PLoS ONE: Den Angivelse af TMPRSS4 og ERK1 korrelerer med Metastase og dårlig prognose i kinesiske patienter med gastrisk kræft

Abstrakt

Formål

Den foreliggende undersøgelse undersøgte den kliniske betydning af transmembrane protease, serin 4 (TMPRSS4) og ekstracellulære signal-regulerede kinaser 1 (Erk1) i udvikling, progression og metastase af mavekræft.

Metoder

Immunhistokemi blev ansat til at analysere TMPRSS4 og Erk1 udtryk i 436 gastriske kræfttilfælde og 92 ikke-kræft humane gastriske væv.

Resultater

Protein niveauer af TMPRSS4 og Erk1 blev opreguleret i gastrisk cancer læsioner sammenlignet med tilstødende noncancerous væv. Høj udtryk for TMPRSS4 korreleret med alder, størrelse, Lauren klassificering, dybde invasion, lymfeknude og fjernmetastaser, regional lymfeknude scenen og TNM stadie, og også med udtryk for Erk1. I trin I, II og III, 5-års overlevelse på patienter med forhøjet TMPRSS4 udtryk var signifikant lavere end hos patienter med lavt udtryk. Yderligere multivariat analyse tyder på, at opregulering af TMPRSS4 og Erk1 var uafhængige prognostiske indikatorer for sygdommen, sammen med dybden af ​​invasion, lymfeknude og fjernmetastaser og TNM stadie.

Konklusioner

Angivelse af TMPRSS4 i mavekræft er signifikant associeret med lymfeknude og fjernmetastaser, høj Erk1 udtryk, og dårlig prognose. TMPRSS4 og ERK1 proteiner kunne være nyttige markører til at forudsige tumor progression og prognose af mavekræft

Henvisning:. Luo ZY, Wang YY, Zhao ZS, Li B, Chen JF (2013) udtryk for TMPRSS4 og ERK1 korrelater med Metastase og dårlig prognose i kinesiske patienter med gastrisk kræft. PLoS ONE 8 (7): e70311. doi: 10,1371 /journal.pone.0070311

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: Februar 20, 2013; Accepteret: 18 juni 2013; Udgivet: 29 juli 2013

Copyright: © 2013 Luo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse var støtte af en bevilling fra Zhejiang provinsen Institut for Videnskab og Teknologi Research Foundation (2008C33040) og nationale særlige fonde for Health Foundation (200.802.112). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion Salg

Type II transmembrane serinproteaser (TTSPs) er blevet anerkendt som ny underfamilie af serinproteaser med et proteolytisk domæne, et transmembrant domæne, en kort cytoplasmatisk domæne og en stilk region med variabel længde, som indeholder modulære strukturelle domæner [ ,,,0],1] – [2]. De fleste TTSPs har været impliceret i tumorudvikling og progression, hovedsagelig baseret på deres dysreguleret ekspression. Transmembrane protease, serin 4 (TMPRSS4) er en TTSP der er stærkt udtrykt i bugspytkirtlen, thyreoidea, lunge- og tarmkræft [3] – [4]. TMPRSS4 induceret invasionsevne og epitelial-mesenkymale overgang (EMT) ved at aktivere FAK signalering og Erk [5]. Ekstracellulær signal-reguleret kinase 1 (Erk1) er et medlem af MAP-kinase familien og virker i en signaleringskaskade, der regulerer forskellige cellulære processer, såsom proliferation, differentiering og cellecyklusprogression som svar på en række ekstracellulære signaler [6]. De biologiske funktioner og kliniske betydning af TMPRSS4 og Erk1 i gastrisk kræft er ikke forstået. Den aktuelle undersøgelse undersøgte udtryk for TMPRSS4 og Erk1 i 436 kirurgiske prøver af gastrisk kræft ved immunhistokemi, at undersøge mulighederne for korrelation af TMPRSS4 og Erk1 udtryk med klinisk-patologiske variabler, og at bestemme den prognostiske værdi af TMPRSS4 og Erk1 udtryk.

Materialer og metoder

Arkiveret Gastric vævsprøver og ikke-tumor slimhinde

mavekræft væv blev indsamlet fra gastrektomi prøver fra 436 patienter (311 mænd, 125 kvinder, median alder 60,0 år, rækkevidde 30-91) fra Institut for Kirurgi, Zhejiang Provincial People Hospital, fra januar 1998 til januar 2004. Væv var blevet formalinfikseret, paraffin-embedded, og diagnosticeret klinisk og histopatologisk ved departementerne Gastrointestinal Kirurgi og Patologi. Alle patienter havde opfølgende poster for 5 år. Opfølgningen deadline var december 2008. overlevelsestiden blev beregnet fra datoen for kirurgi til opfølgning deadline eller dato for død, hvilket primært skyldes karcinom tilbagefald eller metastaser. Ninety-to ikke-kræft humane gastriske væv blev opnået fra gastrektomi af tilstødende mavekræft marginer 5 cm. Rutinemæssig kemoterapi blev givet til patienter med fremskreden-stadie sygdom efter operationen, men ingen strålebehandling blev administreret til nogen af ​​de patienter, der indgår i vores undersøgelse.

Tissue microarray analyse

Blokke, der indeholdt en alt 436 tumor vævsprøver og 92 prøver af normal maveslimhinden blev fremstillet som tidligere beskrevet [7] – [8]. Core vævsbiopsier (2 mm i diameter) blev taget fra individuelle paraffinindlejrede gastriske tumorer (donorblokke) og anbragt i modtagerens paraffinblokke (vævsarray blokke) med en trepan. Da det er bevist, at farvning resultater fra forskellige intratumorale områder i forskellige tumorer korrelerer godt [9], blev en kerne samplet i hvert enkelt tilfælde. En passende tilfælde blev defineret som en tumor besætter 10% af kerneområdet [10]. Hver blok indeholdt mere end tre interne kontroller, der bestod af ikke-neoplastisk maveslimhinden. Fire-mikrometer-tykke snit blev skåret fra hver vævet matrix blok, deparaffineret og dehydreret.

Projektet blev godkendt af den etiske komité i Zhejiang Provincial People Hospital og skriftligt samtykke blev opnået fra alle deltagerne.

Immunhistokemi

Immunohistokemisk analyse [11] – [12] blev udført for at studere ændret protein ekspression i 92 ikke-kræft humane gastriske vævsprøver og 436 humane gastriske cancer væv. Kort fortalt blev objektglassene bagt ved 60 ° C i 2 timer efterfulgt af afparaffinering med xylen og rehydratiseret. Snittene blev nedsænket i EDTA antigene hentning buffer og microwaved for antigen hentning, hvorefter de blev behandlet med 3% hydrogenperoxid i methanol for at standse endogen peroxidaseaktivitet, efterfulgt af inkubation med 1% bovint serumalbumin for at blokere ikke-specifik binding. Snit blev inkuberet med kanin-anti-TMPRSS4 (Proteintech Group, Inc) og kanin-anti-Erk1 (Cell Signaling Technology), natten over ved 4 ° C. Normalt gedeserum blev anvendt som en negativ kontrol. Efter vask blev vævssnit behandlet med sekundært antistof. Vævssnit blev derefter modfarvet med hæmatoxylin, dehydreret, og monteret.

Evaluering af resultater

TMPRSS4 og Erk1 blev farvet som buffy farvet i cytoplasmaet og kernen. Graden af ​​immunfarvning blev gennemgået og afsluttet uafhængigt af to observatører baseret på intensiteten af ​​farvning [11], [13], [14]. Farvning intensitet blev gradueret efter følgende kriterier: 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning = lys gul), 2 (moderat farvning = gul brun), og 3 (stærk farvning = brun). Moderat og stærk farvning blev brugt til at definere tumorer med høj TMPRSS4 eller Erk1 udtryk, og nej og svag farvning blev brugt til at indikere lav TMPRSS4 eller Erk1 udtryk.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS 12.0 software. Måledata blev analyseret ved hjælp af Students

t

test, mens kategoriske data blev undersøgt ved hjælp af

χ

2 eller Fisher eksakt test. Overlevelseskurver blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden, og log-rank testen blev anvendt til at beregne forskelle mellem kurver. Multivariat analyse under anvendelse af Cox proportional hazard regressionsmodel blev udført for at vurdere de prognostiske værdier af proteinekspression. Korrelationskoefficienter mellem proteinekspression og klinisk-patologiske fund blev estimeret ved hjælp af Pearson korrelation metode. Statistisk signifikans blev sat til

P

. 0,05

Resuts

Angivelse af TMPRSS4 i Arkiveret Gastric vævsprøver og ikke-tumor slimhinde

TMPRSS4 protein blev påvist i 14 af 92 (15,22%) humane ikke-tumor mucosa prøver, og alle prøver udtrykte protein på et lavt niveau. TMPRSS4 protein blev påvist i 245 af 436 (56,19%) tilfælde af human mavekræft, blev høj ekspression af TMPRSS4 protein påvist i 203 (46,56%) tumorer. TMPRSS4 blev lokaliseret hovedsageligt i cytoplasmaet eller kernen af ​​primær cancer (figur 1A, B og C).

A TMPRSS4 negativ i noncancerous væv, forstørrelse x 400. B TMPRSS4 blev stærkt udtrykt i moderat differentieret adenocarcinom, forstørrelse × 400. C TMPRSS4 blev stærkt udtrykt i dårligt differentieret adenocarcinom, forstørrelse × 400 hhv. D Erk1 negativ i noncancerous væv, forstørrelse × 400. E Erk1 blev stærkt udtrykt i moderat differentieret adenocarcinom, forstørrelse × 400. F Erk1 blev stærkt udtrykt i dårligt differentieret adenocarcinom, forstørrelse × 400.

Angivelse af Erk1 i Arkiveret Gastric vævsprøver og ikke-tumor slimhinde

Erk1 protein blev påvist i 16 af 92 (17.39%) humane ikke-tumor mucosa prøver, og alle prøver udtrykte protein på et lavt niveau. Erk1 protein blev påvist i 231 af 436 (52,98%) tilfælde af human mavekræft, blev høj ekspression af Erk1 protein påvist i 173 (39,68%) tumorer. Erk1 blev lokaliseret hovedsageligt i cytoplasmaet eller kernen af ​​primær cancer (Figur 1D, E og F).

Sammenhæng mellem TMPRSS4 Up-regulering og kliniske funktioner i mavekræft

Høj udtryk for TMPRSS4 korreleret med alder, størrelse, Lauren klassificering, dybde invasion, lymfeknude og fjernmetastaser, regional lymfeknude scenen og TNM stadie (

P

0,05) (tabel 1). TMPRSS4 udtryk korrelerede ikke med køn, tumor placering, differentiering, eller histologisk klassifikation (

P

0,05). (Tabel 1)

Sammenhæng mellem Erk1 Up-regulering og klinisk Funktioner af gastrisk kræft

høj udtryk for Erk1 korreleret med alder, tumor placering, størrelse, dybde af invasion, differentiering, Laurens klassificering, lymfeknude og fjernmetastaser, regional lymfeknude scenen og TNM stadie (

P

0,05) (tabel 2). Erk1 udtryk korrelerede ikke med køn, eller histologisk klassifikation (

P

0,05). (Tabel 2)

Sammenhæng mellem TMPRSS4 Expression og Prognose

I fase i, II og III tumorer, den 5-årige overlevelsesrate hos patienter med høj ekspression af TMPRSS4 var signifikant lavere end hos patienter med lavt udtryk (

P

0,05) (Figur 2). I fase IV tumorer, gjorde udtryk for TMPRSS4 ikke korrelerer med 5-års overlevelse (

P

0,05) (Figur 2)

0:. Negativ, 1: positiv.

Sammenhæng mellem Erk1 Expression og Prognose

i fase i, II og III tumorer, den 5-årige overlevelsesrate hos patienter med høj ekspression af Erk1 var signifikant lavere end hos patienter med lav ekspression (

P

0,05) (Figur 3). I fase IV tumorer, gjorde udtryk for Erk1 ikke korrelerer med 5-års overlevelse (

P

0,05) (Figur 3)

0:. Negativ, 1: positiv.

Multivariate analyse af klinisk-patologisk Parametre og Prognose

De faktorer med mulige prognostiske effekter i gastrisk karcinom blev analyseret af Cox regressionsanalyse. Undersøgelsen viste, at lymfeknude og fjernmetastaser (

P

= 0,005), TNM stadie (

P

= 0,005), udtryk for TMPRSS4 (

P

= 0,000) og Erk1 (

P

= 0,000) var uafhængige prognostiske faktorer af patienter med gastrisk karcinom. Men alder, køn, tumor placering og størrelse, histologisk klassifikation, tumor differentiering, invasion dybde, Lauren klassificering, og regional lymfeknude etape havde nogen prognostisk værdi.

Association blandt Expression af TMPRSS4 og Erk1

To hundrede og fire gastriske kræfttilfælde havde lav udtryk for både TMPRSS4 og Erk1, og et hundrede og fyrre-fire gastriske kræfttilfælde havde høj ekspression af både TMPRSS4 og Erk1. Der var signifikant sammenhæng mellem TMPRSS4 og Erk1 (χ

2 = 155,1; P = 0,0001) (tabel 3). Vi har detekteret også resultaterne af TMPRSS4-positive /Erk1-negative, TMPRSS4-positive /Erk1-positive, TMPRSS4-negativ /Erk1-positive og TMPRSS4-negative /Erk1-negative gastrisk patienter, og vi fandt, at der var en betydelig forskel i overordnede sammenligninger (χ

2 = 256,9; P = 0,000, figur 4). Den gennemsnitlige overlevelsestid var 42,8 ± 2,23, måneder for TMPRSS4 (+) /Erk1 (-) gruppe, 27,9 ± 1,27 måneder for TMPRSS4 (+) /Erk1 (+), 54,7 ± 0,72 måneder for TMPRSS4 (-) /Erk1 (- ), 39,2 ± 3.19 måneder for TMPRSS4 (-) /Erk1 (+), henholdsvis

diskussion

af de mange molekyler involveret i carcinogenese og udvikling af menneskelig. tumorer, proteaser er blevet grundigt undersøgt som vigtige deltagere i carcinogenese af mange tumorer. For nylig er meget opmærksomhed været fokuseret på den rolle, type II transmembrane serinproteaser (TTSPs) under tumorudvikling [15] – [16]. TTSPs er medlemmer af familien af ​​celleoverflade-associerede proteaser, der medierer en række normale cellulære funktioner samt tumorinvasion og metastase.

TMPRSS4 er en TTSP der har været kendt at være opreguleret i flere kræftformer, især i bugspytkirtlen og skjoldbruskkirtelkræft [4], [17], og udtryk for TMPRSS4 er blevet korreleret med metastatisk potentiale af kræft i bugspytkirtlen [3]. TMPRSS4 er nødvendige og tilstrækkelige for den humane lungecancer-cellelinie NCI-H322, til colonadenocarcinomcellelinje Colo205, og kolorektal cancer cellelinje HCT15 udrette migration og invasion [18]. Undersøgelsen viste, at ekspressionen af ​​TMPRSS4 i mavekræft læsioner blev tæt forbundet med alder, størrelse tumor, placeringen af ​​tumor, dybde invasion, invasion fartøj, lymfeknude og fjernmetastaser og TNM stadie. Ekspressionen af ​​TMPRSS4 viste sig at signifikant korrelere med prognosen af ​​gastrisk cancer. I trin I, II og III, de 5-års overlevelsesrater for patienter med høj ekspression af TMPRSS4 var signifikant lavere end hos patienter med lavt udtryk. I fase IV, har TMPRSS4 udtryk ikke korrelerer med 5-årige overlevelsesrate. Yderligere multivariat analyse foreslog, at dybden af ​​invasion, lymfeknude og fjernt metastase, TNM stadie, og opregulering af TMPRSS4 var uafhængige prognostiske indikatorer for mavekræft. Overekspression af TMPRSS4 har en kritisk rolle ved strålingsinduceret formidling og metastase af resterende hepatocellulært carcinom langsigtet ved at lette epithelial-mesenchymal overgang (EMT) [19]. Ekspression af TMPRSS4 i tumorer med pladecellecarcinom (SCC) histologi viste sig at være signifikant højere end dem med adenocarcinom (AC) histologi. Kaplan-Meier kurver viste, at høje niveauer af TMPRSS4 signifikant var forbundet med reduceret samlet overlevelse hos patienter med SCC histologi, hvorimod ingen sammenhæng blev fundet for AC histologi [20].

Erk1 involveret i carcinogenese gennem regulering forskellige cellulære processer, såsom proliferation, differentiering og cellecyklusprogression som svar på en række ekstracellulære signaler. Hepatoma vækstfaktor er involveret i mavens carcinogenese processen og fremmer proliferation og metastase via Erk1 /2-aktivering [21]. ERK1 som en vigtig formidler af lysophosphatidsyre signalering fører til opregulering af sphingosinkinase en (SphK1), og punkt til SphK1 og sphingosin-1-fosfat produktion som potentielle terapeutiske mål i gastrisk kræft [22]. Samspillet mellem FVIIa og TF inducerer protease-aktiveret receptor 2 aktivering, derved udløser ERK1 /2 og IKB-α /NF-KB signaltransduktionsvej at regulere genekspression af IL-8, TF, og caspase-7, og i sidste ende fremmer SW620 celleproliferation og migration [23]. Ekspressionen af ​​Erk1 i gastrisk cancer og dens kliniske betydning er ikke forstået. Den aktuelle undersøgelse var at undersøge ekspressionen af ​​Erk1 i 436 kirurgiske eksemplarer af mavekræft ved immunhistokemi. Undersøgelsen viste, at høj ekspression af Erk1 protein blev påvist i 173 (39.68%) tumorer. Høj udtryk for Erk1 korreleret med alder, tumor placering, størrelse, dybde af invasion, differentiering, Laurens klassificering, lymfeknude og fjernmetastaser, regional lymfeknude fase, TNM stadie og dårlig prognose.

Vi yderligere undersøgt TMPRSS4 udtryk i gastrisk kræft prøver og dets overensstemmelse med Erk1 udtryk. Vi fandt en positiv korrelation mellem TMPRSS4 og Erk1 udtryk, hvilket tyder på, at TMPRSS4 kan være involveret i carcinogenese, progression og metastase af gastrisk kræft gennem fremme af celledeling ved Erk1 aktivering.