PLoS ONE: Dæmpning af Cell Mechanosensitivity i Colon Cancer Cells under in vitro Metastasis

Abstrakt

Menneskelig colon carcinom (HCT-8) celler viser en stabil overgang fra lav til høj metastatisk tilstand, når dyrkes på passende bløde underlag (21 kPa). Oprindeligt epitelial (E) i naturen, HCT-8 celler bliver afrundet (R) efter syv dages dyrkning på blødt underlag. R celler udviser et antal metastatiske kendetegnende [1]. Her bruger vi gradient stivhed substrater, en bio-MEMS force sensor, og Coulter counter-analyser for at studere mechanosensitivity og vedhæftning af E og R celler. Vi finder, at HCT-8 celler mister mechanosensitivity som de gennemgår E-til-R overgang. HCT-8 R cellernes stivhed, spredt område, proliferation og migration blevet ufølsomme over for substrat stivhed i modsætning til deres epitelial modstykke. De er blødere, proliferative og migrerende på alle emner. R celler udviser negligerbar celle-celle homotypisk adhæsion, såvel som ikke-specifik celle-substrat-adhæsion. Derfor de viser det samme opslag område på alle underlag i modsætning til E-celler. Tilsammen indikerer disse resultater, at R-celler opnår selvstændighed og forankring uafhængighed, og er derfor potentielt mere invasiv end E celler. Så vidt vi ved, er dette den første rapport af kvantitative data vedrørende ændringer i kræftcellen vedhæftning og stivhed under udtryk for en

in vitro

metastase-lignende fænotype

Henvisning:. Tang X, Wen Q, Kuhlenschmidt TB, Kuhlenschmidt MS, Janmey PA, Saif TA (2012) Dæmpning af Cell Mechanosensitivity i Colon Cancer Cells under

In vitro

Metastase. PLoS ONE 7 (11): e50443. doi: 10,1371 /journal.pone.0050443

Redaktør: Fan Yuan, Duke University, USA

Modtaget: August 7, 2012; Accepteret: 22 Oktober 2012; Udgivet: November 30, 2012 |

Copyright: © 2012 Tang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet er økonomisk støttet af National Science Foundation (NSF) giver No. ECCS 07-25.831, 10-02.165 og NIH RO1 083.272-03. XT blev finansieret af NSF Grant 0965918 IGERT: Træning den næste generation af forskere i Cellulær og Molekylær Mekanik og bionanoteknologi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

de fleste kræftdødsfald skyldes metastaser og ikke af den primære forælder tumor [2], [3], [4], [5], [6]. Under metastase, maligne cancerceller undslippe fra tumoren ved frigørelse fra hinanden eller fra andre celler og den ekstracellulære matrix (ECM) [2], [3], [6], [7]. De undslupne celler udtrykker aktivt proteinaser og ændre deres vedhæftning ligander til at nedbryde og ændre deres omgivende ECM [3], [4], [5], [8], [9]. Samtidig de opregulere deres motilitet og modstandsdygtighed over for apoptose for vellykket vaskulær spredning og invasion af fjerne raske organer [6], [7], [10]. Samtidig disse celler sænke deres stivhed [11], [12], [13], [14], dvs. øge deres overholdelse til at flyde gennem små kapillærer [4], [15], [16]. En kvantitativ undersøgelse af de mekaniske egenskaber af kræftceller i de tidlige faser af metastase; dog mangler [17], [18], [19], [20], hovedsageligt på grund af udfordringerne i at detektere udbrud af metastaser

in vivo

heterogenitet i biokemiske og cellulære egenskaber af individuelle tumor celler [3], [17], [21], [22].

Vi har for nylig opdaget [1], at humane tyktarmscarcinomceller (HCT-8) kan konsekvent vise en

in vitro

metastase-lignende fænotype (MLP), når de dyrkes på bløde hydrogel substrater med passende mekanisk stivhed (polyacrylamidgeler med Youngs modul: 21~47 kPa [1], [23]). HCT-8 celler er epitelial (E) i naturen. Når dyrkes på bløde underlag, de først danner distinkte epiteliale klynger eller øer. Efter 7 dage, cellerne dissociere fra øerne, og antager en afrundet form (R celler). Disse R-celler er meget proliferativ, vandrende og de betydeligt nedregulere E-cadherin udtryk – typiske kendetegn for metastaser [1], [24]. Desuden E til R overgang er gentagelig og irreversibel [1], [24]. På hårde substrater (3 GPa polystyren substrater), er denne E til R overgang ikke forekomme.

I denne undersøgelse vi først præsentere en detaljeret undersøgelse af mechanosensitivity af både præ- og post-metastase-lignende HCT-8 celler ved anvendelse af en gradient stivhed substrat. Undersøgelsen viser tabet af mechanosensitivity af HCT-8 R-celler i modsætning til både E- celler og normale fibroblaster. Stivheden af ​​R-celler, målt ved AFM, bliver uafhængigt af substrat stivhed. I modsætning hertil er stivheden af ​​E-celler korrelerede med substratet stivhed. Coulter counter og Bio-MEMS-analyser viser, at R-celler har lav homotypisk celle-celle vedhæftning og ubetydelig ikke-specifik vedhæftning i forhold til E-celler.

Resultater

1. Svag vedhæftning mellem HCT-8 R celler og substrat

For at undersøge, hvordan HCT-8 R celler reagere på forskellige fysiologisk relevante substrater af varierende stivhed blev HCT-8 R celler høstet fra bløde PA geler, ekspanderet som beskrevet i Materialer og Metoder og derefter dyrket på frisk stivhed-gradient PA gel substrater med stivhed varierer kontinuerligt fra 1 til 20 kPa (fig. 1a, venstre mod højre). stivhed-gradient substratet er belagt med et ensartet fibronectin fusions tillade cellebinding til substratet [25], [26], [27]. Til sammenligning, både HCT-8 E celler og normal Monkey Nyre fibroblast (MKF) celler, uden forudgående eksponering for PA geler, udpladedes på samme stivhed gradient substrater og overfladefunktionalisering (fig. 1b og 1c). De normale MKF celler blev valgt som kontrol, fordi de er kendt for at være mekanosensitive til substrat stivhed [28]. Vi fandt i modsætning til HCT-8 E-celler og normale MKF celler, HCT-8 R celler konstitutivt udviste meget begrænset substrat kontaktområder uanset substrat stivhed. R cellernes kontakt med substratet er ca. 40-60% af deres tilsyneladende projicerede areal. Som målt ved 3D konfokal mikroskopisk billeddannelse, R kontakt celle med substratet er kun 49,5 ± 20,9 um

2 (n = 34), hvilket er 3,8 ± 0,3 gange mindre end E-celler (n = 47), hvilket antyder, at R celler har svagere adhæsion med substratet end E-celler. Den svage adhæsion af R-celler med substrat er også i overensstemmelse med den observation, at R celler viser et mindre projiceret areal, end E celler på samme stivhed substrat (fig. 1d). Det projicerede areal af isolerede celler uden nogen nabocelle kontakt, for er 1,9 0,6 gange mindre for R-celler (n = 68) end E-celler (n = 61).

(a-c) Fase kontrast billeder af de høstede HCT-8 R celler, HCT-8 E celler og normale MKF celler på gradient-stivhed PA gel substrater. De respektive 3 kvadratiske paneler (omgivet af gule dash kasser) viser de repræsentative forstørrede visninger på 1-5 kPa, 8-12 kPa, og 15-20 kPa stivhed domæner. De hvide pile i forstørrede visninger angiver de enkelt, ikke-kontakt-celler, mens de gule pile angiver de berørende celler i kolonier. Scale barer i forstørret visning paneler er 100 um. (D) De enkelte cellers projiceret areal på 3 celletyper tværs stivheden rækkevidde, vises. Her har de ikke nogen kontakt med deres naboceller på forskellige stivhed substrater. (E) Spredningen område af enkeltceller i kontakt med naboceller på forskellige stivhed substrater. (F) Den tilsyneladende celle koloni område på 3 celletyper på forskellige stivhed substrater. (G) Den celleform faktor 3 celletyper, som ikke er i kontakt med deres naboceller på forskellige stivhed substrater. (H) celleform faktor af enkeltceller, som er i kontakt med naboceller på forskellige stivhed substrater.

HCT-8 R celler viser også en bemærkelsesværdig ufølsomhed over for at ændre den mekaniske stivhed deres kultur substrat. De bevarer en afrundet fænotype og begrænset friktion område til substrater uanset substraterne ‘stivhed (Fig 1a, er angivet med hvide pile;.. Figur 1d, 1e og 1g). Når substratet stivhed varieres over et 20 ganges område, spredningen område af enkelte R-celler steg kun ca. 27%, (fra 156,2 ± 42,1 um

2 på en 1 kPa region (n = 62) til 197,9 ± 83,6 um

2 (n = 56) på en 20 kPa region) (fig. 1d). Over det undersøgte stivhed, at stigningen i R cellernes spread område er ikke så dramatisk som den, E og MKF celler. Den 5. kPa, 10 kPa og 15 kPa regioner, deres spredning områder er 158,2 ± 40,3 um

2 (n = 56), 182,3 ± 32,2 um

2 (n = 63), og 190,9 ± 82,5 um

2 (n = 57), (fig. 1d). Også R celle formfaktoren ændret kun 7% fra 0,9 ± 0,2 på en 1 kPa region til 0,8 ± 0,2 på en 20 kPa region (figur 1g;. Formen faktor, S = 4 * πA /P

2, hvor A er arealet af cellen og P er omkredsen. S = 1 for perfekt cirkulær form og 0 for uregelmæssig form), hvilket indikerer konstitutiv afrundet form uafhængig af substratet stivhed. Den 5. kPa, 10 kPa og 15 kPa regioner, formfaktorer single R-celler er 0,8 ± 0,1, 0,8 ± 0,2, og 0,9 ± 0,2 henholdsvis (fig. 1 g). Efter længere tids kultur (60 dage), havde R-celler ikke viser nogen vending mod en epitelial morfologi på alle emner, uanset stivhed, selv meget stive polystyren (3 GPa) [1]. Desuden daglig optagelse via video mikroskopi viser, at R-celler ikke viser nogen tegn på forringelse af proliferativ aktivitet, selv efter flere måneder i kultur. I modsætning hertil både HCT-8 E-celler og MKF celler dyrket på den samme type stivhed gradient substrater viser indlysende følsomhed over for mekaniske stivhed af deres kultur substrat. Den enkelte isolerede E celler spredt område stiger 2,5 gange i løbet af 20 gange substrat stivhed forandring, fra 239,6 ± 191,9 um

2 på 1 kPa regionen til 578,1 ± 429,8 um

2 på 20 kPa regionen (fig. 1b , angivet med hvide pile). Som substrater bliver stive, vise HCT-8 E celler en større spredning område, med deres spredning områder 270,8 201,7 um

2 (n = 51), 276,0 ± 104,8 um

2 (n = 62), og 442,7 ± 367,7 um

2 (n = 55) den 5. kPa, 10 kPa og 15 kPa regioner, henholdsvis (fig. 1b). Deres form faktor faldt fra 0,9 ± 0,2 om 1 kPa regionen til 0,6 ± 0,2 om 20 kPa region (fig. 1 g). På tværs anden stivhed testet, de enkelt e celler form faktorer er 0,8 ± 0,2 (den 5. kPa område), 0,8 ± 0,1 (på 10 kPa område), og 0,7 ± 0,3 (på 15 kPa region), hhv. Den mechanosensitivity af MKF er endnu mere udtalt i forhold til HCT-8 kræftceller (Fig. 1c). Spredningen område individuel isolerede MKF celler (Fig 1c;. Angivet med hvide pile) stiger 5 gange i hele gradient substrat, fra 286,4 ± 86,2 um

2 (n = 46) på 1 kPa regionen til 1421,7 ± 845,7 um

2 (n = 31) på 20 kPa region (fig. 1d). Som substrat stivhed stiger, deres spredning området stiger dramatisk, og er 578,1 ± 373,1 um

2 (n = 62), 749,9 ± 355,5 um

2 (n = 63), og 1218,6 ± 773,5 um

2 (n = 59) den 5. kPa, 10 kPa og 15 kPa regioner, henholdsvis. Sideløbende med stigende substrat stivhed, single MKF celler spredt sig til en mere uregelmæssig morfologi, med deres form faktor faldende fra 0,9 ± 0,1 om 1 kPa til 0,5 ± 0,2 om 20 kPa regioner, henholdsvis (fig. 1G). På de mellemliggende stivhed regioner, dvs. 5 kPa, 10 kPa og 15 kPa regioner, formfaktorer af enkelt MKF celler er 0,7 ± 0,3, 0,6 ± 0,3 og 0,5 ± 0,3, hhv. Den svage vedhæftning mellem HCT-8 R celler og underlaget, samt uafhængighed R cellemorfologi fra underlaget stivhed, tyder på, at R-celler mister forankring-afhængighed og kommunikation med deres mekaniske mikromiljø. Denne forankring uafhængighed kan potentielt fremme F overlevelse celler i suspension, som er en vigtig kendetegnende for

in vivo

metastase af cancerceller [2], [3], [4], [16], [22] .

2. HCT-8 R celler viser svag celle-celle adhæsion

På stivhed-gradient substrater, både HCT-8 E-celler og MKF celler viser celle koloni dannelse, især på stivere regioner (angivet med gule pile i fig. 1b og 1c). Kolonistørrelsen er positivt korreleret med substratet stivhed. På substrat stivhed 1 kPa, 5 kPa, 10 kPa, 15 kPa og 20 kPa geler de celle koloni størrelser af HCT-8 E celler er 2962,2 ± 1000,5 um

2, 3662,1 ± 1105,3 um

2, 4249,5 ± 919,5 um

2, 9736,5 ± 4032,7 um

2 og 11748,7 ± 2144,9 um

2, henholdsvis (fig. 1f). For HCT-8 R-celler på samme stivhed substrater, koloni størrelser er markant mindre end deres E modstykker, selv når R cellerne er i kontakt med naboceller i 3 dage (fig. 1a). På substrat stivheder på 1 kPa, 5 kPa, 10 kPa, 15 kPa og 20 kPa, de R celle koloni størrelser er, 1087,4 ± 338,3 um

2, 1449,8 ± 343,4 um

2, 3062,2 ± 1326,9 um

2, 3849,6 ± 919,1 um

2 og 3912,1 ± 1183,8 um

2, henholdsvis (fig. 1f). Vi observerede også, at inde R cellekolonier, celle-celle-kontakt-området er ikke så omfattende som i E cellekolonier. R celler synes at være netop rører hinanden ved punkt-kontakter (Fig. 1a). Disse resultater tyder på R celle-celle adhæsion ikke er tilstrækkelig for dem til at danne sammenhængende kolonier eller celle øer som gør E og MKF celler.

Desuden er det interessant at bemærke, som HCT-8 E celler eller MKF celler undergå homotypisk celle-celleadhæsion, deres individuelle celleområder og celleform faktor bliver bemærkelsesværdigt mindre substrat stivhed-afhængig (fig. 1b og 1c, angivet med gule pile). Individuel celle områder og formfaktorer enkelt HCT-8 E celler inde celle øer på 1 kPa geler er 785,6 ± 299,4 um

2 og 0,7 ± 0,1 henholdsvis som ligner dem på 20 kPa geler, 892,8 ± 322,1 um

2 og 0,6 ± 0,1 (fig. 1e og 1 time). Samme egenskaber observeres på mellemliggende stivhed, celleområdet og form faktor individuel HCT-8 E inde øer er 526,7 ± 187,0 um

2 og 0,8 ± 0,1 på 5 kPa geler, 633,9 ± 421,4 um

2 og 0,6 ± 0,2 på 10 kPa geler og 723,1 ± 515,2 um

2 og 0,6 ± 0,2 på 15 kPa geler. For individuelle MKF celler inde øer, deres celle område og form faktor er 928,5 ± 374,0 um

2 og 0,5 ± 0,3 på 1 kPa geler, 892,8 ± 415,7 um

2 og 0,5 ± 0,3 på 5 kPa geler, 1098,1 ± 564,6 um

2 og 0,5 ± 0,2 på 10 kPa geler, 1008,8 ± 223,7 um

2 og 0,3 ± 0,2 på 15 kPa geler og 1160,6 ± 429,7 um

2 og 0,4 ± 0,1 på 20 kPa geler ( fig. 1e og 1 time). Når disse celler etablere celle-celle-kontakter, E og MKF celler viser cellespredning på meget blødt 1 kPa geler, hvilket tyder på celle-celle signaler overvælde celle-substrat-signaler (venstre region i fig. 1b og 1c, der angives med gult pile). Størstedelen af ​​HCT-8 R-celler; dog fortsat afrundede, med samme tilsyneladende celle område og formfaktor som de isolerede R celler, selv når den er i kontakt med naboceller (fig. 1a, er angivet med gule pile). Denne R-fænotype resulterer i generelt mindre R celle koloni område i forhold til E-celle øer bestående af lignende celletal (Fig. 1f). De individuelle celleområder og formfaktorer enkelt R celler inde R cellekolonier på 1 kPa geler er 151,8 ± 33,4 um

2 og 1,0 ± 0,1 henholdsvis og svarer til dem på 20 kPa geler (169,6 ± 30,5 um

2 og 0,9 ± 0,2) henholdsvis såvel som dem af enkelte R-celler udviser ingen celle-celle-kontakter (fig. 1 E og 1 h). Den 5. kPa, 10 kPa og 15 kPa geler, celleområdet og formfaktor af individuelle HCT-8 R celler inde øer er 156,2 ± 52,3 um

2 og 0,8 ± 0,1, 142,8 ± 47,2 um

2 og 0,9 ± 0,0, og 160,7 ± 33,4 um

2 og 0,8 ± 0,2, hhv. Denne unikke fænotype fortsætter selv efter R dyrkes på de meget stive polystyren substrater (3 GPA) for langvarige kultur gange (måneder); igen antyder svag celle-celle-adhæsion blandt R-celler. Taget sammen antyder disse resultater, at under eller efter E-til-R overgang, R-celler erhverver celle autonomi, der er karakteriseret ved markant reduceret celle-celle og celle-substrat adhæsive kontakter.

3. R-celler har reduceret homotypisk celle-celle-adhæsiv aktivitet

Udover estimere celle-celle-adhæsion kvalitativt baseret på deres kontaktpunkter morfologier, vi yderligere anvendte Coulter-tæller assay til kvantitativt at undersøge den funktionelle tab af HCT-8 celle-celle vedhæftning efter E-til-R overgang. Den Coulter-tæller måler hastigheden og graden af ​​celleadhæsion ved kvantificering af reduktionen i antallet af enkeltceller i suspension som celleaggregater dannes som funktion af tiden [1], [29], [30]. Kinetikken af ​​specifik homotypisk celle-celleadhæsion til kræft epiteliale HCT-8 E og R-celler blev målt og sammenlignet. Normale (ikke kræft) MA104 epiteliale celler blev anvendt som kontrol. Vi fandt, at adskilles HCT-8 R-celler (høstet fra 21 kPa PA substrater) udviste en markant lavere hastighed og omfang af celle-celle-adhæsion i forhold til de oprindelige HCT-8 E celler dyrket på hårde polystyren substrater (fig. 2). Tidligere undersøgelser har vist, at efter 120 minutters inkubering, 84,8 ± 4,0% af HCT-8 R celler forblev som enkelte celler, i modsætning til 37,6 ± 6,1% af originale HCT-8 E-celler og 5,2 ± 0,7% af normale MA104-celler [1]. Dette bemærkelsesværdige resultat indikerer kraftigt, at celle-celle klæbende aktivitet af HCT-8 R celler er næsten helt tabt, efter at de tager afstand fra E celle øer. Dette resultat er i overensstemmelse med vores fund af reduceret E-cadherinekspression på R celler [1], [24]. Reduktionen i celleoverflade klæbeevne sås også når uspecifikke adhæsionskræfter mellem HCT-8 overflader og SiO

2-coatede Bio-MEMS prober blev målt.

(a) Sammenligning af celle-celle-adhæsion satser af originale HCT-8 E-celler (aldrig udsat for 21 kPa PA geler), adskilles HCT-8 R celler høstet fra 21 kPa PA geler og normale ikke-kræft epitel MA104 celler. HCT8 R-celler har den laveste celle-celle adhæsion. Hvert datapunkt består af 3 dubletter, og hver to eksemplarer består af 5 x 10

5 celler af respektive celletyper.

4. Cell stivhed ændringer afspejler mechanosensitivity

Ud over substrat stivhed-afhængig cellemorfologi ændringer, HCT-8 E celler viste også varieret celle stivhed afhængig af kultur substrat stivhed. Brug atomic force mikroskopi (AFM), cellen stivhed HCT-8 E celler dyrket på stivhed-gradient substrater bestemmes ved indrykning hjælp silicium-nitrid cantilevere med en fjeder konstant på 148,14 pN /nm (med konsekvent celle indrykning hastighed 0,1 pm /sek). Hertz teori (se materialer og metoder) blev anvendt til at ekstrahere elasticitetsmodulet af de indrykkede celler. For at lette sammenligningen mellem forskellige celler på samme substrat stivhed, vi har udpeget 5 lige-space regioner i hele stivhed sortiment, med region 1 spænder over en stivhed 1-4 kPa, regioner 5 med stivhed 5-8 kPa, 9-12 kPa , 13-16 kPa, 17-20 kPa (fig. 3a). Ved hjælp af AFM, fandt vi HCT-8 E celler øge deres celle stivhed som substrater bliver mere stiv. Fra region 1 til region 5, stivhed HCT-8 E celler progressivt forøget fra 1,4 ± 0,9 kPa til 1,9 ± 0,8 kPa, til 2,1 ± 1,4 kPa, til 2,2 ± 1,3 kPa, og til 3,8 ± 2,0 kPa henholdsvis (n = 6 ~ 10 for hver enkelt region;. figur 3b). Især er det værd at bemærke, at gradienten af ​​celle stivhed stigning (fig. 3a) synes at matche gradient af gel substrat stivhed stigning. Disse resultater stemmer overens med dem, der tidligere rapporteret [25], og foreslår, at HCT-8 E-celler reagerer meget stærkt til den fine variation af deres microenvironmental mekaniske signaler. Stivheden af ​​HCT-8 R-celler; Men på alle de forskellige stivhed substrater, vises invariant ved 0,5 ± 0,4 kPa, hvilket indikerer, at R-celler har en meget begrænset eller ingen interaktion med deres mekaniske mikromiljø. AFM undersøgelse viste også, at R-celler er mekanisk blødere end E-celler, som potentielt kan øge deres formbarhed at tillade mere effektiv invasion af målvæv efter

in vivo

metastaser.

Brug Atomic force mikroskopi , stivheden af ​​HCT-8 E celler dyrket på gradient substratet bestemmes. De HCT-8 E-celler forøge deres celle stivhed som substraterne bliver mere stiv. For at lette sammenligningen mellem forskellige celler på samme substrat stivhed, er fem lige-afstand regioner på tværs af hele stivhed område udpeget: region 1 dækker 1-4 kPa, region 2 dækker 5-8 kPa, region 3 dækker 9-12 kPa, region 4 dækker 13-16 kPa, og region 5 dækker 17-20 kPa. (A) fra region 1 til region 5, E celle stivhed gradvis stiger med værdier 1,42 ± 0,85 kPa til 1,90 ± 0,77 kPa, 2,06 ± 1,39 kPa, 2,15 ± 1,28 kPa, og 3,82 ± 1,98 kPa hhv. I modsætning hertil på gel substrater med samme stivhed gradient, post-metastatiske R celler viser næsten invariant celle stivhed. (B) Fase kontrast billeder af HCT-8 E celler på gradient PA substrater.

5. E celle øer viser høj uspecifik vedhæftning i forhold til R-celler

Overfladen uspecifikke sammenvoksninger af HCT-8 E-celler (4

th dag i kultur på PA gel) og R-celler blev målt ved hjælp af en mikrofremstillet bio-MEMS force sensor (fig. 4 og materialer og metoder) [1], [30], [31]. Sensoren består af en microcantilever stråle med kalibreret kraft-forskydning forhold (se Materialer og fremgangsmåder). Der er en flad sonde (bredde 15 um og dybde 5 um) fastgjort til bjælken, der danner klæbende kontakt med cellerne (Fig. 4a). Føleren er fremstillet af monokrystallinsk silicium, og er belagt med et tyndt lag af nativt siliciumoxid (SiO

2). Sonden og sensoren er ikke funktionaliserede. Sensoren er manipuleret med en x-y-z piezo fase. Den flade sonde bringes i kontakt med E-celle øer «lateral konveks overflade på grænsen. Hver E-celle ø består af 100 s af celler med flere celler stabling på øen periferi (fig. 4b). Efter 2 minutters kontakt, er den kraft sensor trukket væk horisontalt fra cellen ø med en konstant hastighed på 2,1 ± 0,4 um /s (Fig. 4C). Kontakttiden blev valgt som 2 minutter, da langvarig kontakt varighed kan resultere i cellulær aflejring af ECM for probe og komplicere analysen. På grund af den celle-probe adhæsion, sensoren stråle deformeres under tilbagetrækning, dvs. celler anvender en tilbageføringskraft mod løsrivelse. Den korte kontaktvarighed mellem cellen og proben forhindrer aktiveringen af ​​celle- integriner og dannelsen af ​​enhver fokal adhæsion på sonden (tager 30 minutter til dannelse af [32], [33]). Derfor kan kun ikke-specifikke adhæsive interaktioner dannes mellem celleoverfladen og SiO

2-coated probe.

(a) Den ikke-funktionaliserede mikrofremstillet Si force sensor med en flad sonde og med kendt kraft-afbøjning forhold er manipuleret af en høj opløsning xyz Piezo-scenen for at kontakte celle øer ‘lateral konveks overflade (på xy-planet). (B) Konfokal mikroskopi af celle- øer viser højden af ​​øer er af størrelsesordenen 30~50 um. Den lodrette højde af bio-MEMS probe er 5~10 um. (C) Efter 2 minutters kontakt, er force sensor vandret trukket væk med en konstant hastighed på 2,1 ± 0,4 um /s. Mens celleadhæsion mellem proben og celleoverfladen hindrer tilbagetrækning af sensoren, sensoren bjælker deformeres ved δ, hvilket giver den kraft F. Bemærk, at sonden ikke er funktionaliseret. Den 2-minutters kontakt mellem proben og celler forhindrer aktivering af celle- integriner og dannelsen af ​​enhver celle fokal adhæsion, som tager . 30 minutter til dannelse

Vi fandt, at, under tilbagetrækning af bio-MEMS-sensor, E-celle øer strække lokalt med 15-20 um resulterer i en konisk form (se begge diagrammer i fig. 4c og fase-kontrast billeder i fig. 5). Bemærk denne strækning er forskellig fra den alene skyldes membran tøjr, som består af strækning kun phospholipid dobbeltlag. Under probe tilbagetrækning, er keglen kontinuerligt strækkes med stigende kontaktvinkel θ, mens cellen kontakt med sonden dråber på en trinvis måde (fig. 5b-5d). Stigningen i kraft mellem celle og sonde afspejles i den gradvise forøgelse af kløften mellem en fast reference og sonden (fra D

0 til D

1 og D

2). Celle kraft beregnes ud fra ændringen af ​​mellemrummet og kraft-deformation kalibrering af fjederen sensoren. På et kritisk værdi af kraft, F

c, keglen pludselig løsner fra probe (fig. 5d-e). For E-celler, F

c er den maksimale kraft på kraft-forskydning kurver. Vi anser F

c som et mål for celle-sonde vedhæftning. Vi målte Fc i 12 sådanne celleklynger og opnåede F

c = 256,3 ± 33,7 NN (n = 12). Lignende eksperimenter med R celler udviser negligerbar celle-probe adhæsion med F

c = 1,14 ± 0,13 nN (n = 25;. Figur 6). Derfor R celler har ubetydelig ikke-specifik vedhæftning i forhold til E-celler og dermed synes at være i en “smurt” tilstand måske gør dem i stand til at blive tilpasset til passage gennem vaskulære kapillarlejer under

in vivo

metastaser.

(a) Intercellulær selvklæbende detachement kraft af en celle ø på MEMS sonden. Kraften stiger monotont med stretch indtil løsrivelse. (B-e) fasekontrast billeder af en typisk vedhæftning eksperiment. Kraft beregnes ud fra deformation af sensorens stråle

D

og kraft-deformation kalibreringskurve. Den kritiske detachement kraft, F

c, er den maksimale kraft på kraft-forskydning kurver. Under strækning, holder kontaktvinklen θ mellem proben og cellen ø stiger, men størrelsen kontaktzonen mellem proben og cellen ø reducerende. Scale bar = 40 um.

(a) klæbekraft af R celler på MEMS probe som sonden bevæges bort fra cellerne efter 2 min kontakt (n = 25). (være). Fase kontrast billeder af R celler og MEMS sonde når uspecifik vedhæftning mellem dem måles. Den maksimale detachement kraft måles, er 2,5 NN, mens cellen deformation er knap mærkbar. Målestok:. 40 um

Diskussion

Så vidt vi ved, den nuværende undersøgelse er den første til at beskrive og vurdere ændringen i mechanosensitivity i humane colon cancerceller under en metastase-lignende overgang produceret af udelukkende ved at ændre den mekaniske mikromiljø under

in vitro

kultur. I et tidligere papir rapporterede vi HCT-8 celler udføre en E-til-R overgang på 21~40 kPa stivhed substrater [1]. Den foreliggende undersøgelse beskæftiger effektivt et kombinatorisk analysesystem tilgang med stivhed-gradient substrater, Coulter counter assay, atomic force mikroskopi (AFM) og Bio-MEMS kraft sensorer til at udforske den kvantitative mechanosensitivity ændring af menneskets tyktarmscarcinomceller HCT-8 epitelial E celler som de transit til afrundet-form R celler. Vi fandt, udløst af de passende substrat stivhed tidskoder, at HCT-8 R celler mister deres følsomhed over for både underlaget mikromiljø samt deres samspil med tilstødende R og E celler. Som et resultat, HCT-8 R celler erhverve autonomi for overlevelse som forankringsuafhængige, mobile celler, hvilket er et væsentligt element i de tidlige begivenheder i cancerceller metastaser [3], [4], [5], [6], [16], [20], [30], [34], [35].

de fysiske egenskaber af kultursubstrater findes til vidt påvirke fænotyper og genekspression af en række normale og cancerøse celler [1], [17], [18], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44 ], [45], [46], [47], [48], [49], [50], [51], [52], [53], [54], [55]. For at svare på substrat stimuli, celler tilslutte sig og spredes på underlaget, efterfulgt af sensing og forarbejdning både mekaniske og kemiske signaler [26], [37], [44], [46], [49], [53], [55 ], [56], [57], [58], [59], [60], [61]. Som vi tidligere har vist, [1], efter 7-dages kultur på bløde underlag, HCT-8 celler undergår en E til F overgang præget af R celler dissocierende fra moderselskabet epitelcelle lag eller celle øer. Disse dissocierede R celler viser bemærkelsesværdigt formindsket vedhæftning (både specifik og ikke-specifik [1], [24], [29]) i forhold til deres e-celle modstykker. Modsætning til e-celler, de dissocierede HCT-8 R celler viser substrat-stivhed uafhængige celle-substrat-interaktioner. Deres spredning ikke forringes ved svag forankring med kulturen substrat eller til andre celler (fig. 1). Anchorage uafhængighed er et særkende for metastatiske celler [7], [21], [36]. Faktisk vores seneste

in vitro

basalmembran celle invasion analyser viser, at HCT-8 R celler er betydeligt mere indgribende end E celler [24].

Vores opdagelse af en E-til-R overgang i HCT-8 kolon adenocarcimona celler tyder på, at passende substrat mekanisk blødhed kan fremme eller støtte i initiering af de tidlige begivenheder i kræftcellen metastase, og ironisk tab af mechanosensitivity, som kunne hjælpe i vaskulær spredning til distale væv target sites. Denne undersøgelse viser, at kolon kræftceller kan opnå dette træk udelukkende ved dyrkning på passende blødt underlag. Vi er i øjeblikket at vurdere, om R celler vises forbedret metastatisk adfærd i dyreforsøg i forhold til E-celler. Hvis E til F overgang korrelerer med erhvervelse af et forstærket metastatisk aktivitet, kan manipulation af den mekaniske mikromiljø tjene som en attraktiv

in vitro

model til undersøgelse af tidlige begivenheder af cancerceller metastase samt til screening af mulige anti metastatisk terapeutiske midler.

Materialer og metoder

1. Celledyrkning, mikroskopi billedbehandling og PA geler præparater

human colon adenocarcinoma HCT-8-celler (ATCC nr .: CCL-244) blev dyrket i RPMI 1640 (Gibco nr .: 23.400-062) suppleret med 2 g natriumbicarbonat per liter, hvilket giver slutkoncentrationer på 10% hesteserum (Gibco nr .: 26.050-088), 1 × antibiotisk-antimycotisk (Gibco nr .: 15240-062) og 1 mM natriumpyruvat (Gibco nr .: 11360) [1]. MA104-celler (embryoniske afrikansk grøn abe nyre) blev opnået fra MA Bioproducts og dyrket i MEM (Gibco nr .: 41.500-018) suppleret med 2 g HEPES per liter, 2,2 g natriumbicarbonat per liter, 1 × antibiotisk-antimykotisk som ovenfor, og 5% føtalt bovint serum (Gibco nr .: 16140). Den abenyre fibroblast (MKF) cellelinie (CV-1, ATCC, Manassas, VA) blev dyrket i et medium med 90% DMEM (ATCC, Manassas, VA), 10% FBS (ATCC, Manassas, VA) og 1 × antibiotikum-antimykotikum (Gibco nr .: 15240-062). Celletætheden før udpladning blev talt med standard hæmocytometer. Standard cellekultur inkubator blev anvendt til at tilvejebringe den dyrkningsbetingelser med tilstrækkelig fugtighed, 37 ° C temperatur, og 5% CO

2. (1).