PLoS ONE: progastrin undertrykker Alternativ Aktivering af humane makrofager og modulerer deres indflydelse på tyktarmskræft epitelceller

Abstrakt

Makrofag infiltration er en negativ prognostisk faktor for de fleste kræftformer, men gastrointestinale tumorer synes at være en undtagelse. Effekten af ​​makrofager om kræft progression afhænger af deres fænotype, som kan variere mellem M1 (pro-inflammatorisk, defensiv) til M2 (toleranceudviklende, pro-tumorale). Gastrointestinale cancere bliver ofte en ektopisk kilde til gastriner og makrofager tilstedeværende receptorer for disse peptider. Formålet med den foreliggende undersøgelse er at analysere, om gastriner kan påvirke mønster af makrofaginfiltration i kolorektale tumorer. Vi har vurderet forholdet mellem gastrin ekspression og mønstret af makrofaginfiltration i prøver fra kolorektal cancer og indflydelsen af ​​disse peptider på fænotypen af ​​makrofager differentierede fra humane perifere monocytter in vitro. Det samlede antal makrofager (CD68 + celler) var ens i tumor- og normal omgivende væv, men antallet af M2 makrofager (CD206 + celler) var signifikant højere i tumoren. Imidlertid er antallet af disse tumorassocierede M2 ​​makrofager korrelerede negativt med immunoreaktiviteten for gastrin peptider i tumorceller epitelceller. Makrofager differentieret fra humane perifere monocytter i nærværelse af progastrin viste lavere niveauer af M2-markører (CD206, IL10) med normale mængder af M1-markører (CD86, IL12). Progastrin inducerede lignende virkninger i modne makrofager behandlet med IL4 at opnå en M2-fænotype eller med LPS plus IFNy at generere M1-makrofager. Makrofager differentierede under tilstedeværelse af progastrin præsenteret en reduceret ekspression af Wnt-ligander og faldt antallet og øget celledød af samdyrket kolorektal cancer epitelceller. Vores resultater tyder på, at progastrin hæmmer erhvervelsen af ​​en M2-fænotype i humane makrofager. Denne effekt udøves på tumorassocierede makrofager kan modulere kræft progression og bør tages i betragtning, når man analyserer den terapeutiske værdi af gastrin immunoneutralisation

Henvisning:. Hernández C, Barrachina MD, Cosín-Roger J, Ortiz-Masiá D, Álvarez Á, Terrádez L, et al. (2014) progastrin undertrykker Alternativ Aktivering af humane makrofager og modulerer deres indflydelse på tyktarmskræft epitelceller. PLoS ONE 9 (6): e98458. doi: 10,1371 /journal.pone.0098458

Redaktør: Joseph Najbauer, University of Pécs Medical School, Ungarn

Modtaget: December 4, 2013; Accepteret: Maj 4, 2014 Udgivet: 5 juni 2014

Copyright: © 2014 Hernández et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Educación y Ciencia /EFRU [tilskud nummer SAF2007-064201], Ministerio de Ciencia e Innovacion [tal tilskud SAF2010-20231, SAF2010-16030 og RYC-2011-09.571], Ministerio de Sanidad y Consumo [tilskud nummer PI11 /00327], CIBERehd [tilskud nummer CB06 /04/0071] og Generalitat Valenciana [tilskud nummer PROMETEO /2010/060]. Carlos Hernandez anerkender støtte fra “Ramon y Cajal ‘program fra Ministerio de Ciencia e Innovación Spanien (RYC-2011-09.571). Jesús Cosín-Roger er støttet af FPU stipendier fra Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Makrofager er en væsentlig del af tumorer og vise en lang række funktioner afhængigt af det lokale miljø. De kan være pro-inflammatoriske og bidrage til at skabe adaptive immunreaktioner (klassisk aktiverede makrofager, M1) eller tolerogene /antiinflammatoriske (alternativt aktiverede makrofager, M2) [1], [2]. Tumorassocierede makrofager (TAM’er) ofte ligner M2-makrofager og dermed i stedet for at bekæmpe kræftceller, disse leukocytter fremme tumorvækst ved at dæmpe immunresponsen og gennem sekretion af vækst- og angiogene faktorer samt enzymer, der er nødvendige for celle invasion. Som følge heraf er tilstedeværelsen af ​​TAM’er blevet korreleret med en nedsat overlevelse hos patienter med f.eks melanom, bryst-, nyre- eller blærecancer. Situationen synes at være forskellige i nogle ondartede processer, som påvirker mavetarmkanalen. Hos patienter med colorectal eller gastriske cancere en højere makrofaginfiltration korrelerer med en bedre prognose [3]. Årsagerne til denne forskel rolle makrofager i disse særlige sygdomme er langt fra klar, men fra den nuværende viden kan man udlede, at kolorektal /gastrisk tumor mikromiljø markerer en anden ligevægt i funktionen af ​​infiltrerede M1 og M2 makrofager, med M2 makrofager udøver en defekt opposition til de ledsagende M1-fagocytter [4], [5]. Men de mekanismer, der er ansvarlige for denne effekt er ukendte.

De fleste adenomatøs polypper, tyktarms- og gastriske tumorer udtrykker ektopisk den gastrin-genet. Disse cancerceller er, ikke på en endokrin natur og hovedsagelig syntetisere hormonet precursor progastrin [6] – [8], som har proliferativ virkning på cancerceller [9]. Selvom progastrin kan binde med lav affinitet til gastrin CCK-2-receptorer, og denne interaktion kan bidrage til en vis grad til dets biologiske aktivitet [10], vises progastrin vækst-fremmende virkning hovedsagelig at blive medieret af en ikke-konventionel receptor nylig identificeret som annexin II [9]. Vi har observeret, at gastrin udøver en pro-inflammatorisk aktivitet gennem CCK-2-receptorer [11] – [13], som er udtrykt i makrofager og endotelceller, mens annexin II er overudtrykt på overfladen af ​​makrofager, når den tjener som en patogen genkendelseselement og medierer makrofagaktivering [14].

Vores hypotese var, at gastrin peptider lokalt producerede i colon tumorer kan påvirke funktionen af ​​infiltrerede makrofager og, på denne måde, modulere immunreaktionen over for sygdom. Vi observerede, at ekspressionen af ​​gastriske peptider i colorektale tumorceller korrelerer med en reduceret infiltration af M2-makrofager og viste, at progastrin modulerer modningsprocessen af ​​humane makrofager in vitro, og undertrykker erhvervelse af en M2-fænotype. Progastrin reducerede også udskillelsen af ​​Wnt-ligander af M2-makrofager og øget deres evne til at inducere apoptose af tyktarmskræft epitelceller.

Metoder

Patienter

Enogtyve kurativt resekteres kolorektal karcinom patienter (tabel 1) blev udvalgt tilfældigt fra patienter opereret på Hospital de Manises. Ingen af ​​dem havde nogen præoperativ radio /kemoterapi. Umiddelbart efter resektion blev et stykke indeholdende tumor og omgivende normale væv fikseret i bufret formalin og indlejret i paraffin. Erfarne patologer dokumenteret histopatologiske karakteristika for de tumorer, herunder tumor fase, differentiering kvalitet, størrelse, lymfe /angioinvasion, perineural invasion og lymfeknudeinvolvering. Tumor etape blev defineret i henhold til TNM. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board af The Hospital Manises (Valencia). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

Inmunohistochemistry

Serial sektioner (4 um) af prøver indeholdende tumor og normal slimhinde fra hver patient blev farvet for gastrin, Wnt1, CD68 som en makrofag markør, CD86 som en M1-makrofag markør eller CD206 som en M2-makrofag markør. Prøver blev underkastet forskellige metoder til antigen hentning afhængigt af epitopen (tabel 2). Endogen peroxidaseaktivitet blev undertrykt ved nedsænkning i 0,3% hydrogenperoxid. Når blokeret med 5% hesteserum blev snit inkuberet natten over (4 ° C) med den tilsvarende primære antistof (tabel 2). En hest anti-muse /kanin biotinyleret antistof (Vector Laboratories, CA, USA, 1:200) blev anvendt som et sekundært antistof. Den Vectastain elite ABC-system Kit (Vector Laboratories, CA, USA), efterfulgt af DAB Enhanced Flydende substrat System for Immunhistokemi (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) blev anvendt til udvikling. Alle væv blev modfarvet med hematoxylin og specificiteten af ​​immunfarvning blev bekræftet, hvis analoge vævssnit viste et fravær af farvning efter anvendelse af ikke-immun immunoglobulin af samme isotype og i samme koncentration som det primære antistof eller efter udeladelse det sekundære antistof.

Et repræsentativt område (mål 40X, 6 felter, 0,22 mm

2) fra tumoral væv eller tilstødende normale kirtelvæv blev udvalgt til kvantitativ analyse af makrofag infiltration. Gastrin farvning i hver prøve blev evalueret, og en score for intensitet fra 1 til 4 fik. Kun cancer epitelceller reagerede på gastrin antistof og intensiteten af ​​farvningen var meget homogent gennem hele epiteltumor rum. Alle prøver blev behandlet parallelt og en observatør, uvidende om patienten antal og forskellig fra den person, der bearbejdes og analyseres de makrofag immunfarvninger, tildeles en score for hver patient baseret på intensiteten af ​​farvning observeret i tre billeder er repræsentative for forskellige dele af tumor.

Cellekultur

Humane perifere mononukleare celler blev isoleret fra raske donorer ved Ficoll-densitetsgradientcentrifugering. Monocytter blev podet i vævskulturplader og modnet til makrofager ved dyrkning i X-Vivo 15 medium (BioWhittaker) suppleret med 1% humant serum og 20 ng /nl af rekombinant human M-CSF (Peprotech) ved 37 ° C i 5% CO

2 for op til 6 dage. For at opnå en M1 polarisering blev celler inkuberet med 1 ug /ml LPS (fra Escherichia coli 0111: B4, Sigma-Aldrich) plus 20 ng /ml humant rekombinant IFNy (Peprotech) for de sidste 24 timer. M2 polarisering blev opnået ved behandling af celler med 20 ng /ml humant rekombinant IL4 (Peprotech) for de sidste 48 timer af dyrkningsperioden. Modningsprocessen samt aktivering behandlinger blev udført i nærvær eller fravær af forskellige koncentrationer af progastrin (10

-11-10

-7, Abgent). Salg

Caco-2 celler (American Type Culture Collection, VA, USA) blev dyrket i MEM-medium (Sigma-Aldrich) suppleret med 20% inaktiveret bovint føtalt serum, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 2 mM L-glutamin, 100 mM natrium pyruvat og 1% ikke-essentielle aminosyrer.

Caco-2-celler blev co-dyrket med monocytafledte makrofager under anvendelse Transwell inserts (Corning Incorporated, MA, USA) med en 0,4 um porøs membran [12] . Monocytter blev podet på disse indsatse og differentieret til makrofager i nærvær eller fravær af forskellige koncentrationer af progastrin. På dag 6 efter podning, blev inserterne anbragt oven på Caco-2-celler (t = 0) og blev opretholdt i co-kultur i 24 timer.

Tilstedeværelsen af ​​overflademolekyler CD86 (M1) og CD206 (M2) i dyrkede makrofager blev analyseret ved fluorescensmikroskopi (mikroskop IX81, Olympus, Hamburg, Tyskland). Makrofager blev inkuberet med Hoechst for at identificere kerner og med fluorescerende mærkede antistoffer mod disse mål (tabel 2). Fluorescens blev analyseret med den statiske cytometri software ScanR ( 5000 celler /brønd). .Den Koncentration af cytokinerne IL12 (Th1) og IL10 (Th2, antiinflammatorisk) i cellesupernatanter blev bestemt ved ELISA (Diaclone)

antallet af Caco-2 celler efter co-kultur blev talt i en Newbauer kammer. Apoptose i disse celler blev undersøgt ved flowcytometri som bivariate Annexin V /PI analyse (apoptose Detection Kit, Abcam).

Totalt RNA fra makrofager eller Caco-2-celler blev isoleret ved hjælp af ekstraktion kittet (ILLUSTRERET RNAspin Mini GE Healthcare Life Science) og cDNA blev opnået med Prime Script RT reagens Kit (Takara Biotechnology). Real-time PCR blev udført med Prime Script Reagent Kit Perfect Real Time (Takara Biotechnology) i en thermo cycler LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Specifikke oligonukleotider blev designet i henhold til sekvenserne vist i tabel 3. Relativ genekspression blev udtrykt som beskrevet tidligere [15].

Statistisk analyse

Data er udtrykt som middelværdi ± middelfejl. og blev sammenlignet ved variansanalyse (enkelt-ANOVA) med et Newman-Keuls post-hoc korrektion for multiple sammenligninger eller en t-test efter behov. En P-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. De kliniske korrelationer i humane prøver blev analyseret ved hjælp af Pearsons korrelationskoefficient.

Resultater

M2 makrofag nummer øges i tumorale området

Vi analyserede først mængden og fænotype af makrofager i ikke-tumor og tumor områder af colorectale cancerpatienter. Immunhistokemi for CD68 (makrofag markør), CD86 (M1 makrofag markør) og CD206 (M2 makrofag markør) blev udført i biopsiprøver fra kolorektale karcinom resektioner. Af note, antallet af makrofager var sammenlignelig i tumor og normal omgivende væv, men antallet af M1 og M2 makrofager var signifikant forskellig mellem de to områder (figur 1). Tumorstroma indeholdt et lavere antal CD86 (+) celler end lamina propria af det normale væv. I modsætning hertil blev et større antal CD206 (+) celler stødt på i tumoral væv sammenlignet med normalt omgivende væv, hvilket antyder, at tumorudvikling fremmer differentieringen af ​​monocytter til M2 makrofager.

immunoreaktivitet til CD68 (MF markering, A-B), CD86 (M1-MF markering, C-D) og CD206 (M2-MF markering, E-F) blev analyseret i colorektal cancer (B, D, F) og raske omkringliggende slimhinde (A, C, E ). (G) Kvantitativ analyse af positive celler for disse molekyler i et repræsentativt område på 0,22 mm

2 (Scale bar = 0,2 mm). Søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 21). ** P 0,01 og *** P. 0,001 vs tilsvarende værdi i normal slimhinde

gastrin udtryk øges i tumoren, men negativt korrelerer med antallet af M2 makrofager

søgning efter mediatorer, der kunne modulere fænotypen af ​​makrofager i tumoren undersøgtes betydningen af ​​gastrin peptider på ekspressionen af ​​forskellige makrofagmarkører i biopsiprøver. Da gastrin antistof, der anvendes i denne undersøgelse genkender både gastrin og gastrin forstadier, ligesom progastrin, vi kan ikke skelne mellem forskellige gastrin peptider, men vi observeret omfattende immunoreaktivitet i tumor-epitelceller i biopsier analyseres. Farvning i hver prøve blev evalueret, og en score for intensitet fra 1 til 4 fik (figur 2A). Ingen korrelation blev observeret mellem gastrinniveauer i tumorer og antal samlede (CD68 + celler) eller M1 (CD86 + celler) makrofager enten i tumoren eller i normalt væv (figur 2B og 2C). Overraskende er antallet af M2 makrofager i tumor- og normalt væv korreleret negativt med gastrin-ekspression. Denne korrelation var mere markant i tumoren, hvor peptidet syntetiseres. Taget sammen antyder disse data, at gastrin peptider syntetiseret af tumorceller reducerer antallet af M2 makrofager, uden at påvirke den samlede makrofag nummer.

Antallet af totale makrofager (CD68 + celler, B), M1-makrofager (CD86 + celler, C) og M2-makrofager (CD206-celler, d), i tumoren og normal omgivende væv blev analyseret i forhold til gastrin ekspression i tumoral væv (A, score 1 til 4, skala bar = 0,2 mm). observeres En negativ og signifikant sammenhæng mellem intensiteten af ​​gastrin farvning og antallet af M2-makrofager i normal slimhinde og tumoral væv (D).

progastrin nedsætter differentieringen af ​​makrofager i retning af et M2 fænotype

Vi hypotese, at progastrin kunne være ansvarlig for de observerede på makrofag fænotype effekter, fordi kolon kræftceller mangler de enzymer, der er nødvendige for fuldstændig gastrin modning [7]. For at undersøge om progastrin kan modulere differentieringen af ​​makrofager til en M1- eller M2-fænotype vi behandlede humane perifere monocytter opnået fra raske frivillige med adskillige koncentrationer af progastrin og forlod dem til at differentiere. Statiske cytometri forsøg udført med specifikke fluorescerende antistoffer viste, at progastrin reduceret ekspression af M2-markør CD206 i monocytafledte makrofager selv ved den laveste koncentration analyseret. I modsætning hertil blev der påvist nogen ændringer i ekspressionen af ​​M1-markør CD86. Derudover målte vi koncentrationen af ​​IL-12 og IL-10 i supernatanten af ​​monocytafledte makrofager efter 6 dages differentiering i nærværelse af stigende doser af progastrin. Gastrin precursor fremkaldte en signifikant reduktion af IL-10-sekretion, men ændrede ikke IL-12 niveauer (figur 3). Vores data indikerer, at progastrin hæmmer ekspressionen af ​​M2-markører under makrofagdifferentiering uden at påvirke ekspressionen af ​​M1-markører

Humane perifere monocytter blev udledt til makrofager i nærvær eller fravær af progastrin og fænotypen af ​​det resulterende. makrofager evalueret ved at analysere de følgende parametre: ekspression af CD86 (A, C, n = 3); ekspression af CD206 (B, D, n = 3); sekretion af IL12 (F, n = 4); og sekretion af IL10 (G, n = 4). Søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM. * P 0,05 og ** P. 0,01 vs tilsvarende værdi i vehikelbehandlede celler

For at studere effekten af ​​progastrin på IL4-medieret differentiering af makrofager i retning af et M2-fænotype vi inkuberes fuldt differentierede monocyt-afledte makrofager med IL-4 og forskellige doser af progastrin i to dage. Basale makrofager behandlet med IL-4 viste en betydelig stigning i CD206 ekspressionen, en ikke-signifikant stigning i IL-12-sekretion og lignende IL-10-produktion end kontroller. Progastrin reducerede signifikant induktion af CD206 med IL-4 og forøget IL-12-sekretion til niveauer signifikant højere end dem, der observeres i kontrolceller, mens sekretion af IL-10 forblev uændret. Men differentiering af makrofager i retning af en M1-fænotype blev ikke påvirket af progastrin. Behandling med LPS plus IFNy øgede ekspression af CD86, og udskillelsen af ​​både IL12 og IL10 i makrofager, men progastrin ikke ændre nogen af ​​disse parametre (figur 4).

Humane monocytafledte makrofager blev stimuleret med LPS plus IFNy at opnå en M1-fænotype eller med IL4 til opnåelse M2-makrofager i nærvær eller fravær af progastrin, og den resulterende fænotype vurderes ved at analysere de følgende parametre: ekspression af CD86 (a, n = 3); ekspression af CD206 (B, n = 5); sekretion af IL10 (C, D, n = 5); og sekretion af IL-12 (E, F, n = 5). Søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM. * P 0,05 vs tilsvarende værdi i vehikelbehandlede celler;

+ P 0,05 og

++ P. 0,01 vs tilsvarende værdi i kontrol celler

progastrin nedregulerer Wnt ligander i makrofager og øger celledød i co-dyrkede Caco2 celler

Næste vi undersøgt, om modulation af makrofag fænotype ved progastrin kunne påvirke de omgivende tumorceller. Vi har for nylig rapporteret, at M2-makrofager syntetiserer og udskiller Wnt ligander, som kan modulere samdyrket epitelcelle adfærd [16] og i den foreliggende undersøgelse observerede vi immunoreaktivitet for Wnt1 i celler af tumorstroma. Kvalitativ vurdering af ekspressionen af ​​denne Wnt ligand indikerer, at mængden af ​​positive celler falder som gastrin produktion i cancerceller stiger (figur 5A). En kausal sammenhæng mellem de to faktorer er påpeget af vores in vitro-undersøgelser viser, at makrofager modnes i tilstedeværelse af progastrin præsentere et betydeligt reduceret mRNA udtryk for tre forskellige Wnt ligander (Wnt1, Wnt3a, og Wnt5, figur 5B-5D). Funktionel relevans af nedregulering af de tre Wnt ligander i makrofager demonstreres af, at Caco2 celler co-dyrket med progastrin-behandlede makrofager udtrykt mindre Lgr5 mRNA end Caco2 celler co-dyrket med kontrol makrofager (figur 5E). Disse data indikerer, at virkningerne af progastrin på makrofag-afledte Wnt ligander modulere Wnt signalvejen i omgivende tumorceller.

immunreaktivitet over Wnt1 i stroma af colorektal cancer i forhold til ekspressionen af ​​gastrin i det samme væv (skala bar = 0,2 mm) (A); og virkningerne af tilstedeværelsen af ​​progastrin under differentiering af humane perifere monocytter til makrofager på mRNA-ekspression af tre forskellige Wnt ligander i disse makrofager (B-D, n = 5) og mRNA-ekspression af Lgr5 i samdyrket Caco-2 celler (E , n = 7). Søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM. * P 0,05 og ** P. 0,01 vs tilsvarende værdi i vehikelbehandlede celler

Desuden co-kultur af Caco-2 med progastrin-behandlede makrofager resulterede i en betydelig reduktion i den samlede antal epitelceller sammen med en forøget apoptose (figur 6).

virkningerne af humane monocytafledte makrofager opnået i nærvær eller fravær af progastrin om antallet (A) og hastigheden af ​​apoptose ( B) af Caco-2-celler blev analyseret i et co-kultursystem (24 h, n = 4). Søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM. * P 0,05 vs tilsvarende værdi i vehikelbehandlede makrofager,

+ P 0,05 og

++ P 0,01 vs celler inkuberet med en tom indsats (w /o MF)

diskussion

Denne undersøgelse viser, at makrofager, der infiltrerer colorektale tumorer har en anden fænotypisk profil end dem, der er til stede i det normale væv, der omgiver den cancerøse læsion, med en højere andel af de antiinflammatoriske M2-makrofager og væsentligt lavere antal klassisk aktiverede M1-makrofager. Interessant, vores resultater viser, at gastrin ekspression i tumoral væv udøver en negativ indflydelse på antallet af tumorale M2-makrofager.

Ekspressionen af ​​gastrin i tumorale epitelceller korrelerer negativt med antallet af tumorale M2-makrofager og vores in vitro resultater tyder en årsagssammenhæng mellem de to faktorer. Humane makrofager opnået ved dyrkning perifere monocytter i nærvær af progastrin viste en reduceret ekspression af CD206. Desuden dette peptid forhindrede signifikant ekspressionen af ​​CD206 når modne makrofager blev stimuleret med Th2-cytokin IL4 at inducere en M2-fænotype. I modsætning hertil progastrin ikke påvirke ekspressionen af ​​co-stimulerende molekyle CD86 enten i hvilebetingelser eller i makrofager stimuleret med LPS plus IFNy at udvikle en M1-fænotype. Progastrin påvirker også mønstret af cytokinsekretion. Makrofager modnes i nærvær af dette peptid frigivet lavere mængder af det anti-inflammatoriske cytokin IL10 samtidig opretholde normal frigivelse af Th1 inducer IL12. I IL4-stimulerede makrofager, virkningerne for cytokinsekretion var forskellige, men i den samme retning. I dette tilfælde IL10 frigivelse var upåvirket, mens peptidet lettes IL12 sekretion. Det er således expectable at disse makrofager, der er under indflydelse af progastrin i cancervævet præsentere en svækket antiinflammatorisk, immunsuppressiv profil.

Denne virkning er i overensstemmelse med den tidligere beskrevne proinflammatoriske virkning af gastrin [11 ] – [13]. Vi observerede, at gastrin bidrager til inflammation induceret af Helicobacter pylori hos rotter sandsynligvis gennem CCK-2 receptor-aktivering i makrofager mens stimuleringen af ​​denne receptor aktiverer humane endotelceller at fremme monocytadhæsion. CCK-2-receptorer kan binde alle gastrin peptider, skønt deres affinitet for moden gastrin er signifikant højere end påvist for progastrin. Aktionerne på sidstnævnte kan alternativt sendes af den nyligt karakteriseret ukonventionel receptor annexin-II [9]. Begge typer af receptorer er til stede i makrofager og begge veje fremmer makrofagaktivering [14]. De foreliggende resultater forstærker forestillingen om, at gastrin peptider har tendens til at bidrage til inflammation selvom forskellige mekanisme kan være involveret i hvert tilfælde.

Indflydelsen af ​​makrofager på cancer progression skyldes deres virkning på immunrespons mod tumor men også til en direkte lokal virkning på de omgivende epitelcancerceller. Makrofager kan være en kilde til Wnt-ligander [17], den onkogene pathway aktiveres i de fleste af tarmkræft og en betydelig bidragyder til kræftcelle stemness [18], [19]. Sekretion af disse faktorer er særlig relevant i en subpopulation af TAMs, der synes at spille en særlig rolle i tumorindtrængen ved at fremme angiogenese og tumorcelle migration gennem Wnt-signalering [20], [21]. Wnt1 blev detekteret i celler fra tumoren stroma og dets tilstedeværelse tendens til at falde, som niveauet af gastrin i tumoren forøges. Vi har for nylig observeret, at udskillelse af Wnt-ligander specifikt forøges i M2 makrofager, der fremmer Wnt /β-catenin-signalvejen og den deraf proliferative aktivitet i samdyrket coloncancer-celler [16]. Vore foreliggende resultater viser, at makrofager modnes i nærvær af progastrin udtrykke mindre mængder af tre forskellige Wnt ligander og provokere en signifikant reduktion i antallet af co-dyrket Caco-2-celler. Denne effekt forekommer med et samtidigt fald i ekspression i disse colon celler af Lgr5, en Wnt målgen [22], der potentierer Wnt /β-catenin signalering [18]. Desuden makrofager modnes i nærvær af progastrin tendens til at forøge apoptose hastigheden i Caco-2-celler, en virkning, der kan også være relateret til reduceret Wnt signalering [23]. Således er de fænotypiske ændringer induceret af progastrin i makrofager ændre deres indflydelse på tyktarmskræft epitelceller resulterer i en formindsket antal af disse celler sandsynligvis ved en kombination af reduceret proliferation og forøget apoptotisk celledød. Derudover har nedsat produktion af Wnt-ligander induceret af progastrin kan også bidrage til de beskrevne fænotypiske ændringer induceret af dette peptid, idet en autokrin virkning af Wnt5a i makrofager til at reducere ekspressionen af ​​IL12 i afhængighed bakterielle produkter er blevet beskrevet [24].

fra vores resultater, vi kan udlede, at gastriner, ved at hæmme erhvervelsen af ​​en M2-fænotype i lokale makrofager, kan regulere kræft progression. Det er klart, at M2 makrofager stimulere væksten af ​​colon-cancer epitelceller in vitro og eksperimentelle undersøgelser viser, at M2-makrofager i tumoren fremme coloncancer i mus [25] – [27]. I humane kolorektal kræft, effekten af ​​M2-makrofager virker mere kompliceret og påvirkes af flere faktorer som deres rumlige fordeling [4], den relative mængde af M1 makrofager [5] eller den fase af sygdommen [4]. Selv om deres tilstedeværelse er blevet set som en negativ prognostisk faktor af nogle forfattere [28], andre foreslår, at M2 makrofager har en mindre farlig effekt i human tyktarmskræft end i andre indstillinger og peger på den idé, at nogle lokale faktor specifikt til stede i denne form af tumorer kan være nedregulere deres tumor fremme handling [4], [5], [29]. I betragtning af at M1 og M2 makrofager er ikke klonalt forskellige sæt af celler, men ekstreme et bredt spektrum af mellemliggende fænotyper og at klassifikation af en celle som en M2 makrofag kan være forspændt ved molekylær markør valgt i hvert tilfælde lancerer vi idé, at disse makrofager identificeret som M2 i disse undersøgelser kan være mindre skadelig på grund af progastrin.

En direkte proliferativ funktion af progastrin på epitelceller er blevet tydeligt vist i isolerede celler og mus, og eksperimentelle undersøgelser med transgene dyr tyder at overekspression af gastriner i nærvær af DNA-ødelæggende midler forøger carcinogenese. Denne dokumentation har bedt flere farmakologiske strategier til at neutralisere aktiviteten af ​​gastrin peptider, med gode resultater i murine modeller, men desværre få og ubestemte resultater i patienter [30]. Vores resultater antyder, at i det mindste hos mennesker, kan progastrin spille en mangesidet rolle i progressionen af ​​kolorektale tumorer, som dens proliferative aktivitet på epitelceller ville blive modarbejdet af en potentielt anti-tumoral virkning, der udøves på makrofager. Relevansen af ​​denne effekt på immunceller for den globale aktivitet progastrin venter evaluering af fremtidig forskning.

Konklusioner

Vores undersøgelse tyder på, at gastrin peptider syntetiseret af kolon kræftceller har makrofager som deres mål og sandsynligvis påvirke inflammatoriske infiltrat af tumoren, som igen påvirker udviklingen af ​​kræft. Hæmningen af ​​M2-polarisering induceret af progastrin ville modvirke deres proliferative aktivitet, og selv om det er vanskeligt at vurdere omfanget af denne effekt, bør tages denne observation i betragtning, når man analyserer den terapeutiske værdi af gastrin immunoneutralisation [31].

tak

Vi takker Brian Normanly for hans engelske sprog redigering og Hematology Tjeneste Hospital Clínico Universitario de Valencia til udvinding af blodprøver.