Autophagy i kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Baggrund

Omeprazol er for nylig blevet beskrevet som en modulator af tumor kemoresistens, selv om dens underliggende molekylære mekanismer forbliver kontroversiel. Da bugspytkirtlen tumorer er meget kemoterapi, ville et logisk skridt være at undersøge farmakodynamisk, morfologiske og biokemiske virkninger af omeprazol på bugspytkirtelkræft cellelinjer.

Metode /vigtigste resultater

Dosis-effekt kurver omeprazol, pantoprazol, gemcitabin, 5-fluorouracil og kombinationerne af omeprazol og 5-fluorouracil eller gemcitabin blev genereret for pancreas cancer cellelinjer MiaPaCa-2, aSPC-1, Colo357, PancTu-1, Panc1 og Panc89. De viste, at omeprazol hæmmede spredning på formentlig ikke-toksiske koncentrationer og vendes de hormesis fænomener af 5-fluorouracil. Elektronmikroskopi viste, at omeprazol førte til akkumulering af phagophores og tidlige autophagosomes i ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler. Signalændringer indikerer inhiberede proliferation og programmeret celledød blev fundet ved proton-NMR-spektroskopi af begge cellelinier, når de behandles med omeprazol, som blev identificeret intracellulært. Omeprazol modulerer lysosomale transportvej som vist ved Western blot-analyse af ekspressionen af ​​LAMP-1, Cathepsin-D og β-COP i lysosome- og Golgi kompleks indeholdende cellefraktioner. Acridinorange-farvning afslørede, at pumpefunktion af vATPase ikke specifikt inhiberet af omeprazol. Genekspression af autofagi-relaterede LC3 gen samt for Bad, MDR-1, blev Atg12 og vATPase analyseret efter behandling af celler med 5-fluoruracil og omeprazol og bekræftede de ovennævnte resultater.

Konklusioner

Vi hypotese, at omeprazol interagerer med de regulatoriske funktioner vATPase uden at hæmme dens pumpefunktion. En graduering af det lysosomale transport vej og autofagi skyldes i bugspytkirtelkræftceller fører til programmeret celledød. Dette kan omgå almindelige resistensmekanismer af kræft i bugspytkirtlen. Da der allerede er etableret omeprazol brug i klinisk praksis disse resultater kan føre til nye kliniske anvendelser

Henvisning:. Udelnow A, Kreyes A, Ellinger S, Landfester K, Walther P, Klapperstueck T, et al. (2011) omeprazol Forhindrer spredning og modulerer Autophagy i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 6 (5): e20143. doi: 10,1371 /journal.pone.0020143

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: November 24, 2010; Accepteret: April 26, 2011; Udgivet: May 24, 2011

Copyright: © 2011 Udelnow et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af relevant progression i diagnose, resektion og kemoterapi, pancreascancer er associeret med en kort overlevelse [1]. Konstitutiv proliferation og dyb resistens over for apoptose er karakteristiske træk ved pancreatiske tumorceller gør dem meget modstandsdygtige over for almindelige kemoterapeutiske strategier. Adskillige mekanismer er ansvarlige for apoptose resistens er rapporteret herunder nedregulering af proapoptotiske proteiner, opregulering af antiapoptotiske proteiner [2], [3], aktivering af forskellige kinaser, såsom proteinkinase C (PKC) /proteinkinase D1 (pKD1) og casein kinase 1 (CK1) [4] – [6], forhøjet ekspression af forskellige microRNAer [7], p53-mutationer og polymorfier MDM2 [8]. Derfor identifikation af stoffer, der er i stand til at omgå disse mekanismer vil være værdifulde.

For nylig, omeprazol (OMP), etableret som en verdensomspændende standard lægemiddel til gastritis og sår på tolvfingertarmen siden 1980’erne, er blevet beskrevet som en potentielle antiproliferative middel og en modstand modulator både in vitro og in xenotransplantattumorer af mus [9], [10]. Yderligere forskning har antydet, at inhibering af vakuolær protonpumpe (vATPase), som regulerer den lysosomale pH, eller akkumulering inden lysosomerne kan være de førende mekanismer til sensibilisering celler dybt cytostatisk behandling [9] – [12]. Desuden dannelse af reaktive oxygenarter [9] og involvering af p38 MAPK [13] er blevet rapporteret at være associeret med OMP-inducerede cellulære virkninger. Endvidere P-glycoprotein (Pgp) [14] og cytochrom P450 2C19 isoform [15] årsag farmakokinetiske interaktioner af OMP med andre lægemidler (dvs. antibiotika, barbiturater, cytostatika), som er af klinisk relevans. Disse data hidtil pege på komplekse mekanismer involverer bl.a. den lysosomale transportsystem. Debatten om, hvorvidt og hvordan OMP kan hæmme kræft cellevækst og forbedre cytostatiske effekter af cytostatika er i gang.

Til dato, hverken selve lægemidlet eller nogen af ​​sine mål har været direkte observeret inden for kræftceller. Der er også stort set ingen data, der beskriver dosis og virkning af OMP i tumorceller. Det ville være af stor interesse, om dette stof er effektiv i klinisk relevante koncentrationer. Endvidere så vidt vi ved, OMP endnu ikke blevet anvendt i bugspytkirtelkræft behandling, selv om data fra patienter med Zollinger-Ellison-syndrom viser, at OMP har et bredt terapeutisk område og forårsager kun sjældne og milde bivirkninger selv ved højere doser [ ,,,0],16]. I modsætning hertil andre modstand modulatorer såsom verapamil [17] eller bafilomycin [18] er for giftige til klinisk brug.

I betragtning af den høje kemoresistens af pancreas tumorceller, en af ​​de vigtigste mål med vores undersøgelse var at bestemme om OMP ville være effektiv i bugspytkirtelkræft cellelinjer. Derfor undersøgte vi de en- og todimensionale dosis-effekt relationer OMP alene eller i kombination med 5-fluorouracile (5-FU) eller gemcitabin (GEM) i de godt karakteriserede humane bugspytkirtelkræft cellelinjer MiaPaCa-2, ASPC-1 , Colo357, Panc1, Panc89 og PancTu1 in vitro [19] – [21]. Vores resultater viser, at den gennemsnitlige hæmmende koncentrationer (IC

50) af OMP var i intervallet kliniske anvendelighed i disse cellelinjer.

For de yderligere undersøgelser, vi brugte de to cellelinjer MiaPaCa-2 og aspC -1, og ved siden af ​​OMP, den cytostatiske 5-FU for at vurdere specificiteten af ​​virkningerne OMP årsager i disse cellelinier.

Vi undersøgte de subcellulære og molekylære ændringer i MiaPaCa-2 og ASPC- 1-celler behandlet med OMP. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) og H NMR-spektroskopi af levedygtige celler (H-NMRS) blev udført. Vi fandt, at modulering af autofagi er en tidlig effekt af OMP. Endvidere analyse af subcellulære fraktioner indeholdende lysosomer og Golgi komplekser ved Western blot-analyse og NMR-spektroskopi i ubehandlede og behandlede MiaPaCa-2-celler bekræftede, lysosomer er den vigtigste intracellulære mål for OMP fører til virkninger på protein genbrug og transportveje, herunder Golgi komplekset . Salg

Vores resultater viser, at OMP hæmmede væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller på en dosis-afhængig måde og sandsynligvis på ikke-toksiske koncentrationer in vitro. OMP øger også effekten af ​​5-FU og GEM. Den lysosomale transport vej ændres på OMP behandling og autophagy er direkte eller indirekte, moduleret. Således kan OMP tilvejebringe en ny terapeutisk indfaldsvinkel til behandling af pancreascancer.

Resultater

OMP inhiberer bugspytkirtelkræft celleproliferation på en dosisafhængig måde og forbedrer cytostatiske virkninger af GEM og 5- FU

dosis-effekt-kurver for OMP, pantoprazol (PZL), GEM og 5-FU blev dannet ved anvendelse af ATP-bioluminscensassayet. Et af formålene med vores undersøgelser var at evaluere den kliniske anvendelighed OMP. Derfor bestemmes vi IC

50ies ved at montere kurverne til en tre-parameter log-logistisk model. IC

50, anført i tabel 1, var i området fra 9-42 ug /ml for OMP, 22-99 pg /ml for PZL, 0.004-0.24 ug /ml for perle og 0.20-0.57 ug /ml for 5- FU afhængigt af cellelinjen.

Disse dosis-effekt-kurver (figur 1) viste gradvise forskelle i sigmoidicity og andre farmakodynamiske parametre. Det er indlysende, at celletallet i lavere koncentrationer af lægemidler kan være endnu højere end i den respektive kontrolgruppe (værdier over 1 i figur 1), hvilket viser en vækststimulerende virkning. Dette fænomen, der kaldes hormesis, der er defineret som en overcompensatory respons på levende organismer til forskellige stressfaktorer [22], kan tegne sig for resistensudvikling under kemoterapi [23].

ASPC-1, MiaPaCa-2, Colo -357, Panc-1, Panc-89 og PancTu-1-celler blev dyrket i fravær eller nærvær af de angivne koncentrationer af omeprazol, 5-fluorouracile, pantoprazol eller gemcitabin, henholdsvis i 4 dage for at bestemme IC

50 værdier. IC

50 erne og sigmoidicities gradvist afvigende mellem cellelinjer. I lavere koncentrationer blev observeret en svag vækst-stimulerende virkning (hormesis).

Derfor undersøgte vi effekten af ​​OMP når det kombineres med et cytostatisk i lavere koncentrationer for at evaluere sin rolle i kemoresistens og hormesis overvinde . Additive, synergistiske eller antagonistiske gensidige interaktioner mellem to lægemidler kan kvantificeres i quasilinear region dosis-effekt-kurver ved hjælp af median effekt princippet om Chou [24] eller samlet reaktion overfladeareal af Greco et al. [25]. Men samspillet mellem kombination stof er vanskeligt at kvantificere for hormetic dosis-respons-relationer [26]. Der er forskellige modeller til at vurdere hormesis for en enkelt behandling lægemiddel [27], [28].

Tabel 2 viser upåvirket fraktion (f

u), som er den celletal relateret til kontrol efter lave koncentrationer af 5-FU og GEM, når de anvendes som enkelte midler. I ASPC-1, Panc-1 og PancTu-1 celler signifikante stigninger i den f

u over 1 upon 5-FU, hvilket indikerer hormesis, blev observeret. I modsætning var der ingen signifikant hormesis på GEM. Når OMP sættes til 5-FU i disse koncentrationer er hormesis afbødes i ASPC-1, Panc-1 og PancTu-1 cellelinjer (figur 2). I MiaPaCa-2-celler OMP og 5-FU kombination viste additiv effekt, i Panc-89 cellelinien OMP førte til en antagonistisk interaktion. I Colo357 celler kunne fastsættes nogen dosis-effekt-kurve på grund af store standardfejl. GEM og OMP viste additive eller antagonistiske interaktioner (data ikke vist).

De cellelinier ASPC-1, MiaPaCa-2, Colo357, Panc-1, Panc89 og PancTu1 var ubehandlet eller behandlet med 5-FU alene eller i kombination med de angivne koncentrationer af OMP i 4 dage. Ved lavere doser af 5-FU alene (sorte streger, 0 pg /ml OMP) blev en vækst-stimulerende virkning (hormesis) observeret i cellelinierne aspC-1, Panc-1 og PancTu-1. Datapunkterne viser midlerne til 8 målinger. Kurverne er monteret i disse cellelinjer ved hjælp af Brain-Cousens model (se underafsnit 4.11). I MiaPaCa-2 og Panc-89-celler ikke hormese opstod, disse kurver blev tilpasset ved anvendelse af en tre parameters logistisk model. I Colo357 celler kurverne ikke kunne monteres af enhver farmakodynamisk model på grund af store standardafvigelser ved disse lavere koncentrationer (datapunkter vist). De røde, grønne og blå linjer angiver dosis-effekt-kurver for 5-FU, når forskellige koncentrationer af OMP blev tilsat (10, 20 og 40 ug /ml). I ASPC-1 og Panc-1-celler i hormesis af 5-FU blev vendt, og i PancTu-1 celle blev dæmpet af OMP afhængig af koncentrationen af ​​5-FU. I MiaPaCa-2-celler fandt vi en additiv vekselvirkning af 5-FU med OMP. I Panc-89 celler interaktionen var antagonistiske.

Således OMP har en dosisafhængig antiproliferativ virkning og in vitro IC støtter

50 af OMP i disse hypotesen om kliniske anvendelighed (som behandles nærmere i afsnittet diskussion). Men den dosis og virkning af lægemidlerne varierede mellem cellelinier. Den kombinerede behandling af OMP med enten 5-FU eller GEM afslørede dosisafhængige additive interaktioner og en begrænsning af den hormetic vækst stimulering af lavdosis 5-FU i ASPC-1, Panc1 og Panc89 celler. .

cellelinie specifikke ændringer i intralysosomal pH efter behandling af pankreatiske cancerceller med OMP og 5-FU, enten alene eller i kombination

Acridin orange (AO) fluorescensmikroskopi blev udført for at bestemme, om OMP øger intralysosomal pH som beskrevet i nylige, enten ved at inhibere vATPase [10] eller ved at akkumulere inden lysosomerne [11]. Sure celle rum er farvet røde og neutrale rum er farves grønt af AO. Specifik hæmning af vATPase af bafilomycin A1 har vist sig at føre til en hurtig hæmning af den røde fluorescens [29], [30].

De røde-til-grøn fluorescens nøgletal kvantificeres ved kvantitativ billedanalyse for MiaPaCa -2 og aspC-1 celler er vist i figur 3. De tidlige ændringer (efter 30 minutters behandling) bestod af en lidt højere surhedsgrad på 5-FU behandling i MiaPaCa-2-celler og i aSPC-1 celler behandlet med OMP eller OMP + 5-FU. Efter 24 timer var lysosomale surhedsgrad MiaPaCa-2-celler blev gradvist, men betydeligt undertrykt af OMP, 5-FU og OMP + 5-FU. Men disse observation ikke utvetydigt svarer til de ovennævnte rapporter, da virkningen ikke var specifikt for OMP. I aspC-1-celler, alle tre behandlingsplaner resulterede i et lidt højere surhedsgrad efter 24 timer.

Acridin Orange blev tilsat til levende ubehandlede ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler og celler behandlet med 5-FU, OMP eller kombinationen af ​​begge i 30 minutter eller 24 timer. Mikroskopisk liv billeder blev taget ved 525 nm (grøn) og 650 nm (rød) til at registrere ændringer i lysosomale pH-værdi (tre billeder per plade, tre plader per gruppe). Den rød til grøn fluorescens forholdet lysosomerne af behandlede celler blev sammenlignet med kontrolgrupperne ved Mann-Whitney-U-test. Betydelige forskelle i forhold til kontrol er markeret med *. I ASPC-1 celler, efter 30 min af behandling, øget intralysosomal surhedsgrad efter behandling med OMP (p: 0,0051) og 5-FU + OMP (p 0,0001). Efter 24 timer, er surhedsgraden øges på alle behandlingsregimer (5-FU – p: 0,0002; OMP – p 0,00001; OMP + 5-FU – p: 0,037). I MiaPaCa-2-celler surhedsgraden er forhøjet efter 30 min ved 5-FU (p: 0,005) og faldt efter behandling med OMP (p: 0,037), 5-FU (p: 0,00026) og 5-FU + OMP (p: 0,011) efter 24 timer.

konkluderer vi derfor, at OMP ikke forårsagede en konsekvent ændring i intralysosomal pH-værdi bugspytkirtelkræftceller. Alligevel en svag hæmning opstod i MiaPaCa-2-celler ved alle behandlingsregimer efter 24 timer. I modsætning hertil viste ASPC-1 celler en højere lysosomal surhed, når de behandles med OMP, 5-FU eller en kombination af begge.

Phagophores og autophagosomes ophobes i ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler efter OMP behandling

Indtil videre vores resultater tyder på, at vATPase hæmning og lysosomal pH elevation ikke var de vigtigste virkninger forårsaget af OMP i MiaPaCa-2 og ASPC-1 cellelinjer. AO fluorescensmikroskopi viste dog, at lysosomer var involveret i både OMP- og 5-FU-medieret inhibering af proliferation. Derfor undersøgt vi de subcellulære morfologiske ændringer efter behandling med OMP, 5-FU og kombinationen af ​​både TEM.

Figur 4 sammenligner en ubehandlet ASPC-1 celler (figur 4 A) med celler behandlet med 160 ug /ml (figur 4B) og med 80 ug /ml OMP (figur 4C) i 24 timer. Behandling med 80 ug /ml OMP resulterede i autophagy som indikeret ved forekomsten af ​​tidlige koplignende phagophores indeholdende cytoplasmatiske materiale og autophagosomes fyldt med coatede vesikler (figur 4C). Efter behandling med 160 ug /ml OMP, de ASPC-1 celler undergik apoptose efter 24-48 timer (figur 4B). Der blev observeret lignende ændringer i MiaPaCa-2-celler behandlet med 80 ug /ml OMP herunder vakuolisering som en ledsagende tegn på apoptose (figur 4D).

(A) ASPC-1 celler uden behandling (800 gange). (B) ASPC-1 celler undergår apoptose ved 160 ug /ml OMP efter 24 timer (800 gange). Vakuolisering af cytoplasmaet og kondensation af kernen er synlige. (C) Phagophores og autophagosomes i et segment af en ASPC-1 celler behandlet med omeprazol 80 ug /ml i 24 timer (2800fold udvidelse). De phagophores er kendetegnet ved en koplignende form (hvide pile). Autophagosomes er lukkede partikler, hvis antal er steget i behandlede celler (sorte pile). (D) Tidlige phagophores og autophagosomes findes også i MiaPaCa-2-celler behandlet med OMP 80 pg /ml efter 24 timer i en perinukleær region indeholdende lysosomer og Golgi komplekset. I modsætning til ASPC-1 celler, tidlige tegn på apoptose såsom vakuolisering, er også til stede. (E) barchart over antallet af autophagosomes og lysosomer per celle i MiaPaCa-2 og ASPC-1 celler ubehandlede eller behandlet med 5-FU, OMP eller kombinationen af ​​begge i 24 timer med standardfejl. Betydelige forskelle i forhold til kontrol er markeret med *. I ASPC-1 celler der var signifikante forskelle i sammenligning med kontrolgruppen i OMP (p: 0,03) og 5-FU + OMP gruppen (p: 0,03). I MiaPaCa-2 celler 5-FU + OMP gruppe adskilte sig væsentligt fra kontrol (p 0,001).

Selvom phagophores let blev identificeret ved unikke morfologiske egenskaber, autophagosomes, lysosomer, endosomer og autolysosomes kunne ikke skelnes ved TEM. Signifikant højere mængder af alle disse lysosomer-lignende organells blev observeret i aspC-1 celler behandlet med OMP eller OMP + 5-FU og i MiaPaCa-2-celler behandlet med OMP + 5-FU (fig 4E).

sammenfattende OMP førte til akkumulering af markører for tidlige stadier af autofagi (autophagophores) i begge cellelinier. Selvom markører for senere stadier, såsom autolysosomes og kunne ikke skelnes morfologisk fra andre lysosomale transportveje, det samlede antal lysosomer-lignende organeller steg i aspC-1-celler efter behandling med OMP eller 5-FU + OMP og i MiaPaCa-2 celler behandlet med 5-FU + OMP. Disse resultater tyder på, at enten aktivering af omsætningen proteinet eller forringelse af det lysosomale transportvej indtraf.

Identifikation af metaboliske ændringer inden levedygtige celler efter behandling med OMP, 5-FU eller en kombination af begge

Proton-NMR-spektroskopi af levedygtige celler blev udført i MiaPaCa-2 og ASPC-1 cellelinier for at analysere de biokemiske processer, der er forbundet med de morfologiske ændringer beskrevet ovenfor. Forskellige karakteristiske lavmolekylære intracellulære metabolitter, såsom fedtsyrer, aminosyrer, membranassocierede phospholipid mebolites og mellemliggende citrat cyklus og glycolyse metabolitter blev identificeret (figur 5).

Cellerne blev høstet fra monolagskultur, holdes og måles ved 20 ° C. Måling blev udført af en 600 MHz Bruker-spektrometer. For bedre synlighed den del af spektret viser protoner i alifatiske grupper er splittet i 2 dele – A og B. (A). alifatisk del I. methyl og p- og y- methylengrupper af forskellige fedtsyrer og aminosyrer er synlige. Desuden isopropanol og tetrachlorethan (den eksterne koncentration standard) opstod som forureninger. (B) Alifatiske del II. Phospholipid metabolitter og a-methylen grupper af aminosyrer og lactat er synlige. (C) Formel for OMP med nummerering af de respektive protoner. Methylgrupperne (1-3, 9) og methylgruppen (4) er dækket af andre metabolitter i de alifatiske dele af spektret. Derimod har de aromatiske protoner er synlige (H5, H8, H10). (D) overlejring af de aromatiske dele af forskellige spektre til intracellulær identifikation af OMP. Den singulet af H5 proton og dublets af H8 og H10 protoner kan identificeres, når mediet og cellen spektre sammenlignet med dem uden OMP behandling. Forkortelser: His – histidin, Tyr – tyrosin, Phe – phenylalanin, Leu, Ile, Val – leucin, isoleucin, valin. Ala – alanin. Glu – glutamat, Gin – Glutamin, PC – phosphatidylcholin, Cho – Cholin, GPC – glycerophosphocholine, Tau – taurin, scyllo -. Scylloinositole

OMP selv blev opdaget intracellulært inden begge cellelinier efter behandling med 80 ug /ml i 24 timer. Signalerne fra de aromatiske H8 og H10 protoner af OMP (figur 5C) blev let identificeret (figur 5D) i MiaPaCa-2-celler. OMP blev også identificeret inden ASPC-1 celler ved H5 proton (data ikke vist). Så vidt vi ved, er dette den første gang, at OMP er blevet observeret i cellerne.

Selvom bestemmelse af absolutte intracellulære koncentrationer ved NMR-spektroskopi er generelt udsat for systematiske fejl, kan beregningen af ​​integrale forhold mellem forskellige signaler indeholde nyttige kvantitative oplysninger om de metaboliske veje. Disse metaboliske veje er vist som en stærkt forenklet netværk for ASPC-1 celler i figur 6 og MiaPaCa-2-celler i figur 7. En linie mellem to signaler symboliserer en metabolisk vej. Linjen er orange, når signalintensiteten forholdet mellem de forbundne stoffer afviger fra kontrollen med p. 0,05 og rød når p er under 0,01

ASPC-1-cellelinien er vist uden og efter forskellige behandlingsregimer ( OMP, 5-FU eller 5-FU + OMP kombination). Knudepunkterne i netværket symboliserer metabolit signaler, deres farver svarer til relativ signalintensitet (sammenlignet med en ekstern standard) som angivet i Heatmap skala nedenfor. Signalintensiteten er lineært relateret til den intracellulære koncentration. Baggrunden for knudepunkterne er tomt, når signalintensiteten er uden for området indikeret ved Heatmap skala. Linjerne mellem kasserne symboliserer stærkt forenklet metaboliske veje. Farverne i disse linier angiver signifikante forskelle af signalintensiteten forholdene mellem de tilsluttede metabolitter sammenlignet med kontrolgruppen, når orange (p 0,05), røde linier angiver p 0,01. De mest åbenlyse ændringer er, at PC /Cho forholdet er signifikant lavere i OMP-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen. Ved 5-FU, Cho /acetat-forholdet fald er den eneste væsentlige ændringer. I 5-FU + OMP gruppe, er der flere væsentlige ændringer, i.e.the FACH2 /CH = CH-forholdet er væsentligt højere. Endvidere ændrede Cho /acetat-forhold på 5-FU + OMP som i 5-FU-gruppen, men også den citrat /GSH-forhold. De cellulære biokemiske virkninger involverer hovedsagelig fedtsyren og phospholipidmetabolisme peger til membran anabolisme. Forkortelser: Gin – glutamin, Ala – alanin, PC – phosphatidylcholin, Cho – cholin, Lac1 + FACH2 – methylgruppe signal af lactat og methylengrupper fedtsyrerne, lac2 – methylengruppe af lactat, CH = CH – protoner i methin grupper af umættede fedtsyrer.

cellelinien er vist uden og efter forskellige behandlingsregimer (OMP, 5-FU eller 5-FU + OMP kombination). Knudepunkterne i netværket symboliserer metabolit signaler, deres farver svarer til relativ signalintensitet (sammenlignet med en ekstern standard) som angivet i Heatmap skala nedenfor. Signalintensiteten er lineært relateret til den intracellulære koncentration. Baggrunden for knudepunkterne er tomt, når signalintensiteten er uden for området indikeret ved Heatmap skala. Linjerne mellem kasserne symboliserer stærkt forenklet metaboliske veje. Farverne i disse linier angiver signifikante forskelle af signalintensiteten forholdene mellem de tilsluttede metabolitter sammenlignet med kontrolgruppen, når orange (p 0,05), røde linier angiver p 0,01. Efter OMP, PC /Cho forhold er signifikant lavere sammenlignet med kontrol. Endvidere acetatet /FACH2-forholdet faldt betydeligt i OMP-gruppen. Sidstnævnte viste også en højere CH = CH-niveau, er forholdet til FACH2 er imidlertid faldet. Ved 5-FU og 5-FU + OMP, kunne observeres lignende ændringer. Derudover, i modsætning til aspC-1-celler, Ala /Gln /AMP-vejen er også involveret. Forkortelser: Gln – glutamin, Ala – alanin, PC – phosphatidylcholin, Cho – cholin. Lac1 + FACH2 – methylgruppe signal af lactat og methylengrupper fedtsyrerne, lac2 – methylengruppe af lactat, CH = CH -. Protoner i methin grupper af umættede fedtsyrer

Membranbundet fede syrer er normalt NMR-kun synlig, når du bruger Magic-Angle-Spinning (MAS) teknik [31]. I modsætning hertil mobile flerumættet fedtsyre (PUFA) grupper (viz. CH = CH ved 5,3 ppm eller CH = CHCH2CH = CH ved 2,8 ppm), som er blevet forbundet med dannelsen af ​​lipid dråber i autophagosomes under autofagi og programmeret celledød (PCD) [32], blev fremtrædende i proton-NMR-spektre af MiaPaCa-2-celler behandlet med OMP eller 5-FU + OMP. Endvidere en forhøjelse af fedtsyre-methylen (FACH2) grupper sammenlignet med acetat blev observeret ved OMP og 5-FU + OMP behandling i MiaPaCa-2-, men ikke i ASPC-1 celler. Dette korrelerer med de elektronmikroskopiske data, der viser, at de morfologiske ændringer forbundet med autofagi ledsages af vakuolisering som peger på begyndelsen af ​​apoptose i MiaPaCa-2, men ikke ASPC-1-celler, ved 80 pg /ml OMP.

Cho og phosphocholin- (PC) signaler er indikatorer for væksten i humane celler, hvorved forhøjet PC er forbundet med hurtig spredning og maligne adfærd [33] – [35]. Undertrykkelsen af ​​PC kan være forårsaget af cholin kinase og phospholipase C-nedregulering og phospholipase A2 induktion fører til proliferation inhibition [36]. I vores undersøgelse blev PC signifikant undertrykt sammenlignet med Cho i MiaPaCa-2-celler behandlet med OMP, 5-FU og 5-FU + OMP og i aspC-1 celler behandlet med OMP alene.

Tilsammen data viser, at fedtsyren og phospholipid metabolit signaler ændret ved OMP behandling. Selv om der blev observeret tilsvarende ændringer i både ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler, blev disse ændringer mere forbedret i MiaPaCa-2-celler, især i forhold til disse signalændringer indikerer inhiberede proliferation (PC) og PCD (PUFA). Dette svarer til de ovenfor beskrevne farmakodynamiske og morfologiske ændringer. Men i MiaPaCa-2-celler de biokemiske virkninger blev ikke begrænset til OMP behandling, men også opstod efter 5-FU og 5-FU + OMP og kan derfor ikke anses for at være specifik for OMP.

Deltagelse af lysosomer og Golgi komplekset i det cellulære respons på OMP

Potentielle subcellulære mål for OMP, blev identificeret ved at isolere organeller fra MiaPaCa-2-celler ved densitetscentrifugering. Som vist i figur 8, den første og den anden massefylde fraktioner indeholdt tidlige og sene endosomer og lysosomer, som blev identificeret ved LAMP-1 og cathepsin-D-antistoffer (figur 8B) i ​​kontrolgruppen. I OMP behandlede gruppe blev disse proteiner findes kun i den første fraktion. Den tredje del af kontrolgruppen indeholdt Golgi komplekset som angivet ved β-COP-antistof. Imidlertid ekspression af dette protein formindskes ved OMP behandling. Proton-NMR-spektre af disse fraktioner er vist i figur 8A og 8C. Figur 8A viser signalet opgaver sammenligner spektre af disse fraktioner (navngivet F1-F3) til de af iodixanol (Optiprep), og en lysosomal cellefraktion af ubehandlede celler (F1 *), som blev vasket med PBS én gang efter ultracentrifugering (i modsætning til brøkdele F1-F3, der blev vasket to gange). Iodixanol opstod i alle fraktioner, men faldt efter vask af ultracentrifugates to gange. Det tyder på delvis inkorporering af iodixanol i membranerne eller lumen i organeller. De fleste af de vandopløselige lavere-molekylære stoffer faldt også i F1-F3, såsom lactat og citrat, sammenlignet med F1 *, hvilket pegede på en udvaskning. Integriteten af ​​organeller blev veryfied ved hjælp af en ekstern standard (tetrachlorethan) for kemisk skift kalibrering. Der var en pH-afhængig forskydning af citratet signaler i retning forsuring i lysosomale fraktioner i forhold til hele cellesuspensioner.

(A) overlejring af proton-NMR-spektrum fragmenter af følgende suspensioner (fra top til ned) : ubehandlet først (lysosomal) cellefraktion efter ultracentrifgation og én vask (F1 *), iodixanole (Optiprep) suspension, lavere (F3), midterste (F2) og øvre del (F1) af ultracentrifugates efter to vaskninger. De kemiske skift af spektrene blev kalibreret til cholin /Phosphatidylcholin (Cho /PC) signal. Bortset fra iodixanol, kunne vi identificere de PUFA grupper (methylengrupper beliggende mellem to CH = CH-grupper), Cho /PC og glycerophosphocholine (GPC) i F1 * og F1-3. Endvidere observerede vi lactat og methylengrupperne af fedtsyrer (ved 1,3 ppm), citrat (ved 2,55 og 2,7 ppm) og phosphoethanolamin (ved 3,1 ppm) i F1 *, men ikke i F1-F3 grupper .. (B) Western blot analyse af LAMP-1, en sen endosom markering, som var næsten identisk fordelte over de to første fraktioner sammenlignet med Cathepsin-D, i controle gruppe, men opstod kun i den første fraktion i OMP behandlede gruppe. β-COP som indikator for Golgi-komplekset, der findes stærkt i den nedre del i kontrolgruppen, men meget svagt i OMP behandlede gruppe. Cathepsin – D, en tidlig endosom markering, som kan findes i den øverste og midterste del af kontrolgruppen, men med hensyn til OMP gruppe, blev kun fundet i den første. (E) overlejring af NMR-spektre af alle fraktioner af kontrol og OMP. Den mest relevante forskel er fravænning af GPC signal efter OMP behandling i 1. fraktion efter kun 6 timer.

I modsætning til hele cellen spektre (se figur 5B), glycerophosphocholine (GPC) var findes i den første (lysosomale) fraktion. Når man sammenligner styringen til OMP-behandlede gruppe (figur 8C), GPC-signalet klart formindsket på OMP behandling. Endvidere blev en stigning i PUFA’er i OMP-behandlede gruppe bekræftet (figur 8C) analogt med hele cellen spektre. OMP kunne ikke identificeres i nogen af ​​disse fraktioner og derfor sandsynligvis ikke akkumuleres i lysosomer eller i Golgi komplekset. Dette understreger den konstatering, at endosomet og lysosom fraktioner undergik anabolske ændringer under OMP behandling (svarende til TEM-data). Men Golgi kompleks som en væsentlig del af det lysosomale transportsystemet, er også involveret.

Bestemmelse af autophagic aktivitet

Vi udførte LC3-Western blot-analyse for at konstatere ændringer i ekspressionen af ​​LC3 . Den LC3-genekspression korrelerer godt med det antal autophagosomes [37], [38]. Desuden to fraktioner kan normalt differentieres – LC3-I og LC3-II. De første occures i autophagophores og betragtes som en induktion indikator autophagy, sidstnævnte er indeholdt i autophagosomes og nedbrydes, efter at deres fusion med lysosomer, i autolysosomes. [10].