PLoS ONE: Anti-tumor effekt mod human Kræft Xenografter af en fuldt humant monoklonalt antistof til en Variant 8-epitop af CD44R1 Udtrykt på kræftstamceller Cells

Abstrakt

Baggrund

CD44 er et større cellulær receptor for hyaluronsyrer. Stammestrukturen af ​​CD44 kodes af ti normale exons kan forstørres ved ti variant exons (v1-V10) ved alternativ splejsning. Det er lykkedes at fremstille MV5 fuldt humane IgM og sin klasse-switched GV5 IgG monoklonalt antistof (mAb) anerkendelse det ekstracellulære domæne af et CD44R1 isoform, der indeholder det indsatte region kodet af variant (v8, V9 og V10) exoner og udtrykkes på overflade af forskellige humane epitelceller kræftceller.

Metoder og vigtigste resultater

Vi viste væksthæmning af humane cancer-xenotransplantater ved en GV5 IgG mAb omformet fra en MV5 IgM. Den epitop genkendes af MV5 og GV5 blev identificeret til en v8-kodende region ved analyse af mAb binding til forskellige rekombinante CD44 proteiner ved enzymmaerket assay. GV5 viste fortrinsret reaktivitet mod forskellige maligne humane celler versus normale humane celler vurderes ved flowcytometri og immunhistologisk analyse. Når ME180 human uterine cervix carcinomaceller blev subkutant inokuleret til athymiske mus med GV5, observeredes signifikant inhibering af tumordannelse. Endvidere intraperitoneale injektioner af GV5markedly hæmmede væksten af ​​synlige etablerede tumorer fra HSC-3 humane strubehovedet carcinomaceller, der var blevet subkutant transplanteret en uge før den første behandling med GV5. Fra

in vitro

eksperimenter, antistof-afhængig cellulær cytotoksicitet og internalisering af CD44R1 syntes at være mulige mekanismer for

in vivo

anti-tumor aktivitet ved GV5.

Konklusioner

CD44R1 er en fremragende molekylært mål for mAb terapi af cancer, muligvis bedre end molekyler målrettet mod eksisterende terapeutiske mAb, såsom Trastuzumab og Cetuximab genkender human epidermal vækstfaktor-receptorfamilien

Henvisning:. Masuko K, Okazaki S, Satoh M, Tanaka G, Ikeda T, Torii R, et al. (2012) Anti-tumor effekt mod human Kræft Xenografter af en fuldt humant monoklonalt antistof til en Variant 8-epitop af CD44R1 Udtrykt på cancerstamceller. PLoS ONE 7 (1): e29728. doi: 10,1371 /journal.pone.0029728

Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

Modtaget: August 15, 2011; Accepteret: December 2, 2011; Udgivet: januar 17, 2012 |

Copyright: © 2012 Masuko et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af den “Academic Frontier” Projekt af Kinki University (2005-2007) og “Antiaging center” Projekt af Kinki University (2008-2012) for private universiteter: matchende fond tilskud fra MEXT (Undervisningsministeriet, Kultur, Sport , videnskab og teknologi), og understøttes også af “A-STEP (Kan tilpasses og Seamless Technology Transfer Program gennem Research Udvikling)” Projekt (2009-2011): matching fond tilskud fra Japan Science and Technology Agency. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. I denne undersøgelse, svarende forfatter (TM) samarbejdede med Kohjin Bio Co., Ltd i studiet af ADCC, med Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd i brugen af ​​KM-mus, og med Link Genomics, Inc. i studiet af immunhistokemi. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

CD44 er en type I-celle-overflade glycoprotein, der fungerer som den største celleadhæsion molekyle til hyaluronsyrer [1] – [3]. Standard CD44 (CD44s) kodet af de ti normale exons (ex1-5 og ex16-20) kan forstørres af indsatse kodet af forskellige kombinationer af variant exons (ex6-15 eller v1-v10) af CD44 ved alternativ splejsning [3] [4]. Selv om den fysiologiske betydning af den alternative splejsning af CD44 er fortsat uklart, nogle variant CD44 (CD44v) molekyler rapporteret at være overudtrykt i forskellige maligniteter af gnavere og menneskelige systemer [5] – [8].

Blandt mange CD44v, CD44R1 [7], [8], der har et indsat region kodet af v8 (ex13), v9 (EX14) og V10 (EX15) exoner selektivt udtrykt i forskellige humane epiteliale kræftformer. For eksempel er CD44R1 mRNA forhøjet i human colon, blære, lunge, strubehoved og brystcancer [8], og immunhistologisk analyse (IHA) viste også, at CD44R1 protein blev overudtrykt i lung pleurale prøver sammenlignes med den i tilgrænsende normale væv, under anvendelse af kanin polyklonale antistoffer dannet mod rekombinant CD44-protein [8]. Desuden har vi for nylig vist, at muse homolog af humant CD44R1 udtrykkes i præcancerøse regioner, eventuelt indeholdende cancer stamceller (CSCS) eller tumor-initierende celler, under muse gastrisk carcinogenese [9], [10].

Men da specifikke fuldt humane monoklonale antistoffer (mab) anerkendelse af ekstracellulære domæne af humant CD44R1 udtrykt på levende tumorceller ikke har været tilgængelige indtil nu, forbliver præcis vurdering af den terapeutiske effekt af anti-CD44R1 mAb på humane maligniteter, der skal gennemføres. I denne undersøgelse, rapporterer vi vækst hæmning af human cancer i athymiske mus ved lokalt eller systemisk administreret fuldt humane mAb anerkende CD44R1, og diskutere specificitet, anti-tumor mekanismer og nytten af ​​fuldt humane anti-CD44R1 mAb i behandlingen af ​​kræft.

Resultater og diskussion

CD44, som binder hyaluronater, er en troværdig markør molekyle for CSCS [11] – [16], og er betydeligt involveret i metastaser af tumorceller [16] – [ ,,,0],19]. Således er CD44 betragtes som en lovende molekylært mål til cancerterapi under anvendelse af mAb. Da CD44s udtrykkes i forskellige normale væv [20], har vi fokuseret på tumor-selektiv splejse-variant CD44v proteiner. Blandt over 1000 teoretisk mulige splejsning-variant CD44v proteiner [21], at have CD44R1 indsatsen kodet af v8, er V9 og V10 exons selektivt udtrykt på forskellige epitelial cancerceller [8].

Vi har for nylig udarbejdet fem anti -human CD44 fuldt humane IgM mAb (MV1 mod CD44s, og MV2, MV3, MV4 og MV5 mod CD44R1) fra celle fusioner mellem musemyelomceller og miltceller fra Kirin-Medarex (KM) mus [22] immuniseret mod rekombinante humane CD44-proteiner produceret i

Escherichia coli

. I dette papir, præsenterer vi udarbejdelsen af ​​klassen-switched anti-CD44R1 human IgG mAb (GV5), specificitet MV1, MV5 og GV5, og

in vivo

in vitro

anti- tumor effekt af GV5.

fuldt humant IgM og IgG mAb mod humane CD44 proteiner blev produceret

Fem anti-humant CD44 fuldt humant IgM mAb (MV1, MV2, MV3, MV4 og MV5) var produceret mod en rekombinant CD44 (R1a; Δex5-v8-v9-v10-Δex16) protein produceret i

Escherichia coli

[8]. MV1 omsat med RH7777 rotte hepatomceller udtrykker CD44s eller CD44R1, og MV2, MV3, MV4 og MV5 reagerede specifikt med RH7777-celler, der udtrykker CD44R1 (data ikke vist). For at evaluere reaktiviteten af ​​menneskelige mAb med

in vivo

tumorer, udførte vi IHA (fig. 1). MV1 og MV5 afgjort farves cellemembraner af

in vivo

tumor fra ME180 menneskelige livmoderhalsen kræft udviklet i athymiske mus, og CD44R1 blev uensartet udtrykt i humane cancer-xenotransplantater, selvom MV2, MV3 og MV4 viste relativt svage reaktioner i forhold til MV5 (fig. 1). Derfor har vi omformet (klasse-switched) MV5 humant IgM til GV5 humant IgG. Reaktivitet af GV5 med

in vivo Salg tumorer fra ME180 var også positivt på cellemembranen i disse tumorceller (fig. 2), CD44R1 blev uensartet udtrykt i tumoren som i tilfældet med farvning af ME180 tumoren ved MV5. I modsætning hertil ekspressionen af ​​HER2 anerkendt med Trastuzumab var relativt ensartet i ME180 tumoren, og ekspressionen af ​​CD20 anerkendt af Rituximab var fuldstændig negativ.

Vævssnit af humane ME180 tumorer udviklet i athymiske mus blev fikseret med PFA og blev sekventielt inkuberet med human mAb, artsspecifikke biotinyleret anti-humant IgG + IgM (H + L), ABC-reagens og substrat indeholdende DAB og H

2O

2. Kerner blev farvet med hematoxylin.

Vævssnit af humane ME180 tumorer udviklet i athymiske mus blev fikseret med kold acetone, og blev sekventielt inkuberet med primært mAb, artsspecifikke biotinyleret anti-humant IgG Fcy, ABC reagens og substratopløsning indeholdende DAB og H

2O

2. Kerner blev farvet med hematoxylin. Øvre eller nedre paneler viser henholdsvis lav eller høj forstørrelse af de farvede væv.

specificitet og epitop af fuldt humane MV1 og MV5 IgM, og klasse-switched GV5 IgG mAb mod CD44 blev bestemt

Særlige forhold ved MV1, MV5 og GV5 blev sammenlignet for reaktivitet med HEK293F humane embryonale nyre celler, der udtrykker CD44R1 eller CD44s (fig. 3A), som beskrevet andetsteds [10], [23]. MV5 og GV5 reagerede specifikt med CD44R1-grønt fluorescerende protein (GFP) udtrykkende celler i en GFP-ekspression-afhængig måde; Men disse mAb ikke reagerer med celler, der udtrykker CD44s-GFP, som viser, at GV5 fastholder specificitet MV5 og specifikt genkender et humant CD44R1 protein ved flowcytometri (FCM). I modsætning hertil MV1 omsat med HEK293F celler, der udtrykker CD44s-GFP eller CD44R1-GFP. Specificiteten af ​​humant mAb blev også underbygget af FCM-analyse under anvendelse RH7777 rotteceller transficeret med cDNA af humane CD44s eller CD44R1 (data ikke vist). Derefter blev MV1, MV5 og GV5 bedømt for reaktivitet med forskellige rekombinante humane CD44 proteiner fusioneret til glutathion S-transferase (GST) (fig. 3B). R1a er et immunogen til fremstilling af anti-CD44 humant mAb, og R1b indeholder kortere polypeptider i EX5 og V8 regioner end R1a. Epitopen er defineret med fuldt humane mAb blev lokaliseret til en EX5-kodende region for MV1, og en v8-kodende region for MV5 og GV5 ved enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). Peptidepitopen defineret med MV5 eller GV5 syntes at blive eksponeret i humane celler, fordi disse mAb definitivt og specifikt omsat med HEK293F celler, der udtrykker CD44R1, selvom CD44R1 er kraftigt glycosyleret og ekspressionen af ​​disse epitoper kunne påvirkes af glycosyleringen varierer mellem celletyper eller celle forhold.

(A) MV1 (venstre), MV5 (midten) og GV5 (højre) blev sammenlignet for reaktiviteten med HEK293F celler, der udtrykker human CD44R1-GFP (øvre) eller humane CD44s-GFP (lavere) af FCM. (B) Reaktivitet af antistoffer mod forskellige GST-fusionerede rekombinante CD44-proteiner (R1a og R1b; Δex5-V8-V9-V10-Δex16, v8, v9, v10 og EX5) fusioneret til GST blev bestemt ved ELISA. Forskel i længden af ​​Δex5 og Δex16 mellem R1a og R1b rekombinante proteiner er beskrevet i “Materialer og metoder”.

Anti-CD44R1 fuldt humane GV5 selektivt reagerede med humane karcinom cellelinjer, men ikke med forskellige humane normale celler

Nogle af de eksisterende terapeutiske mAb er målrettet mod den humane epidermisvækstfaktor-receptor (HER) familie [24] – [27]. Vi sammenlignede reaktiviteten af ​​GV5, Cetuximab (anti-HER1) og Trastuzumab (anti-HER2) med HCT116 human colon cancerceller, normale humane epidermale keratinocytter (NHEK) og humane navlevene endotelceller (HUVEC) (fig. 4A, C) . GV5, Cetuximab og Trastuzumab var absolut reaktivt med HCT116 humane cancerceller. GV5 svagt omsat med NHEK, selvom Cetuximab kraftigt og Trastuzumab moderat omsat med NHEK. Endvidere GV5 var næsten ikke-reaktiv med HUVEC, selvom Cetuximab og Trastuzumab væsentlige omsat med HUVEC. Dernæst undersøgte vi reaktiviteten af ​​GV5 mod forskellige yderligere humane cellelinjer (fig. 4B). GV5 absolut reagerede med forskellige dyrkede humane epiteliale cancere (BT20 bryst, KATOIII mave, LS-174T colon, ME180 livmoderhals, KPK-1 nyre- og KU-1 blære), selv om dette mAb ikke reagerede eller kun svagt reageret med Molt-4 T leukæmi, SK-MEL-37 melanom og ikke-kræft cellelinjer fra voksne hud (EK325), føtal tarm (Int407) og embryonale nyre (HEK293F). GV5 også omsættes med MKN-7 mave og HeLa-S livmoderhalsen carcinoma cellelinier, men ikke med U-2os osteosarkom, Jurkat, Daudi og HL60 leukæmicellelinjer (fig. 4C). Ekspression af CD44R1 i mange carcinomceller var heterogen (fig. 4B), som i tilfælde af humane xenografter i athymiske mus (fig. 1, fig. 2). Desuden har GV5 ikke reagere med hvilende små lymfocytter overhovedet; Det er også af interesse, at det ikke reagerer med lymfocytter stimuleret med rekombinant human interleukin-2 (IL-2) i 48 timer eller 12-

O

tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) plus Ca ionophor ( A23187) i 24 timer, hvilket viser, at aktiverede T- og B-lymfocytter er ikke reaktive med GV5 (fig. 4C). Specificiteten af ​​GV5 indikerer, at CD44R1 er et tumor-selektive og overlegen målmolekyle sammenlignet med HER1 eller HER2. Faktisk var alvorlig toksicitet hud observeret i behandlingen af ​​Cetuximab mod patienter med tyktarmskræft, sandsynligvis på grund af binding til HER1 på huden keratinocytter. I forbindelse med ekspressionen af ​​HER2, GV5 reagerede stærkt med en BT20 triple-negativ brystcancer cellelinje, der ikke udtrykker østrogen og progesteron-receptorer og HER2, selv om dette mAb ikke reagerede med HER2-overekspression SK-BR-3 brystcancer-cellelinie (fig. 4B, C). Forventer derfor, vi, at anti-CD44R1 terapeutisk mAb kunne kompensere for anti-HER2 mAb i behandlingen af ​​brystkræft.

GV5, Cetuximab og Trastuzumab blev sammenlignet for reaktivitet med HUVEC, NHEK og HCT116 af FCM (histogrammer ) med en Accuri C6 flowcytometer (A). Reaktivitet af GV5 med forskellige humane celler blev analyseret ved FCM, og afbildet som histogrammer (B) med en BD-LSR flowcytometer og som ΔMFI (C) ved hjælp af en Accuri C6 flowcytometer.

CD44R1 var påvises specifikt i humane epiteliale cancervæv

først blev fordelingen af ​​CD44s og CD44R1 i humane cancere analyseret med rotte-mAb (RV7 og RV9) mod humant CD44, da immunfarvning af humane væv med GV5 efterfulgt af anti-humant immunoglobuliner medførte ikke den indlysende resultat (data ikke vist). I IHA på menneskelige bryst og colon væv (fig. 5), begge RV7-definerede CD44s og RV9 definerede CD44R1 (v8) blev afgjort udtrykkes i cellemembranen af ​​bryst- og tyktarmskræft celler, selvom CD44s men ikke CD44R1 også blev udtrykt på celler i stroma. Ekspression af CD44R1 i normale bryst epitelceller var lav og var negativ i kolonepitelceller. Desuden blev CD44R1 heterogent udtrykt i cancerceller, som i tilfældet med farvningen af ​​human cancer-xenotransplantater (fig. 1 og fig. 2) og cancercellelinier (fig. 4B) ved GV5 anti-CD44R1 humant mAb. I IHA på menneskelige mandler, MAB RV9 anti-CD44R1 (v8) svagt farvet epitel, især celler i det basale lag, men farvede ikke lymfoblastoide celler i germinale centrum af tonsil væv, selv om RV7 anti-CD44s mAb absolut farvede celler i denne region, ud over celler i hele epitel (data ikke vist). Disse fund stemmer fint med den manglende reaktivitet af GV5 med aktiverede humane lymfocytter (fig. 4C). Disse resultater fra FCM og IHA har vist fremragende cancer-specificitet CD44R1, utvivlsomt bedre end CD44s. Vi undersøgte dernæst reaktiviteten af ​​biotinyleret GV5 med humane vævsprøver. GV5 absolut reagerede med planocellulære carcinomer i livmoderhalsen (primær kræft), hud (primær kræft) og lunge (metastatisk kræft til blødt væv), adenokarcinomer af mave og tyktarm, men ikke med aggregerede lymfe knuder af vermiform tillæg (fig. 6). Således er ekspressionen af ​​CD44R1 er begrænset til epitelcancer, og ikke forhøjet i processen med lymfocytaktivering

in vitro

eller

in vivo

, selvom ekspressionen af ​​en given iboende onkoprotein i lymfocytter ofte opreguleret af forskellige aktiverings- stimuli [28], [29].

Reaktivitet af anti-humane CD44s eller anti-humant CD44R1 (v8) rotte-mAb med bryst- og colon vævssnit fra humane kirurgiske prøver var analyseret med ABC immunperoxidasefarvning. Sektioner fra PFA-fikserede og paraffin-indlejret humant bryst- og colonvæv blev behandlet med mikrobølger i citratbuffer til hentning af antigener, og inkuberet med RV7 eller RV9 rotte mAb. Efter at være blevet skyllet i PBS blev vævssnit sekventielt inkuberet med artsspecifikke biotinyleret æsel-anti-rotte-IgG (H + L), ABC-reagens og substrat indeholdende DAB og H

2O

2. Kerner blev farvet med hematoxylin. Ikke-eller kræft væv betyder prøver fra en identisk patient.

Sektioner fra PFA-fikseret og paraffin-indlejrede humane væv blev behandlet med mikrobølger i citratbuffer for hentning af antigener, og inkuberes med biotinyleret GV5. Efter at være blevet skyllet i PBS, blev vævssnit inkuberet med ABC reagens og substrat indeholdende DAB og H

2O

2. Kerner blev farvet med hæmatoxylin.

Anti-CD44R1 GV5 human mAb udstillet

in vivo

terapeutisk virkning på humane carcinomer i xenograftmodeller

GV5 blev evalueret for anti- tumor virkning mod humane tumorer i athymiske mus. Størrelsen af ​​hver tumor blev dannet, blev målt periodisk, som beskrevet andetsteds [30] – [32]. Først GV5 blev undersøgt for virkning på tumordannelse ved ME180 humane cervical cancer celler i en tumor neutralisering model [33]. Denne model til at evaluere lokal virkning af antistoffer mod tumorvækst historisk stammede fra Winn test [34] til evaluering af anti-tumor-effekt af cytotoksiske T-lymfocytter. Cancerceller blev inokuleret subkutant til athymiske mus med eller uden GV5 (50 ug /sted), og tumorvækst i GV5 treatedmice var signifikant inhiberet sammenlignet med kontrolmus (Fig. 7). Dernæst GV5 blev undersøgt for anti-tumor effekt mod en HSC-3 human larynx cancer i en etableret tumor model [35]. I denne systemisk administration af mAb til tumorbærende mus, vi bevidst vedtaget intraperitoneal men ikke intravenøs injektion til administration af en nøjagtig mængde af mAb til hver mus. Syv dage efter HSC-3-celler blev inokuleret subkutant til athymiske mus og en synlig tumor i hver mus var bekræftet, blev GV5or vehikelkontrol intraperitonealt injiceret to gange med et interval på en uge. I denne eksperimentelle model, tumorvækst i GV5 treatedmice var igen signifikant hæmmet sammenlignet med kontrol mus (fig. 8).

Tumor neutralisering model blev vedtaget. ME180 humane tumorceller (1,0 x 10

6) med eller uden mAb (50 ug /sted) i 200 pi PBS subkutant inokuleret i højre dorsale flanke af hvert dyr. Størrelsen af ​​hver tumor blev dannet, blev målt periodisk, og tumorvolumen (mm

3) blev beregnet ved formlen 0,4 × (længde) x (bredde)

2. Resultaterne blev analyseret statistisk ved to-vejs ANOVA test med gentagne målinger.

Etableret tumor model blev vedtaget. Syv dage efter human larynx carcinoma-afledt HSC-3-tumorceller (1,0 x 10

6) i 200 pi PBS blev inokuleret subkutant til athymiske mus og synlig tumor i hver mus blev bekræftet, 500 pi PBS med eller uden GV5 (100 ug) blev intraperitonealt inokuleret på dag 7 og dag 14 (lodrette pile). Størrelsen af ​​hver tumor blev dannet, blev målt periodisk, og tumorvolumen (mm

3) blev beregnet ved formlen 0,4 × (længde) x (bredde)

2. Resultaterne blev analyseret statistisk ved tosidet Student s

t

tests (øverste), og ved to-vejs ANOVA test med gentagne målinger (lavere). Lodrette søjler viser standardafvigelser.

GV5 induceret internalisering af CD44R1 og ADCC

in vitro

For at analysere mekanismerne i den

in vivo

antitumorvirkning af GV5 mod human cancer-xenotransplantater i athymiske mus, internalizations af CD44R1, komplement-afhængig cytotoksicitet (CDC) og antistof-afhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) af GV5 blev undersøgt. Da dysfunktion af CD44R1 af mAb kan føre til væksthæmning eller celledød af cancerceller på grund af manglende signal fra en vedhæftning substrat, undersøgte vi virkningen af ​​GV5 på fordelingen af ​​celleoverflade-CD44-proteiner. Ved tilsætning af GV5 til kulturen i HSC-3-celler i 12 timer, ca. 50% af CD44R1 proteiner forsvandt fra celleoverfladen (fig. 9A). CDC hjælp GV5 kombineret med mus, kanin eller human serum resulterede ikke i død af tumorceller (fig. 9B). I ADCC, splenocytter fra athymiske mus blev for-dyrket med IL-2 i 12 timer for at øge drab aktiviteten af ​​effektorceller. Ved anvendelse af IL-2-behandlede effektorceller, GV5clearly augmented cytotoksiciteten mod HSC-3-tumorceller i ADCC (fig. 9C, D).

(A) HSC3 celler blev dyrket med eller uden GV5 ( 10 ug /ml) i 12 timer, og blev immunfarvet med GV5 efterfulgt af FITC-konjugeret æsel-anti-human IgG (H + L). Celleoverflade-CD44R1 proteiner i disse celler blev påvist ved FCM. Forsøg blev gentaget tre gange, og lignende resultater blev opnået. (B) Efter HSC-3-celler og sera til komplement og mAb blev blandet og inkuberet i hver brønd i U-bundede 96-brønds plade i 1 time, DAPI blev tilsat til hver brønd. Procentdele af DAPI-farvede celler (døde celler) blev beregnet fra FCM. Forsøg blev gentaget tre gange, og lignende resultater blev opnået. (C) HSC-3-celler (1,5 x 10

5) blev blandet med effektorceller af splenocytter (3 x 10

6 eller 9 × 10

6) fra KNS nøgne mus, som var præ-dyrket natten over med IL-2, med eller uden mAb, i hver brønd i U-bundede 96-brønds plade i 5 timer, og PI blev tilsat til hver brønd. Cytotoksicitet blev analyseret under anvendelse af et Accuri flowcytometer. R1, HSC3 humane målceller; R2, mus effektorceller; R3, PI-farvede døde celler i R1; R4, PI-ufarvede levende celler i R1. (D) celledød (%) af HSC-3-celler ved muse effektorceller (E /T = 0, 20 eller 60) med eller uden GV5 blev afbildet. E /T betyder effektor at målrette ratio.

GV5 induceret effektiv ADCC med humane effektorceller

Da vi bekræftede ADCC aktivitet af GV5 med musen effektorceller, vi næste undersøgt ADCC aktivitet GV5 med humane effektorceller. GV5 viste signifikant ADCC aktivitet mod HSC-3-tumorceller med IL-2-stimulerede humane perifere blodlymfocytter (PBL) som effektorceller, selv ved en lav effektor /mål (E /T) forhold på 2,5 (fig. 10A). Ved et E /T-forhold på 10, viste GV5 augmented cytotoksicitet over HCS-3-celler sammenlignet med humane effektorceller alene, på alle tidspunkter mellem 2 timer og 7 timer (fig. 10B).

HSC-3 celler blev mærket med Calcein-AM, og celler (2 × 10

5) blev blandet med effektorceller af human PBL (5 x 10

5 eller 2 × 10

6), som var præ-dyrket natten over med IL-2 med eller uden mAb i hver brønd i U-bundede 96-brønds plade i 7 timer. Cytotoksicitet blev evalueret ved udgivelsen af ​​Calcein-AM ved døde tumorceller i mediet, og resultaterne blev automatisk optaget med en Terascan VP microfluorocytometer ved 1 timers intervaller i 7 timer. Resultaterne blev analyseret statistisk ved to-vejs ANOVA test med gentagne målinger (A) og ved tosidet Students

t

tests (A og B). Steder og lodrette søjler viser henholdsvis midler og standardfejl.

I denne undersøgelse har vi med succes produceret fuldt humane GV5 mAb specifikt genkender CD44R1, og viste væksthæmning af humane cancer implanteret i atymiske mus ved GV5 . Med hensyn til de anti-tumor mekanismer mod menneskelige xenografter ved GV5 i athymiske mus, vi forsøgsvis foreslå bidrag induceret internalisering af CD44R1 ved GV5 og augmented cytotoksicitet i ADCC af mus effektor celler med GV5. Vi forventer også, at GV5can vise et ADCC-medieret terapeutisk virkning på humane maligniteter, eftersom GV5has viste ADCC aktivitet med humant PBL som effektorceller. Virkninger af anti-CD44R1 mAb om indarbejdelse af hyaluronat er nu under efterforskning; Vi har dog allerede bekræftet, at GV5 kunne fremkalde internalisering af CD44R1 fra celleoverfladen, hvilket tyder på mulige virkninger på indarbejdelse af hyaluronat og augmented anti-tumor effekt af dette mAb, foruden ADCC aktivitet.

For nylig, kimært eller humaniseret mAb mod de ekstracellulære domæner af HER2 [24], [25], HER1 [26], [27] og CD20 [36] – [38] er blevet indført til behandling af brystcancer, kolorektal cancer eller B cellemaligniteter henholdsvis. Selvom fase I kliniske forsøg med anti-CD44v6 kimære mAb mod planocellulært karcinom nylig er blevet udført [39] – [41], alvorlig toksicitet hud blev observeret sandsynligvis på grund af binding til CD44v6 på huden keratinocytter [39], [40]. I denne sammenhæng reaktiviteten af ​​GV5 med normale, humane hudkeratinocyter var negativ eller ubetydelig (fig. 3A), hvilket tyder på toksicitet lav hud vor anti-CD44R1 (v8) fuldt humane mAb.

Akkumuleret beviser har vist, at CD44 er karakteristisk udtrykt i CSCS af forskellige væv oprindelser [11] – [16]. Vi fokuserer nu vores opmærksomhed på CD44v (CD44R1) men ikke CD44s udtrykt på overfladen af ​​CSCS i præcancer region af gastriske adenokarcinomer af

K19-Wnt1 /C2mE

transgene mus [9], [10]. Reaktivitet af GV5 med ME180 eller HSC-3 forekom relativt heterogen; dog tumordannelse eller tumorvækst blev næsten fuldstændig hæmmet af GV5, hvilket tyder på, at CSCS hovedsageligt består af GV5-reaktive CD44R1

høje celler, men ikke af GV5-reaktive CD44R1

lave celler. I den forbindelse har vores seneste data dokumenteres, at ekspressionen af ​​CD44R1 og dets samarbejde med XCT cystein-glutamat antiporter, en let kæde underenhed af CD98 oncoprotein [10], [23], [30] – [32], [42 ], [43], blokere de reaktive oxygenarter (ROS) -induceret stress signalering som resulterer i vækststandsning, celledifferentiering og senescens, og derved fremme proliferation af cancerceller og dannelsen af ​​letale gastrointestinale tumorer [44]. Da CD44R1-udtrykkende CSCS spiller en central rolle i modstanden mod kræftbehandling, bør det postuleres, at terapeutisk mAb kunne målrette CD44R1

høj cellepopulation i kræft.

Vores nuværende analyser indikerer stærkt, at kræftbehandling med anti-CD44R1 fuldt humant mAb er lovende, især mod forskellige humane epiteliale cancere, såsom adenocarcinomer i brystet, maven og tyktarmen, overgangs- cellecarcinom i blæren, og renal carcinoma, foruden pladecellecarcinomer fra forskellige kropsområder.

Materialer og metoder

Celler og celle-dyrkningsbetingelser Salg

cellelinier fra humant larynx carcinoma (ca) (HSC-3), breast Ca (BT20, SK-BR-3) , gastrisk ca (GAS-1, MKN-7, MKN-28, KATOIII), kolorektal ca (LS-174T, HCT116), livmoderhalsen ca (ME180, HeLa-S), renal ca (KPK-1, TOS-1 ), blære CA (KU-1), melanom (SK-Mel-37), osteosarkom (U-2os), føtal tarm (Int407) og en rotte hepatom cellelinie (RH7777;. generøst tilvejebragt af Tanabe Mitsubishi Pharm) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) suppleret med 7% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS; ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA) i en befugtet inkubator (5% CO

2) ved 37 ° C. GAS-1, MKN-28 eller TOS-1 blev henholdsvis opnået fra Kotanagi H (Akita University), japansk Indsamling af Research Bioressourcer (JCRB) Cell Bank eller Satoh M (Tohoku Universitet). T-celle-leukæmier (Jurkat, Molt-4), B-celle-leukæmi (Daudi), promyelocytisk leukæmi (HL60) af human oprindelse, human PBL med eller uden rekombinant humant interleukin 2 (IL-2, 100 IE; Shionogi Co . Ltd., Osaka, Japan) og musesplenocytter med IL-2 (100 IU) for ADCC, musemyelomer (SP2, X63) og etablerede hybridomaceller blev dyrket i RPMI 1640-medium (RPMI; Sigma-Aldrich) suppleret med 7% varme-inaktiveret FBS under de ovennævnte betingelser. At opnå aktiverede humane lymfocytter for FCM, PBL blev også dyrket og stimuleret med IL-2 (100 IU) i 48 timer eller 12-

O

tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA, 20 ng /ml; Sigma -Aldrich) plus Ca ionophor (A23187, 0,3 uM; Calbiochem, La Jolla, CA, USA) i 24 timer i RPMI med 7% FBS. HUVEC (Takara Bio Inc. Otsu, Japan) blev holdt i EGM-2 medium (Lonza, Walkersville, MO, USA) og anvendt i tredje til femte passager. NHEK (Takara Bio Inc.) blev dyrket i HuMedia-KG2 (Lonza) og bruges på tredje til fjerde passager. HEK293F humane embryonale nyreceller (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og en human epidermal keratinocyt-cellelinie (EK325) oprettet ved os blev dyrket i FreeStyle293 ekspression medium (Invitrogen) i en befugtet inkubator (5% CO

2 ). GFP var genetisk fusioneret til cytoplasmatiske carboxylterminus af menneskelige CD44s eller CD44R1 i en pAcGFP ekspressionsvektor (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA), og HEK293F og RH7777 celler blev henholdsvis transficeret med disse CD44-GFP-plasmider med 293fectin (Invitrogen) eller Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens instruktioner, vælges ved hjælp dyrkningsmedier indeholdende G418 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) fortyndet til 400 ug /ml, og klon-sorteret for cellulær grøn fluorescens under anvendelse af en JSAN cellesorteringsapparat (Bay Bioscience, Kobe, Japan). Disse etablerede HEK293F og RH7777 cellelinjer, der udtrykker CD44-GFP-proteiner blev opretholdt i FreeStyle293 ekspression medium med G418 (400 ug /ml). Celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC), medmindre andet er angivet. De fleste cellelinjer indeholdende HSC-3 blev nævnt andetsteds [45].

Eksisterende terapeutiske monoklonale antistoffer

Anti-HER1 kimære Cetuximab (MerckSerono, Rockland, MA, USA), anti-HER2 humaniseret Trastuzumab og anti-CD20 kimære Rituximab (Roche-Chugai, Tokyo, Japan) blev anvendt til farvning af humane celler eller væv.

Udarbejdelse af et rekombinant humant IgG1 mAb anerkende CD44R1

MV1, MV2, MV3, MV4 og MV5 fuldt humant IgM mAb blev fremstillet ud fra celle fusion mellem miltceller af Kirin-Medarex (KM) mus (22) immuniseret mod en rekombinant Δex5-v8-v9-v10-Δex16 (R1a) protein (8) fusioneret til glutathion S-transferase (GST) og SP2 musemyelomceller. Proceduren for cellefusion og etablering af hybridomaer blev udført som beskrevet i næste afsnit. I R1a rekombinante proteiner, Δex5 eller Δex16 svarer henholdsvis til en delvis kort peptid (Δex5, 19 aminosyrer; Δex16, 8 aminosyrer) støder op til v8 eller V10. Revers-transkriberet cDNA’er fra den variable region af tunge og lette kæder, der blev klonet fra total RNA af hybridomaceller, der secernerer et IgM (μ, κ human mAb mod CD44R1 (MV5), blev genetisk omformet til cDNA’er af human IgG1 (γ1, κ