PLoS ONE: Reduceret Warburg Effekt i Cancer celler, der undergår autofagi: Steady- State 1H-MRS og real-time hyperpolariseret 13C-MRS Studies

Abstrakt

Autophagy er et stærkt reguleret, afhængig energi cellulær proces, hvor proteiner, organeller og cytoplasma er afsondret i autophagosomes og spaltet for at opretholde cellulær homeostase. Vi antager, at under autofagi induceret i cancerceller ved i) sult gennem serum og aminosyre- deprivation eller ii) behandling med PI-103, et klasse I PI3K /mTOR inhibitor, ville glycolytiske metabolisme blive påvirket, hvilket reducerer flux til lactat, og at denne virkning kan være reversibel. Vi probed stofskifte under autophagy i kolorektal HT29 og HCT116 Bax knock-out celler ved hjælp af hyperpolariseret

13C-magnetisk resonans spektroskopi (MRS) og steady-state

1 H-MRS. 24 timers PI103-behandling eller sult forårsaget betydelig reduktion i den tilsyneladende fremad hastighedskonstant (k

PL) til pyruvat til laktat udveksling sammenlignet med kontroller i HT29 (100 uM PI-103: 82%, p = 0,05) og HCT116 Bax -ko celler (10 uM PI-103: 53%, p = 0,05; 20 uM PI-103: 42%, p 0,0001; sult: 52%, p 0,001), forbundet med reduceret laktat udskillelse og intracellulær lactat i hver sager, og uændret lactatdehydrogenase (LDH) aktivitet og øget NAD + /NADH-forholdet efter PI103 behandling eller nedsat LDH aktivitet og uændret NAD + /NADH-forholdet efter sult. Efter 48 timers nyttiggørelse fra PI103 behandling, k

PL fortsat under kontrol niveauer i HT29-celler (74%, p = 0,02), og øget ovenfor behandlede værdier, men forblev under 24 timers vehikelbehandlede kontrolniveauer i HCT116 Bax-ko celler (65%, p = 0,004) begge var ledsaget af vedvarende reduktion i laktat udskillelse, genvinding af NAD + /NADH-forholdet og intracellulær laktat. Efter genopretning af sult, k

PL var signifikant højere end 24 timers vehikelbehandlede kontroller (140%, p = 0,05), der er forbundet med øget LDH aktivitet og total cellulære NAD (H). Ændringer i k

PL og cellulære og udskilles laktat forudsat målbare indikatorer for de store metaboliske processer, der ledsager starvation- og narkotika-induceret autofagi. Ændringerne er vendbare, vender tilbage hen imod og over kontrolværdier på cellulær opsving, som potentielt identificerer modstand. k

PL (hyperpolariseret

13C-MRS) og laktat (

1H-MRS) give nyttige biomarkører for autophagic proces, der gør det muligt ikke-invasiv overvågning af Warburg effekten

Henvisning.: lin G, Andrejeva G, Wong Te Fong AC, Hill DK, Orton MR, Parkes HG, et al. (2014) Reduceret Warburg Effekt i Cancer celler, der undergår Autophagy: steady state

1 H-MRS og Real-Time hyperpolariseret

13C-MRS Studies. PLoS ONE 9 (3): e92645. doi: 10,1371 /journal.pone.0092645

Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA

Modtaget: 27. juni, 2013; Accepteret: 25 februar 2014; Udgivet: 25 Mar 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne anerkende den modtagne støtte fra Cancer Research UK og EPSRC Cancer Imaging Center i samarbejde med MRC og Department of Health (England) giver C1060 /A10334, også NHS finansiering til NIHR Biomedical Research Centre, MRC-finansierede studentship, også Chang Gung Medical Foundation (Taiwan) giver CMRPG370443 og CMRPG3B1922. MOL er en NIHR Senior Investigator. Forfatterne også takke Alice Warley på Kings College i London Center for Ultrastrukturel Imaging (CUI) for at få hjælp med elektronmikroskopi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Autophagy er en lysosomer-afhængig reversibel katabolsk cellulært respons aktiveres i sult eller stress, hvorved proteiner, organeller og cytoplasma er sekvestreret i dobbelt-membran autophagosomes og efterfølgende fordøjet og genanvendes til at opretholde cellulær metabolisme [1]. Autophagy er afgørende for at opretholde cellulær homeostase og er en stærkt reguleret proces, der kan genopbygge forarmet energilagre under sult ved fjernelse og nedbrydning af cytoplasmatiske komponenter. langvarig aktivering af autophagic pathways, kan imidlertid føre til nedbrydning af organeller og kritiske proteiner, som kan resultere i celledød [2], [3]. Autophagy er blevet undersøgt i mange forskningsområder, herunder kræft [2] – [4], hjertekarsygdomme [5] og neurodegeneration [6], da på den ene side giver det en biologisk beskyttelsesmekanisme som reaktion på cellulære spændinger, men på den anden det kan også bidrage til celledød mekanismer. Denne proces kan paradoksalt nok tillade kræftceller til at overleve i fjendtlige miljøer og nyttiggørelse støtte, da stress er fjernet, hvilket giver en potentiel mekanisme af resistens over for behandling [4]. Nogle anti-cancer behandlinger, såsom PI3K /mTOR-hæmmere, er kendt for at inducere autofagi i cancerceller [7] og kan også fremkalde autophagy i tumorer, potentielt forlænge tumor overlevelse [4], [8]. I øjeblikket er autofagi bedst vurderes ved observation af dobbelt-membran autophagic vakuoler ved elektronmikroskopi (EM) og western blotting af omdannelsen af ​​ubiquitin-lignende protein LC3I at LC3II [9]. Der er i øjeblikket ingen ikke-invasive metoder til at overvåge induktion af autofagi eller efterfølgende nyttiggørelse fra autofagi. Endvidere er de metaboliske ændringer, der ledsager autofagi og overvindelse af denne proces dårligt forstået.

Kræftceller ofte udviser forøget aerob glycolyse, også kendt som Warburg effekten, med øget transkriptionel regulering af en række glycolytiske enzymer herunder lactatdehydrogenase -A (LDH-A). Øget Warburg effekt er blevet vist at drive både tumorvækst og spredning af metastaser og er forbundet med dårligt resultat i cancer [10]. Autophagy involverer mange store metaboliske processer, hvoraf nogle er reguleret af onkogene signalveje. Der er betydelig samspil mellem autophagic kontrolpunkter og centrale knudepunkter i onkogene signalveje, hvilket fører til pathway hæmmere i nogle tilfælde direkte påvirker autophagic proces, eller indirekte modulere de samme metaboliske veje, som er fremkaldt af autophagy [11], [12]. For eksempel hæmning af mTORC1 er en vigtig drivkraft for induktion af autofagi i cancerceller [11], [12]. Cellular stress som følge af mangel på aminosyrer eller direkte PI3K hæmning kan forårsage autophagy via hæmning af mTORC1 med begge disse processer forårsager metaboliske virkninger ud over dem, som direkte følger autofagi. Disse situationer kan også opstå under kræftbehandlingen i patienter.

Magnetic Resonance Imaging (MRI) er almindeligt anvendt til billedbehandling i medicin og MR spektroskopi (MRS) giver kemisk specifik analyse af metabolit-koncentrationer i celleekstrakter, hele celler , vævsbiopsier og

in vivo

[13]. Nylige fremskridt i hyperpolariseret

13C-magnetisk resonans spektroskopi (MRS) Anvender Dynamic Nuclear Polarisering (DNP) har gjort det muligt betydelig forøgelse af den iboende

13C-MRS signal ved mange størrelsesordener i en række metabolitter og har gjort det muligt real -Tiden målinger af kinetikken af ​​en række vigtige endogene enzymreaktioner både

in vitro

i suspensioner af levedygtige hele celler og

in vivo

i tumorer [14]. Den tilsyneladende kurs konstant hyperpolariseret [1-

13C] pyruvat til lactat (k

PL) giver en potentiel metabolisk biomarkør til diagnosticering [15], og for at vurdere behandlingsrespons [16] – [20]. k

PL har også vist sig at falde efter lægemiddelinduceret celledød, tilskrevet apoptose med aktiveringen af ​​poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og udtømning af cofaktorer nikotinamidadenindinukleotid (NAD (H)) [14 ].

forventes TCA cyklus for at blive mere aktive under autophagy, som aminosyrerne og fedtsyrer genereret af autophagic proces udnyttes til at opretholde energi-homeostase [21], hvilket fører til modulation af aerob glykolyse i autophagic celler. Vi antager, at disse ændringer vil føre til en reduktion i flux fra pyruvat til laktat, som kunne vendes, hvis celler genvundet fra autofagi. I denne undersøgelse, vi målte den tilsyneladende [1-

13C] pyruvat til lactat valutakurs, k

PL ved DNP og

13C-MRS, for at udvikle en ikke-invasiv biomarkør for narkotikarelaterede induceret autophagy og efterfølgende nyttiggørelse fra autophagy, og for at få yderligere indsigt i de metaboliske ændringer, der ledsager lægemiddelinduceret autofagi. Vi undersøgte de langsgående metaboliske ændringer i forbindelse med narkotika-induceret autophagy og inddrivelse og sammenlignede dem med de metaboliske ændringer, der er forbundet med den etablerede model for autophagy, induktion af sult. Vi brugte to cellelinjer, HT29 og Bax-mangelfuld HCT116 coloncarcinom (HCT116 Bax-ko) [22], i disse undersøgelser. HCT116 Bax-ko celler har nedsat apoptoseveje muliggør vurdering af de metaboliske ændringer forbundet med lægemiddel-induceret autophagy i fraværet af apoptose. Autophagy blev induceret i disse celler enten ved serum og aminosyre- sult med Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) medier, eller ved behandling med PI-103, et klasse I PI3K /mTOR inhibitor [7].

Vores undersøgelsen bekræftede vores hypoteser, der viser, at celler, der undergår autofagi havde reduceret k

PL målt med DNP og

13C-MRS sammen med reduceret intracellulær laktat og laktat udskillelse målt ved

1H-MRS, hvilket afspejler en reduceret Warburg effekt under starvation- og narkotika-induceret autophagic cellulære processer. Disse vigtige metaboliske effekter er vendt, når celler komme fra starvation- og narkotika-induceret autophagy, giver et potentielt middel til at identificere modstand. Resultaterne viser, at målingerne af k

PL ved hyperpolariseret

13C-MRS, samt laktat ved

1 H-MRS give følsomme biomarkører for de metaboliske effekter forbundet med starvation- og narkotika-induceret autofagi sammen med dens inddrivelse, der giver vigtige oplysninger om et vigtigt aspekt af kræft cellens stofskifte.

Materialer og metoder

Cell kultur

Alle medier og reagenser til cellekultur blev købt fra Life Technologies . HT29-celler (fra American Type Culture Collection, ATCC) blev dyrket i McCoy 5A-medium med glutamin og HEPES. HCT116 Bax-ko-celler (en venlig gave fra Dr. Bert Vogelstein, Johns Hopkins Medical Center, USA; via Dr. Paul Clarke, ICR, Sutton, UK [23]) blev dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium med glutamin og ikke- essentielle aminosyrer. 10% varmeinaktiveret FCS med 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin blev tilsat i hver medium. Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære og vækstmedier genopfyldes hver 48 timer. HT29-celler blev behandlet med 100 pM PI-103 i 24 timer. HCT116 Bax-KO-celler blev behandlet med HBSS medium i 6 eller 24 timer og med 10 uM eller 20 uM PI-103 i 24 timer.

I den cellulære og metaboliske analyse af celler udvundet fra autophagy, 24 hr HBSS eller 20 uM PI-103-behandlede HCT116 Bax-KO-celler og 100 uM PI-103-behandlede HT29-celler blev opretholdt i yderligere 48 timer ved normal DMEM (med glutamin, ikke-essentielle aminosyrer, 10% føtalt kalveserum og penicillin tilføjet) eller McCoy 5A medium (med glutamin og HEPES) dyrkningsmedier under standardbetingelser, henholdsvis.

Cell-cyklus analyse

2 × 10

6 celler blev fikseret med 70% ethanol i 30 minutter ved 4 ° C, inkuberet med 100 ug /ml RNAase og 40 ug /ml PI i phosphatbufret saltvand for 301min ved 37 ° C. DNA histogrammer blev genereret ved FACS-analyse.

Annexin V /PI analyse

5 × 10

5-celler blev resuspenderet i bindingsbuffer, inkuberet ved 25 ° C i 5 minutter i mørke med 5 pi fluoresceinisothiocyanat (FITC) -annexin-V og 5 pi PI (BioVision), og analyseret ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS, BD LSRII flowcytometer) for at bestemme annexinbinding og PI udstødelse.

Western blotting Salg

Cellelysater blev analyseret ved western blotting som tidligere [22] beskrevne. Cellelysat protein blev overført til Immobilon-P-membraner (Millipore, Bedford MA, USA). Blots blev blokeret i 5% fedtfri mælk eller 5% bovint serumalbumin og derefter inkuberet med primært antistof i pS6RP (Cell Signaling), S6RP (Cell Signaling), p4E-BP1 (Cell Signaling), total 4E-BP1 (Cell Signaling) , Pakt (Cell Signaling), total Akt (Cell Signaling), kløvet PARP (Cell Signaling), caspase 3 (Cell Signaling), LC3 (Cell Signaling), MCT-1 (Millipore) eller MCT-4 (Santa Cruz Biotechnology). Membranerne blev derefter inkuberet med anti-kanin sekundært antistof (GE Healthcare). Western blots for α-tubulin (Cell Signaling) billede belastningskontrol. Specifikke bindende antistof for målgruppen protein interaktioner blev påvist under anvendelse forøget kemiluminescens plus reagenser (Amersham Biosciences, Buckingham-shire, UK) og udsættelse for enten Hyperfilm ECL (Amersham) eller XOMAT Kodak (Rochester NY, USA) autoradiografi film.

Laktatdehydrogenase enzymatisk assay

I alt cellulære LDH aktiviteter blev målt ved hjælp af standard Spectro-fotometrisk metoder [24]. Cellerne blev opsamlet ved standard trysin behandling, lyseret på is i ekstraktionsbuffer (Triethanolamin /HCL 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl

2 2 mM, mercaptoethanol 26 mM) og centrifugeret ved 16000 g i 10 min, hvilket gav total proteinkoncentrationer i supernatanterne fra ca. 5 mg /ml. Reaktioner blev startet ved tilsætning assayopløsninger (Triethanolamin /HCL 60 mM, NADH 0,17 mM, Sodium pyruvat 0,4 mM, Triton 0,05%), og aktiviteterne i LDH enzymer blev målt spektrofotometrisk ved 340 nm, med enzymatiske aktiviteter målt som nmol /min pr millioner af celler.

NAD + /NADH måling

i alt cellulære NAD + /NADH-forhold blev målt ved hjælp af en NAD + /NADH kvantificering kit (BioVision, Mountain View, CA, USA), i henhold til protokollen billede.

elektronmikroskopi

Celler blev dyrket i 13 mm skåle og fikseret i 4 timer i 2,5% glutaraldehyd fiksativ i phosphatbuffer ved 4 ° C. Efter fiksering blev cellemonolag anbragt i glutaraldehyd vaskeopløsning og derefter sende-fikseret i Millonigs osmiumtetroxid fiksativ i 15-30 minutter. Kulturerne blev dehydreret gennem en gradueret række af 10% til 100% ethanol, infiltreret, og derefter indlejret i medium TAAB Premix Resin. Ultratynde snit blev indsamlet på kobbergitre og farvet med uranylacetat og bly citrat. Sektioner blev vist ved hjælp af en Hitachi H7600 transmission elektron mikroskop.

DNP

13C-MRS undersøgelser

[1-

13C] pyrodruesyre indeholdende 15 mM OX63 frie radikaler blev polariseret for 1 time i en HyperSense DNP polarisator (Oxford Instruments Molecular Biotools Ltd, Abingdon, UK) ved 3.35T og 1,4 K som tidligere beskrevet [25]. Det polariserede prøve blev opløst i en phosphatbufferet opløsning indeholdende 50 mM umærket lactat, EDTA og NaOH for at opnå en endelig pH på 7. 100 pi af denne blanding blev tilsat til en 500 pi suspension af celler (~40-80 millioner celler) i en 5 mm NMR-rør. Den endelige koncentration af polariseret pyruvat var 8 mM, hvorefter seriel

13C-MRS spektre blev erhvervet i en BBO sonde hver 2 sek med en 10 ° radio-frekvens puls på en 500 MHz Bruker NMR-system (Bruker BioSpin, Coventry, UK). Celler blev holdt ved 37 ° C hele vejen igennem. Seriel spektre var fase og baseline korrigeret, og integreret med Topspin software (Bruker BioSpin, Coventry, UK). De integrerede peak integraler i pyruvat /lactat eksperimenter blev afbildet som en funktion af tid og mindste kvadraters-montering blev udført i Matlab (The Mathworks Inc., Natick, MA, USA). De tilsyneladende hastighedskonstanter blev opnået ved samtidigt montering pyruvat og lactat integraler til de modificerede Bloch ligninger under anvendelse af en to-site udveksling model inkorporerer flipvinkel korrektion som tidligere beskrevet [25]. De tilsyneladende hastighedskonstanter (k

PL) for den fremadrettede reaktion omdannelsen af ​​pyruvat til laktat normaliseres til celle nummer.

1 H-MRS ° f dyrkningsmedium og celleekstrakter

Celler blev ekstraheret ved dobbelt fase ekstraktionsmetoder, som tidligere beskrevet [26]. Vandopløselige ekstrakter blev frysetørret og rekonstitueret i 700 pi deutereret vand (D

2O, Sigma Aldrich) og ekstrakterne (500 pi) placeret i 5 mm NMR-rør. 50 pi 0,75% natrium-3-trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionate (TSP) i D

2O (Sigma-Aldrich) blev tilsat til prøverne til kemisk skift kalibrering og kvantificering. Kultur medier prøver fra celler efter forskellige behandlingsregimer blev også analyseret ved

1H-MRS, indsamlet før celler blev høstet for cellulære ekstraktioner. 500 pi medier prøve og 50 pi D

2O blev placeret i NMR-rør med 50 pi 0,75% TSP i D

2O for kemiske skift kalibrering og kvantificering. Spectral opgaver var baseret på litteratur værdier [27].

1H spektre blev erhvervet med Bruker 500 MHz spektrometer (Tyskland) med 7500 Hz spektral bredde, 16384 tidspunkter domæne peger, 128 scanninger, temperatur 298 K, erhvervelse tid ca. 5 minutter. Vandet resonans blev undertrykt af gated bestråling centreret på vandet frekvens. Spectral behandling blev udført ved hjælp af Topspin-2 softwarepakke (Bruker BioSpin, Coventry, UK), og metabolitkoncentrationer blev kvantificeret og normaliseret til celle nummer.

Statistisk analyse

Data er præsenteret som middelværdien ± standardfejl på middelværdien. Til sammenligning af metabolisk flux, metabolit-koncentrationer og forhold, blev den uparrede t-test anvendes med en P-værdi på ≤0.05 anses for at være statistisk signifikant. Alle statistiske tests var to-sidet.

Resultater

PI-103-behandling og sult forårsager reversibel autofagi i HT29 og HCT116 Bax-ko celler

Induktion af autofagi blev observeret i HCT116 Bax-ko og HT29-celler behandlet med PI-103, som bekræftes af overekspression af LC3II i western blots (figur 1a og b). Induktion af autophagy og overekspression af LC3II blev også fundet i HCT116 Bax-ko celler efter 6 og 24 timer af sult i HCT116 Bax-ko-celler (figur 1a). Et højere LC3I og LC3II udtryk blev set efter 24 timer af sult sammenlignet med 6 timer sult. Efter fjernelse af PI-103 behandling eller genopfyldning af normalt vækstmedium efter 24 timers af PI-103 behandling eller sult henholdsvis overekspression af LC3II vendte tilbage til basale niveauer efter 48 timer på genopretning (figur 1b-d). Derfor blev den 48 timers tid-point efter 24 timers sult eller PI-103 behandling valgt til DNP og

1 H-MRS-målinger inddrivelse. Der var ingen tegn på apoptose som vist ved manglen på spaltet PARP eller ændring i caspase 3 udtryk i PI-103-behandlede eller sultede celler (Figur 1a-d). For at opnå en positiv kontrol for apoptose, blev apoptose induceret i HCT116 vildtype (WT) -celler ved TRAIL behandling, som TRAIL er blevet rapporteret at inducere apoptose i HCT116 WT-celler [22]. Som forventet blev der observeret tilstedeværelsen af ​​spaltet PARP og reduceret caspase 3-niveau i TRAIL-behandlede HCT116 WT celler sammenlignet med bærerbehandlede kontroller (figur 1b og c).

(a) Western blots af LC3, spaltet PARP, caspase 3 og α-tubulin i kontrol- HCT116 Bax-KO-celler og i 10 uM eller 20 uM PI-103-behandlede eller 6 timer og 24 timer HBSS-behandlede HCT116 Bax-KO-celler. (B) Western blots af LC3, kløvet PARP, caspase 3 og α-tubulin i kontrol HT29-celler og i 24 timers 100 pm PI-103-behandlede HT29-celler og på 24 timer, 48 timer og 72 timer af deres helbredelse. TRAIL-behandlede HCT116 WT celler anvendes som positiv kontrol for apoptose, som TRAIL er blevet rapporteret at inducere apoptose i HCT116 WT-celler [22]. Som forventet blev tilstedeværelsen af ​​spaltet PARP og stærkt reducerede caspase 3 udtryk observeret i 24 timers TRAIL-behandlede HCT116 WT celler sammenlignet med vehikelbehandlede kontroller. (C) Western blots af LC3, kløvet PARP, caspase 3 og α-tubulin i kontrol- HCT116 Bax-ko celler og i 24 timer 20 uM PI-103-behandlede HCT116 Bax-ko celler og på 24 timer og 48 timer af deres genopretning . TRAIL-behandlede HCT116 WT celler anvendes som positiv kontrol for apoptose. (D) Western blots af LC3, kløvet PARP, caspase 3 og α-tubulin i kontrol HCT116 Bax-ko celler og i 24 timer HBSS-behandlede HCT116 Bax-ko celler og i 24 og 48 timer af deres helbredelse.

tilstedeværelsen af ​​autophagic vakuoler blev bekræftet ved elektronmikroskopi udført i udsultet (som dobbelt-membran autophagosomes) eller PI-103-behandlede (overvejende som senere fase autolysosomal strukturer) HCT116 Bax-ko celler, hvilket indikerer induktion af autophagy (figur 2). Autophagic vakuoler var fraværende i kontrol celler.

elektronmikroskopi billeder af autophagic vakuoler i kontrol, 10 uM eller 20 uM PI-103-behandlede eller 6 timer og 24 timers HBSS-behandlede HCT116 Bax-ko celler. Røde pile illustrerer nogle af de autophagic vakuoler på forskellige stadier af autophagy processen.

Niveauer af apoptose og nekrose i HT29 og HCT116 Bax-ko celler under sult og PI-103 behandling blev vurderet i vedhængende celler ved annexin V /PI analyse (figur 3a) viser et flertal af levedygtige celler med en lille procentdel af nekrotisk (HT29 DMSO-behandlet (køretøj-kontrol): 6,5 ± 2,2%; 100 uM PI-103: 10,7 ± 2,7% (p = 0,29); HCT116 Bax-ko DMSO-behandlede (vehikel-kontrol): 1,5 ± 0,1%; 6 timer sultet: 1,9 ± 0,2% (p = 0,06) og 24 timer sultet: 3,0 ± 0,4% (p = 0,01); 10 uM PI-103: 4,6 ± 0,4% (p = 0,02) og 20 uM PI-103: 6,6 ± 0,4% (p = 0,79)) eller apoptotiske celler (HT29 DMSO-behandlede: 1,0 ± 0,7%; 100 uM PI- 103: 2,0 ± 1,4% (p = 0,54); HCT116 Bax-ko køretøj-kontrol: 6,6 ± 0,5%; 6 timer sultet: 10,5 ± 0,8% (p = 0,001) og 24 timer sultet: 13,8 ± 0,8% (p = 0,003); 10 uM PI-103: 4,0 ± 0,1% (p = 0,26) og 20 uM PI-103: 4,1 ± 0,2% (p = 0,30)) i kontrol og behandlede grupper. Ingen flydende celler blev observeret i nogen af ​​de behandlede grupper.

(a) Annexin V og propidiumiodid-farvning (PI) assay, der måler den andel af celler, som undergår apoptose og nekrose i HT29-celler efter 24 timer på 100 uM PI -103 behandling og HCT116 Bax-ko celler efter 24 timer på 10 uM eller 20 uM PI-103 behandling, eller 6 timer eller 24 timer af sult. Data er udtrykt som middel til procent ± s.e.m. (Minimum

n

= 3 i hver gruppe). Statistisk signifikante ændringer er angivet (* p 0,05). (B) Cell antal sammenlignet med 24 timers DMSO-behandlede kontroller i HT29-celler efter 24 timers DMSO-behandlede opsving, 24 timers på 100 uM PI-103 behandling og dens 48 timer nyttiggørelse og 24 timers vehikelbehandlede kontroller i HCT116 Bax-ko celler efter 24 timer på 10 uM eller 20 uM PI-103 behandling, eller 6 timer eller 24 timer af sult og dets nyttiggørelse fra 24 timers på 20 uM PI-103 behandling eller sult. Data er udtrykt som middel til procent ± s.e.m. (Minimum

n

= 3 i hver gruppe). Statistisk signifikante ændringer er angivet (* p 0,05). (C) Cell cycle analysis. Dataene er midler procentdel ± s.e.m. HT29-celler 24 timers DMSO-behandlede kontrol, 24 timers DMSO-genvundet kontrol, 24 timers PI-103-behandlet 100 uM, 24 timers PI-103-genvundet, 48 timers PI-103-genvundet, (

n

= 3 i hver gruppe); HCT116 Bax-ko celler 24 timers DMSO-behandlede kontrol, 24 timers DMSO-genvundet kontrol, 24 timers PI-103-behandlet 20 uM, 24 timers PI-103-genvundet, 48 timers PI-103-genvundet, (

n

= 3 i hver gruppe); HCT116 Bax-ko celler 6 timer fuld medier kontrol, 6 timer sult (HBSS), 24 timers fuld medier kontrol, 24 timers sult (HBSS), 48 timers HBSS-genvundet (

n

= 3 i hver gruppe) . * P. 0,01

Et reduceret antal vedhæftende celler blev fundet i alle behandlingsgrupper efter 24 timers på 100 pM behandling i HT29-celler (78 ± 2%, p 0,01), 6 timer og 24 timer af sult (46 ± 0,1% og 36 ± 0,4%, p 0,01) eller 24 timer på 10 uM og 20 uM PI-103 behandling (65 ± 0,1% og 58 ± 0,1%, henholdsvis p 0,01 ) i HCT116 Bax-KO-celler i sammenligning med kontroller (figur 3b). En stigning i antallet af adhærente celler over de 24 timers vehikelbehandlede kontrolniveauer blev observeret i PI-103-induceret (170 ± 8%, p 0,05 (HCT116 Bax-ko); 303 ± 16%, p 0,01 ( HT29)) og sult-induceret (117 ± 7%, p 0,05) og autophagic celler efter 48 timer for inddrivelse (figur 3b), hvilket indikerer, at cellen befolkningen steget over kontrolniveauer efter helbredelse fra autofagi. De 24 timers køretøj behandlede celler blev anvendt som kontroller for både behandling og nyttiggørelse grupper, som kontrolcellerne ville være for konfluente ved 48 timer for helbredelse.

Cellecyklusanalyse ved flowcytometri blev udført på hver behandlingsgruppe , og efter 24 timer og 48 timer for inddrivelse (figur 3c). En 24 timers restitutionstid-punkt for DMSO-behandlede kontroller blev også inkluderet for hver PI-103 forsøg som de celletal for disse grupper svarer til celleantal af PI-103-behandlede celler efter 48 timer for helbredelse. G1 anholdelse blev observeret i HT29 og HCT116 Bax-ko celler efter behandling med PI-103, vender tilbage til 24 timers DMSO-behandlede niveau med 48 timers for inddrivelse (figur 3c). Øget G1-fasen blev også fundet i 24 timer udvindes DMSO-behandlede HT29 (9 ± 3%, p = 0,01) og HCT116 Bax-ko (11 ± 1%, p = 0,004) -celler sammenlignet med 24 timers DMSO-behandlede celler. Procentdelene af 24 timers genvundet DMSO-behandlede celler i hver fase af cellecyklussen, er meget lig den 48 timer udvindes PI-103-behandlede tid-punkt i både HT29 og HCT116 Bax-KO-celler (figur 3C). Dette kan skyldes den genvundne kontrol (DMSO-behandlet) og PI-103-behandlede celler er mere sammenflydende ved disse tidspunkter, hvilket er konsistent med deres sammenlignelige celleantal.

Ingen ændring i cellecyklus profilen af ​​HCT116 Bax-KO-celler blev observeret efter 6 eller 24 timers sult (figur 3c). Et fald i G1 (12 ± 4%, p = 0,04) og en stigning i G2 fase (5 ± 1%, p = 0,003) blev fundet i 48 timer udvindes HCT116 Bax-KO-celler sammenlignet med 24 timers medie-behandlet kontrol celler og celle numre er ens mellem de to grupper (figur 3C). Ingen signifikant ændring i cellestørrelse iagttoges i nogen af ​​behandlingsgrupperne sammenlignet med kontroller.

PI-103-behandling reducerer AKT og mTOR pathway aktivering i HT29 og HCT116 Bax-KO-celler, og denne proces er reversibel

virkningerne af PI-103 behandling på AKT og mTORC veje blev undersøgt i HT29 og HCT116 Bax-ko celler under behandling og i 24 og 48 timer for inddrivelse. Nedsat udtryk for Pakt og p4E-BP1 blev set i HT29 og HCT116 Bax-ko celler efter 24 timers af PI-103 behandling med udtryk af disse proteiner vender tilbage til niveauet før behandlingen efter 48 timers for inddrivelse (figur 4a og b). Reduceret PS6 ekspression blev også fundet i PI-103-behandlede HCT116 Bax-ko celler og dens niveau genvundet fra 24 timers for inddrivelse (figur 4b). Taget sammen indikerer disse data, at behandling med PI-103 inhiberer AKT og mTOR pathway i begge cellelinier og denne proces er reversibel, når lægemidlet fjernes, og cellerne får lov til at komme sig.

Western blots af PS6 ribosomale protein, alt S6 ribsomal protein, p4E-BP1, total 4E-BP1, Pakt, total Akt og α-tubulin (lastning kontrol) i PI-103-behandlede og inddrivelse i HT29 og HCT116 Bax-ko celler.

Real-time tilsyneladende

13C-pyruvat til lactat valutakurser er reduceret i PI-103-og sult-induceret autophagy, resterende reduceret efter genvinding fra PI-103, men stigende med genvinding af sult

hyperpolariseret [1-

13C] pyruvat til laktat udveksling blev overvåget i realtid af

13C-MRS at måle udveksle kinetik i autophagic celler. Figur 5a viser gennemsnitlige

13C-MR-spektre beregnet for hver gruppe som summen over hele det dynamiske tidsserier for HCT116 Bax-KO cellesuspensioner efter tilsætning af hyperpolariseret [1-

13C] pyruvat i kontrol, 24 timer sult og 48 timers for inddrivelse fra autofagi. Figur 5b viser den tilsvarende tidsserier af den normaliserede spids integralet af lactat signal i de samme grupper. Tilsyneladende valutakurs konstant k

PL blev målt ved ikke-lineære mindste kvadraters passer til de dynamiske data i hver gruppe, og data præsenteres som nøgletal (behandlet /24 timer køretøj kontrol) i figur 5c.

(a) hyperpolariserede

13C-spektret fra en HCT116 Bax-ko celleassay viser summen over hele det dynamiske tidsserier fra en kontrolcelle eksperiment, efter 6 timer sult, 24 hr sult med HBSS medier og efter 24 timers udsultning efterfulgt med 48 timers celleindvinding. Spektret viser toppe fra pyruvat (Pyr), laktat (Lac) og pyruvat hydrat (Pyr H). (B) Plot af toppen lactat integral som funktion af tiden normaliseret til pyruvat peak integrerende til tiden t = 0 s og normaliseret per million celler erhvervet til HCT116 Bax-KO kontrolceller, 24 timers sult med HBSS medier og 24 timers sult efterfulgt af 48 timers restitution. (C) De gennemsnitlige forhold (behandlet /24 hr køretøj-kontrol) af den synlige frem reaktionshastigheden for pyruvat til lactat udveksling k

PL (afledt af montering af forsøgsdata og normaliseret til celleantal) (± SEM) for 24 timers DMSO-behandlede nyttiggørelse, 100 uM PI-103 behandlede og 48 timer restitution efter 100 uM PI-103 behandling i HT29-celler; for 10 uM PI-103 behandlede, 20 uM PI-103 behandlede og 48 timer restitution efter 20 uM PI-103 behandling i HCT116 Bax-KO-celler; og i 6 timer HBSS sult, 24 timers HBSS sult og 24 timers sult efterfulgt af 48 timers opsving i HCT116 Bax-ko celler. Minimum

n

= 3 i hver gruppe. Statistisk signifikante ændringer er angivet (* p ≤ 0,05)

Nedsat k

PL blev observeret i HT29-celler behandlet med PI-103. (82 ± 7% af kontrol; p = 0,05) ( Figur 5c). Ingen signifikant forskel i k

PL blev fundet mellem 24 hr DMSO-vehikel-behandlede gruppe og 24 timers genvundet DMSO-vehikelbehandlede gruppe (figur 5c) i HT29-celler, til trods for celleantal og populationen af ​​celler i G1-fasen bliver højere i 24 timer udvindes DMSO-behandlede gruppe (figur 3b og c). Derfor k

PL i grupperne recovery blev sammenlignet med dens respektive 24 timers vehikelbehandlede kontroller. k

PL forblev lavere i HT29-celler efter 48 timer for inddrivelse fra PI-103 behandling (74 ± 4% af kontrol; p = 0,02)., sammenlignet med 24 timers DMSO-behandlede kontroller (figur 5c)

Reduceret k

PL blev fundet i HCT116 Bax-ko celler behandlet med 10 pM (52,5 ± 9,4% af kontrol; p = 0,05) og 20 uM PI-103 (41,1 ± 5,3% af kontrol; p 0,0001 ) sammenlignet med DMSO-vehicle kontroller (figur 5c). Efter 48 timers for inddrivelse den tilsyneladende hastighedskonstant blev ophøjet i forhold til behandling satser, men vendte ikke tilbage til 24 timers bærerbehandlede kontrol satser (65 ± 7% af kontrol; p = 0,004). (Figur 5c)