PLoS ONE: PCR assays versus Direkte sekventering til evaluering af effekten af ​​KRAS status på Anti-EGFR Treatment respons i tyk- og endetarmskræft Patienter: en systematisk gennemgang og Meta-Analysis

Abstrakt

Baggrund

overlevelsesraten for kolorektale cancer (CRC) patienter der bærer vildtype-KRAS øges betydeligt ved at kombinere anti-EGFR monoklonalt antistof (mAb) med standard kemoterapi. Der er dog modstridende data i både vildtype-KRAS og mutant KRAS grupper, som i høj grad slås CRC anti-EGFR behandling. Her gennemførte vi en meta-analyse i et forsøg på at give mere pålidelige oplysninger om anti-EGFR behandling i CRC patienter.

Metoder

Vi søgte fuldstændige rapporter om randomiserede kliniske forsøg ved hjælp Medline, den amerikanske Society of Clinical Oncology (ASCO), og European Society for Medical Oncology (ESMO). To efterforskere uafhængigt screenede den publicerede litteratur ifølge vores inkluderende og eksklusive kriterier og de relative data blev udtrukket. Vi brugte anmeldelse manager 5.2 software til at analysere data.

Resultater

Tilsætning af anti-EGFR mAb til standard kemoterapi væsentligt forbedret både progressionsfri overlevelse (PFS) og median samlet overlevelse (MOS ) i vildtype-KRAS-gruppe; hazard ratio (timer) for PFS og mos var 0,70 [95% konfidensinterval (CI), 0,58-0,84] og 0,83 [95% CI, 0,75-0,91], hhv. I sub-analyser af vildtype-KRAS-gruppe, hvor PCR-baserede analyser er ansat, PFS og MOS især øge: HRS var 0,74 [95% CI, 0,62-0,88] og 0,87 [95% CI, 0,78-0,96] , henholdsvis. I sub-analyser af mutant KRAS gruppen, hverken PCR assays eller direkte sekventering forbedre PFS eller mos.

Konklusion

Vores data tyder på, at PCR-baserede analyser med høj følsomhed og specificitet tillader præcis identifikation af patienter med vildtype-KRAS og dermed øge PFS og MOS. Desuden sådanne analyser befri patienter med mutant KRAS fra unødvendige narkotika bivirkninger, og give dem mulighed for at få den fornødne behandling. Således etablere en præcis standard reference test vil væsentligt optimere CRC-målrettede behandlinger

Henvisning:. Shan L, Li M, Ma J, Zhang H (2014) PCR assays versus Direkte sekventering til evaluering af effekten af KRAS status på Anti-EGFR Treatment respons i tyk- og endetarmskræft Patienter: en systematisk gennemgang og meta-analyse. PLoS ONE 9 (9): e107926. doi: 10,1371 /journal.pone.0107926

Redaktør: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: April 7, 2014 Accepteret: August 21, 2014; Udgivet: 26 September, 2014

Copyright: © 2014 Shan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Finansieringen blev leveret af National Natural Science Foundation of China (Grant nr 30.901.727, 81.372.496). HZ modtaget ydede finansiering. URL til 81372496: https://isisn.nsfc.gov.cn/egrantindex/funcindex/prjsearch-list. URL til 30901727: https://isisn.nsfc.gov.cn/egrantindex/funcindex/prjsearch-list. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Ingen forfattere erklærede eventuelle interessekonflikter

Introduktion

i løbet af de sidste to årtier, betydelige fremskridt med hensyn til molekylærbiologi kolorektal cancer (CRC) har bemærkelsesværdigt steget de biologiske behandlingsmuligheder [1]. Et vigtigt gennembrud var opdagelsen af ​​to monoklonale antistoffer (mAb) rettet mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR): kimære immunglobulin G1 mAb (Cetuximabs) og et fuldt humaniseret immunglobulin G2 mAb (panitumumab). Disse antistoffer har vist sig at være meget effektiv i kombination med standard kemoterapi eller som enkelte terapeutiske midler til kemoterapi-resistent metastaserende CRC (mCRC) [2], [3]. I 2004 USA Food and Drug Administration (FDA) godkendt cetuximab som det første mAb hæmmende EGFR til behandling af mCRC, som blev efterfulgt af godkendelse af panitumumab i 2006 [4], [5]. Desværre har næsten en tredjedel af FRK patienter ikke drage fordel af denne målrettede behandling, men også oplever følgeskader bivirkninger [6], [7]. Det er således afgørende at identificere de patienter, der er mest tilbøjelige til at reagere for at opnå personlig behandling. KRAS protein er en vigtig signalmolekyle mellem ekstracellulære EGFR-ligander og signalering i celler. Omfattende retrospektive studier og fase III forsøg afslørede, at KRAS-genet aktiverende mutationer er den vigtigste negative indikator for mCRC anti-EGFR-behandling [8] – [10]. Baseret på disse resultater, FDA ændrede retningslinjer for at anbefale, at cetuximab og panitumumab kun gives til CRC patienter med vildtype-KRAS [11]. Men forskere fortsat rapportere modstridende fakta i både KRAS vildtype og mutant grupper: for eksempel, patienter der bærer vildtype-KRAS ikke reagerer, mens de bærer mutant KRAS gjorde [12] – [15]. Sådanne modstridende data kraftigt udfordre mCRC behandling. Uanset den sporadisk rapporterede bidrag fra andre gen variationer, såsom BRAF-mutationer, PIK3CA mutationer, og tab af PTEN udtryk [16] – [19], nøjagtigheden af ​​genotypebestemmelsesmetoder kan forklare dette fænomen. For eksempel er en eksperimentel undersøgelse understøtter denne hypotese ved at vise yderst følsomme metoder til påvisning af KRAS-mutationer identificeret 13 yderligere FRK patienter resistente over for anti-EGFR mAb sammenlignet med direkte sekventering [20].

For at systematisk løse dette problem, vi foretaget en systematisk gennemgang og meta-analyse for at vurdere progressionsfri overlevelse (PFS) og overlevelse (MOS) hos patienter, hvis KRAS-status blev påvist af enten PCR-baserede analyser eller direkte sekventering. Vi sammenlignede evnen af ​​disse to genotypebestemmelsesmetoder at evaluere effekten af ​​KRAS-status på respons på CRC anti-EGFR behandling.

Metoder

Søg strategi

Fristen for forsøget publikation var 31. december 2013. Fuld rapporter om randomiserede kliniske forsøg, der behandles effekten af ​​KRAS-status på respons på CRC anti-EGFR behandling blev indsamlet gennem Medline (PubMed: www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed), den amerikanske Society of Clinical Oncology (ASCO, www.asco.org), og European Society for Medical Oncology (ESMO, www.esmo.org). De søgeord, der anvendes til at søge var: CRC, KRAS mutation, cetuximab, panitumumab, kemoterapi, randomiseret, og anti-EGFR mAb. Vi først udelukket dobbelt antistof-protokoller, der også evalueret vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) antistof. Vi derefter søgte målet forsøg i henhold til arbejdsgangen vist i figur 1.

Patient grupper og undergrupper

For at vurdere den samlede effekt af anti-EGFR mAb narkotika som en tilføjelse til standard kemoterapi, vi inddelt alle inkluderede patienter i to grupper: forsøgsgruppen, som blev behandlet med en kombination af anti-EGFR-mAb og standard kemoterapi; og kontrolgruppen, behandlet med kun standard kemoterapi. Vi analyserede derefter virkningen af ​​KRAS-status på respons på anti-EGFR behandling ved yderligere at opdele patienterne i vildtype-KRAS og mutant KRAS grupper. For at udføre sub-analyser for at sammenligne evnen hos forskellige genotypebestemmelsesmetoder at evaluere effekten af ​​KRAS-status på respons på CRC anti-EGFR behandling, vi adskilt patienter med forskellig KRAS-status i to undergrupper: PCR-baseret assay undergruppe og direkte sekventering undergruppe.

statistiske analyser

Vi udvundet hazard ratio (timer) for PFS og MOS med 95% konfidensintervaller (CIS) fra de tilmeldte forsøg. PFS og MOS data for hvert forsøg er repræsenteret ved log af HR og dets varians af eksperimentel sammenlignet med kontrolgruppen i begge patienter med vildtype og mutant KRAS, ifølge en tidligere beskrevet metode [21]. En HR 1 angiver en forbedring i PFS eller mos. Hvis forsøgene rapporteret log HR og varians, vi brugte dem direkte. Hvis forsøgene ikke gav disse værdier, udvundet vi data fra overlevelseskurver, når de er tilgængelige, for at estimere værdien af ​​log HR og varians. Når overlevelse kurver for behandlingsgrupperne ikke var til rådighed, andre data, såsom log-rank test P-værdier, og antallet af hændelser i hver gruppe, blev udvundet at tillade estimering af loggen HR og varians. For at opnå summariske HRs i forsøgsgruppen sammenlignet med kontrolgruppen, blev log HRs samlet anvendelse af et vilkårligt effekt model eller fast-effekt model for kontinuerlige resultater med SNG fastsat til 95% signifikans [22]. For at bestemme den passende model, vi ansat Anmeldelse manager 5.2 software til at analysere inter-studie heterogenitet. Når

P

værdi for heterogenitet var mindre end 0,05, valgte vi en tilfældig-effekt model. Når

P

værdi for heterogenitet var større end eller lig med 0,05, valgte vi en fast effekt model.

Resultater

Valgte Trials

Vi identificeret ti forsøg ifølge arbejdsprocessen vist i figur 1 [13], [23] – [31]. Disse forsøg er angivet i tabel 1. I alt 6699 patienter blev evalueret i denne meta-analyse.

Progressionsfri overlevelse (PFS)

Resultaterne viser tilsætning af anti -EGFR terapi til standard kemoterapi er vist i figur 2. for alle patienter, med eller uden KRAS mutationer, tilsætning af anti-EGFR-behandling bemærkelsesværdigt forbedret PFS [HR 0,84, (95% CI, fra 0,73 til 0,98), p = 0,02] efter til en tilfældig-effekt model (P-værdi for heterogenitet 0.00001). Når vi evaluerede data baseret på KRAS-status, observerede vi en signifikant forbedring i PFS hos patienter med vildtype-status [HR 0,70, (95% CI, 0,58 til 0,84), P = 0,0001] i henhold til en tilfældig-effekt model ( P-værdi for heterogenitet 0.00001), men ikke hos patienter med mutant KRAS [HR 1,06, (95% CI, 0,91-1,25), P = 0,44] ifølge en random-effekt model (P-værdi for heterogenitet = 0,009). I sub-analyser af vildtype-KRAS-gruppe, PFS øget betydeligt i PCR-baserede assay undergruppe [HR 0,74, (95% CI, 0,62-0,88), p = 0,0009] i henhold til en tilfældig-effekt model (P-værdi for heterogenitet 0,0001), men ikke i direkte sekventering undergruppe [HR 0,55, (95% CI, 0,29-1,05), P = 0,07] ifølge en random-effekt model (P-værdi for heterogenitet = 0,002). I sub-analyser af mutant KRAS gruppen, hverken PCR-baserede assay eller direkte sekventering forbedret PFS [HR 0,99, (95% CI, 0,78-1,27), p = 0,96], efter en fast-effekt model (P-værdi for heterogenitet = 0,97) og [HR 1,08, (95% CI, 0,89-1,32), p = 0,43] i henhold til en tilfældig-effekt model (P-værdi for heterogenitet = 0,0003), hhv.

median samlet overlevelse (MOS)

for overordnede patienter, tilsætning af anti-EGFR ikke bemærkelsesværdigt forbedrer MOS [HR 0,94, (95% CI, 0,83-1,05), p = 0,26] i overensstemmelse med en tilfældig- effekt model (P-værdi for heterogenitet = 0,002). Men observerede vi signifikant forbedring i MOS i vildtype-KRAS gruppe [HR 0,83, (95% CI, 0,75-0,91), P 0,0001] i henhold til en fast effekt model (P-værdi for heterogenitet = 0,06). I sub-analyser af vildtype-KRAS-gruppe, mos steg i PCR-baserede assay undergruppe, [HR 0,87, (95% CI, 0,78-0,96), P = 0,004] efter en fast-effekt model (P-værdi for heterogenitet = 0,55). Den direkte sekventering undergruppe inkluderet kun én prøve og gælder ikke for meta-analyse. I mutant KRAS gruppen, var der ingen indlysende forbedring i MOS [HR 1,09, (95% CI, 0,98-1,21), P = 0,11] i henhold til en fast effekt model (P-værdi for heterogenitet = 0,49). I sub-analyser af mutant-KRAS undergruppe, havde PCR-baserede analyser ikke åbenbart ændre terapi for CRC [HR 1,10, (95% CI, 0,99-1,23), P = 0,009] efter en fast-effekt model ( P værdi for heterogenitet = 0,42). I direkte sekventering undergruppe, mener enkelt forsøg ikke mulighed for meta-analyse. Disse data er vist i figur 3.

Diskussion

Nye molekylære målrettede behandlinger er ofte blevet brugt i CRC behandling med de fornemme fordele af høj specificitet og lav toksicitet [32]. Aktuel beviser har godkendt, at CRC patienter med vildtype-KRAS vil reagere på anti-EGFR behandling. Men nogle patienter med vildtype-KRAS ikke udviser den forventede respons, mens nogle patienter med mutant KRAS reagerer godt. En væsentlig forklaring på sådanne modstridende observation kan være fordi nøjagtigheden af ​​de nuværende genotypebestemmelsesmetoder varierede mellem forskellige laboratorier og forskellige kliniske forsøg. I denne undersøgelse, vi systematisk analysere mulighederne i PCR-baserede analyser versus direkte sekventering til at vurdere effekten af ​​KRAS-status på svar til anti-EGFR behandling.

Som forventet det nuværende meta-analyse bekræfter de kliniske fordele når anti-EGFR-behandling tilsættes standard kemoterapi til behandling af mCRC patienter huser vildtype-KRAS, med en betydelig forbedring i PFS. Når vi udførte sub-analyser baseret på de forskellige genotypebestemmelsesmetoder, både PFS og MOS forbedres, når PCR-baserede analyser blev anvendt. I disse 10 forsøg, brugte forskerne PCR-baserede assays, herunder PCR fastspænding-smeltekurveanalyse fremgangsmåde og allelspecifik realtids-PCR, til at påvise KRAS-mutationer. De følsomheder i disse to metoder er 0,1% og 0,5% [33], [34], hhv. Til sammenligning følsomheden af ​​direkte sekventering er 10-20% [35]. Således PCR-baserede metoder gør det muligt følsom påvisning af lav tæthed KRAS-mutationer, øger opdagelse sats, udelukker de fleste patienter med mutant KRAS, og derfor forbedre PFS og mos. Vi har således afsløret en ny fingerpeg om modsigelse i mCRC behandling: Der er en subpopulation af FRK patienter bærer lavt niveau KRAS mutationer mellem patienter med vildtype-KRAS og dem med rigelige mutant KRAS. På grund af begrænset følsomhed analysemetoder, er denne underpopulation af patienter typisk ikke grupperet korrekt, hvilket får behandlingen til at gå i den forkerte retning. Dette resulterer i en uforudsigelig resultat for de enkelte patienter, samt dramatisk forvirrer mCRC behandlingsstrategi. En løsning på dette problem væsentlig grad vil forbedre behandlingen af ​​mCRC patienter.

I forhold til den høje specificitet direkte sekventering, må vi overveje specificiteten af ​​PCR-baserede analyser, når vi bruger genotype resultater at vurdere effektiviteten af ​​anti- EGFR målrettet terapi. Den potentielt høje falsk-positive fejlprocent på PCR-baserede analyser kan udelukke patienter, der bærer vildtype-KRAS fra at modtage den korrekte behandling. Her foreslår vi, at PCR-baserede analyser vil gruppe nogle vildtype-KRAS patienter i mutant-gruppen, og dermed fejlagtigt øge PFS og mos af mutant gruppe. Interessant, vi ikke observere dette fænomen i vores undersøgelse, der tyder på, at PCR-baserede analyser, der anvendes i disse forsøg er specifikke nok til at afsløre mutant KRAS. En af disse assays er PCR fastspænding og smeltekurven metode. Klemmen bruges her er peptidnukleinsyre (PNA), i hvilken sukkeret phosphatskelet af naturlig nukleinsyre erstattes med et syntetisk peptid rygrad og genkender en sekvens specifik DNA adlyde hydrogenbinding ordningen Watson-Crick [36]. PNA-DNA heteroduplex udviser ekstraordinær termisk stabilitet, hvorimod inkorporering af enhver mismatch i duplex vil sænke den termiske stabilitet ved mere end 10 ° C; dette muliggør yderst specifik mutationsdetektion [33], [36]. Mutation detektion af allel-specifikke realtids-PCR er baseret på princippet om, at forlængelsen er effektiv, når den 3 ‘terminal base af en primer matcher sit mål, mens udvidelse er ineffektiv eller ikke-eksisterende, når den terminale base er forkerte, og viste også god specificitet i tidligere ansøgninger [37], [38]. Den allelspecifikke realtids-PCR anvendes i den aktuelle indskrevet kliniske forsøg er et assay kommercialiseret af DxS Ltd., hvilket yderligere garanteret høj specificitet [39]. I summen, præcist direkte personlig CRC behandling, vi anbefaler sådanne meget specifikke metoder eller andre metoder med høj specificitet.

Andre aspekter at evaluere en PCR-baseret assay omfatter gennemløb, forurening og bekvemmelighed. Kombinationen af ​​PCR-amplifikation og realtids-PCR i disse to typer af PCR-baserede metoder, PCR fastspænding-smeltekurveanalyse og allelspecifik realtids-PCR, giver high-throughput og lukkede rør test til påvisning af DNA-mutationer uden besværlig post-PCR-metoder. Desuden realtidsovervågning skabelon amplifikation signifikant forbedret fortolkning af PCR-resultater [40]. På nuværende tidspunkt er begge metoder blevet anvendt med succes til at søge efter forskellige genmutationer i forskellige tumorprøver. F.eks KRAS mutationer i Bile [41], EGFR mutationer i NSCLC [42], BRAF mutationer i CRC [35]. Den DxS giver også valideret biomarkør kit til EGFR, RAF, BCR-ABL og andre gener, der viser en sammenhæng mellem patient mutation status og lægemiddelrespons [39].

Konklusion

I CRC anti- EGFR behandling, PCR-baserede assays med høj følsomhed og specificitet muliggøre effektiv udelukkelse af patienter med mutante KRAS, samt reducere narkotika bivirkninger og forøge PFS og MOS i KRAS patienter vildtype. Samtidig sådanne metoder giver mulighed for nøje identifikation af KRAS muterede patienter, så vi kan virkelig smal en undergruppe af patienter med KRAS-mutationer og undersøge mere effektive behandlingsmuligheder for disse patienter. Derfor er en præcis standard reference test presserende behov for at optimere mCRC målrettet terapi. Selvom de nuværende PCR-baserede metoder har udført meget bedre end før, deres følsomhed og specificitet kan ikke forbedres yderligere på grund af den begrænsede opløsning for det analoge signal og de uundgåelige baggrund molekyler. Denne begrænsning reducerer betydeligt værdien af ​​visse vigtige kliniske prøver såsom fæces og blod, hvor mål-DNA kun udgør en lille brøkdel af det samlede DNA. For eksempel, tumor-afledt DNA i blodet af patenter med lavere fase tumorer er 0,01-0,12% [43]. Den sidst udviklede digitale PCR (dPCR) metoden har den højeste potentiale til at forbedre afsløring nøjagtighed i både sensitivitet og specificitet. I dPCR, er skabeloner i en prøve opdelte i mange øjebliks individuelle reaktioner, som hver indeholder højst en enkelt skabelon. Sådan opdeling effektivt reducerer støj og forøger amplifikation specificiteten af ​​lav-niveau skabeloner [44], [45]. Den rapporterede følsomhed dPCR nåede 0,0005% [44]. Mere praktisk end real-time PCR, er dPCR ikke kræver etablering af standardkurven, og med hensyn til throughput 96-brønd-version dPCR er udviklet [44], [45]. Denne lovende metode vil give os mulighed for væsentligt at forstå tumor heterogenitet og forbedre målrettet kræftbehandling [46], [47]. Afslutningsvis denne forskning giver en meget bredere vision for hele kræftbehandling felt.

Støtte oplysninger

Tjekliste S1.

PRISMA tjekliste

doi:. 10,1371 /journal.pone.0107926.s001

(DOC)