PLoS ONE: Ekstracellulær vesikler udskilles fra kræftceller Stimulere Sekretion af MMP-9, IL-6, TGF-β1 og EMMPRIN

Abstrakt

Ekstracellulære vesikler (EVS) er centrale bidragydere til kræft, hvor de spiller en integrerende rolle i celle-celle kommunikation og overføre pro-onkogene molekyler til modtagende celler og derved opnår en kræft fænotype. Her har vi renset elbiler bruger enkle biokemiske metoder fra flere cancer-cellelinjer og efterfølgende karakteriseret disse elbiler via flere biokemiske og biofysiske metoder. Derudover brugte vi fluorescensmikroskopi til direkte at vise internalisering af elbiler i de modtagende celler inden for et par minutter efter tilsætning af elbiler til modtagende celler. Vi bekræftede, at det transmembrane protein EMMPRIN, postuleres at være en markør for elbiler faktisk blev udskilt fra alle cellelinier undersøgt her. Vi evaluerede reaktionen på EV-stimulering i flere forskellige typer af recipientceller linjer og måles evnen af ​​disse oprensede elbiler til at inducere sekretion af flere faktorer stærkt opreguleret i humane cancere. Vore data viser, at rensede elbiler stimulerer fortrinsvis sekretion af adskillige proteiner impliceret i kørsel kræft i monocytiske celler, men kun harbor begrænset aktivitet i epitelceller. Specifikt viser vi, at elbiler er potente stimulatorer af MMP-9, IL-6, TGF-β1 og inducere sekretion af ekstracellulære EMMPRIN, der alle spiller en rolle i at drive immune svig, invasion og inflammation i tumormikromiljøet. Således ved hjælp af en samlet strategi, der omfatter biokemiske, biologiske og spektroskopiske metoder, er vi begyndt at belyse de stimulerende roller

Henvisning:. Redzic JS, Kendrick AA, Bahmed K, Dahl KD, Pearson CG, Robinson WA, et al. (2013) Ekstracellulær vesikler udskilt fra cancercellelinjer Stimulering Sekretion af MMP-9, IL-6, TGF-β1 og EMMPRIN. PLoS ONE 8 (8): e71225. doi: 10,1371 /journal.pone.0071225

Redaktør: Jialin Charles Zheng, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: August 10, 2012; Accepteret: 30 jun 2013; Udgivet: 1. august, 2013 |

Copyright: © 2013 Redzic et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret gennem NIH ansøgning nummer 1R01GM096019-01A1 til Eze De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cellular udgydelse er en proces, der forekommer i alle celler som et middel til at eliminere unødvendige cellulære bestanddele, men den kritiske rolle af secernerede vesikler i celle-celle-kommunikation er ved at opstå [1], [2]. Membranproteiner stald via en række forskellige mekanismer, der omfatter ektodomæne udgydelse og sekretion af fuld længde membranproteiner via secernerede vesikler [3]. Vesikulær udgydelse sker ved passiv knopskydning af plasmamembranen med udgivelsen af ​​en type vesikel kendt som en mikrovesikel eller ved indadrettet knopskydning af membranen med den eventuelle frigivelse af vesikler kendt som exosomer [4]. Her vil vi kollektivt referere til både mikrovesiklerne og exosomer som ekstracellulære vesikler (EVS). Dette fænomen af ​​vesikulær udgydelse, dvs. EV kaste, er også blevet observeret i en række forskellige sygdomme, herunder neurologiske lidelser, virusinfektion og cancer [5] – [7]. Faktisk EV udgydelse sker i højere grad i cancerceller sammenlignet med raske celler og resulterer i frigivelse af pro-onkogene molekyler, herunder proteiner, RNA og DNA [8], [9]. For nylig har flere roller elbiler frem, at tillade disse partikler til at drive processer, der er nødvendige for udviklingen af ​​kræft og progression såsom angiogenese, inflammation og resistens [10]. Der er flere mekanismer, som elbiler kan handle på modtagende celler. For eksempel kan disse omfatte enten direkte stimulering af cellulære receptorer ved proteiner på EV overflade eller internalisering af elbiler af modtageren celle, som både fører til efterfølgende stimulering af signalveje [1], [11]. Cancerceller ser ud til at bruge elbiler som et middel til celle-celle-kommunikation ved at overføre deres indhold (DNA, RNA og protein) til en modtager celle, hvilket fører til en transformation fra en ikke-malign til en malign fænotype af recipientcellen [12 ] – [14]. Indholdet af elbiler protein spiller en integreret del i internalisering og aktiviteten af ​​elbiler. F.eks EV proteiner engagere de modtagende celler, hvilket resulterer i udbredelsen af ​​elbiler [15], og elbiler blev vist at overføre kræftpsykologisk proteiner resulterer i fænotypisk ændring i recipientcellen [12] – [14]. Men en af ​​de resterende spørgsmål med hensyn til EV aktivitet er, om der er forskelle i den observerede EV aktivitet blandt de forskellige modtagende celletyper samt hvilke proteiner kan secerneres af elbiler. Til dette formål har vi vurderet forskellene i EV stimulerende aktivitet på flere forskellige modtager celletyper ved sondering EV-stimuleret sekretion af flere forskellige faktorer, som har vist sig at spille en væsentlig rolle i menneskelige kræftformer.

Vi har renset elbiler fra raske individer, cancerpatienter og fra flere forskellige mammale cancercellelinier. Vores oprensningsmetode gav en heterogen population af elbiler spænder i størrelse fra 20-300 nm angiver en blanding af exosomer og mikrovesikler [4]. Vi har registreret den fulde længde transmembrane protein kaldet ekstracellulære matrixmetalloproteinase Inducer (EMMPRIN), en foreslået markør for elbiler [16], i elbiler oprenset fra flere forskellige biologiske væskeprøver og fra alle de forskellige cellelinjer, vi evaluerede her. Vi har derfor brugt EMMPRIN som en markør for vores rensede elbiler. Fluorescensmikroskopi viste, at vores oprensede elbiler blev internaliseret af modtageren celle i en relativt kort tid, (5-15 minutter), og lokalisere omkring kernen, hvilket bekræfter, at vores rensningsmetode resulterede i aktive elbiler stand til at overføre deres indhold ind i recipientceller . Vores bredt baseret vurdering af flere forskellige modtager cellelinier viser, at elbiler oprenset fra disse forskellige typer af kræftceller udviser præferentiel stimulerende aktivitet af udskilte proteiner mod monocytter, men ikke epitelceller. Faktisk mens vi opdagede, at elbiler udskilles fra alle cellelinjer studerede her indeholder fuld længde EMMPRIN, elbiler også stimulere udskillelsen af ​​fuld længde EMMPRIN sig i humane monocytiske leukæmiceller. Vi opdagede, at elbiler er potente stimulatorer af transformerende vækstfaktor beta-1 (TGF-β1), matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) og interleukin-6 (IL-6). Denne stimulerende aktivitet af elbiler til at fremkalde sekretion af TGF-β1, MMP-9, IL-6 og EMMPRIN, foreslår en rolle elbiler i kørsel tumor progression ved at stimulere faktorer er vigtige for immunforsvaret unddragelse, invasion og inflammation [17] – [19 ]. Vores data bringer os tættere på en bedre forståelse af biologi udskilte elbiler, idet præferenceordningen celletype stimuleret af elbiler, og de molekyler, der udskilles af modtagende celler efter stimulering med udskilte elbiler.

Materialer og metoder

etiske retningslinjer for human (patient /donor) Indsamling af biologiske væsker

Perifere blodprøver blev opsamlet i University of Colorado Hospital kutan Onkologisk Klinik. Vacutainere rør (rød top, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) blev anvendt til serum samling. Prøver blev straks transporteret til laboratoriet, centrifugeret ved 1200 x g i 10 minutter og derefter nedfrosset ved -80 ° C indtil brug. Lithium heparin indeholdende vakuumbeholdere (grøn top, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) blev anvendt til plasma indsamling, straks transporteres til laboratoriet, centrifugeret ved 800 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Plasmaprøver blev frosset ved -80 ° C indtil brug. Ascites væske blev indsamlet fra pleuraekssudat vandhaner i interventionel radiologi ved University of Colorado Hospital ved hjælp af en vacutainer (rød top, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Prøver blev straks transporteret til laboratoriet på is, centrifugeret ved 800 x g i 5 minutter ved 4 ° C til fjernes cellerester. Prøver blev frosset ved -80 ° C indtil brug. Indsamlingen af ​​biologiske væskeprøver blev godkendt af Colorado Multi-Institutional Review Board (COMIRB # 05-0309), og prøver blev indsamlet efter informeret skriftligt samtykke.

Påvisning af fuld længde EMMPRIN i biologiske væsker

humant serum, plasma og ascitesvæske prøver blev filtreret under anvendelse af et 0,22 um filter til fjernelse af eventuelle celler og cellerester. 10 ug af human EMMPRIN Biotinyleret polyklonalt antistof (R Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). L3.6pL celler blev dyrket i DMEM-medium suppleret med L-glutamin, natriumpyruvat, 5 mM ikke-essentielle aminosyrer, 25 ug /ml plasmocin, 1% penicillin /streptomycin /amphotericin-B og 10% FBS. U937, Molm13, THP-1 og HFF celler blev dyrket i RPMI 1640-medier suppleret med L-glutamin, 1% penicillin /streptomycin /amphotericin-B og 10% FBS.

Oprensning af elbiler

Adhærente cellelinjer (MCF-7, MDA-MB-231, L3.6pL og Hek293Fpl) anvendt til vesikel oprensning blev dyrket i 150 mm plader, indtil cellerne var 70% konfluente. Medier blev fjernet, og cellerne blev vasket med 1 X PBS to gange. Passende medier suppleret med 3% FBS tømt for elbiler via ultracentrifugering blev tilsat til cellerne [26].

EVs fra 5 × 10

5 celler /ml U937-celler blev dyrket i T-75 kolber i RPMI 1640-medier og 3% vesikel fri FBS. På indsamlingstidspunktet blev celler pelleteret ved centrifugering i 5 minutter ved 1100 rpm, og supernatanten blev opsamlet. Supernatanten fra alle celler blev opsamlet hver 48 timer og 4 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) blev tilsat til supernatanten umiddelbart efter indsamlingen. Supernatanten blev centrifugeret ved 8.000 rpm i 10 minutter for at fjerne cellerester og derefter filtreret under anvendelse af et 0,22 um filter. Anvendelse af en 100 kDa molekylvægtsafskæring filtermembran (Millipore, Bedford, MA, USA) supernatanten blev koncentreret til et 1-2 ml volumen. EVT fra den koncentrerede prøve blev oprenset ved anvendelse af et forberedende Superose 6 gelpermeationskromatografisøjle (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) ækvilibreret i 1 x PBS, pH 7,5. Samlet proteinindhold af oprensede elbiler blev målt ved hjælp af Bradford total protein assay (BioRad, Hercules, CA, USA).

Identifikation af Full Length EMMPRIN inden renset EVS

tomrum volumenbrøkerne fra gelpermeationskromatografien blev samlet og koncentreret til 500 pi. 10 ug af human EMMPRIN Biotinyleret polyklonalt antistof (R 0,05 blev betragtet som signifikant

Nanopartikel Tracking Analyse Måling

nanopartikel sporing analyse (NTA) er en af ​​de metoder, der anvendes til påvisning af udskilte elbiler inden for en given prøve.. Superose 6 gelpermeationskromatografiprofiler højmolekylære fraktioner blev analyseret under anvendelse NTA Version 2.2 Build 0375 instrument (NanoSight, Amesbury, Wiltshire, Storbritannien). Prøver blev analyseret ved 1:10,000 fortynding og 1 ml af den fortyndede prøve blev anvendt til analyse.

fluorescensmikroskopi

1 × 10

6 celler /ml celler blev centrifugeret ved 1100 rpm i 5 minutter for at pelletere cellerne. Celler blev fikseret med 200 pi af 1% formalin (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) i 10 minutter ved stuetemperatur. Celler blev centrifugeret som ovenfor, supernatanten fjernet og cellerne vasket med 1 X PBS to gange. Celler blev inkuberet i 20 pi EMMPRIN-FITC konjugeret antistof (Ancell, Bayport, MN, USA) fremstillet ved en fortynding på 1:50 og inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter. Celler blev vasket med 1 X PBS to gange efter inkubationsperioden. Nuklear farvning blev udført ved stuetemperatur i 10 minutter under anvendelse af 1 ul /ml 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Celler blev vasket to gange med 1 x PBS og monteret på mikroskopobjektglas.

For at evaluere samspillet og lokalisering af elbiler med THP-1-celler, elbiler blev inkuberet med Texas rød plet i 30 minutter ved stuetemperatur i mørk. Elbiler blev centrifugeret i 90 minutter ved 100.000 x g i TLA-55 rotor. Supernatanten blev aspireret, og pelleten vasket i 1 x PBS og derefter centrifugeret igen som ovenfor 2 gange. Supernatanten blev fjernet og pelleten resuspenderet i 20 pi af 1 X PBS. Farvede elbiler blev derefter tilsat til cellerne og inkuberet ved forskellige tidspunkter i området fra 5 minutter op til 24 timer ved 37 ° C. Cellerne blev visualiseret under anvendelse af et Nikon Eclipse Ti (Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA) omvendt mikroskop med et Nikon 100X PlanApo NA 1.4 mål. Billeder blev taget med en Andor iXon EMCCD 888E kamera (Andor Technologies, South Windsor, CT, USA). Billedanalyse og kvantificering blev udført ved hjælp af NIS Elements imaging software (Nikon Instruments Inc., Melville, NY, USA). Alle billeder taget blev erhvervet ved stuetemperatur. Erhvervelse tider for billederne var 80 msek, 500 ms og 300 ms for de blå, grønne og røde kanaler, hhv. Billeder blev behandlet for tal bruger ImageJ og derefter produceret ved hjælp af Corel Draw.

Måling af Ændring i EMMPRIN Expression Upon vesikel Stimulation

Flowcytometrianalyse af THP-1 celler farvet med EMMPRIN-FITC konjugeret antistof blev udført for at bestemme, om der er nogen ændringer i niveauet af celleoverfladen EMMPRIN udtryk ved behandling med elbiler. EMMPRIN betyde fluorescensintensitet (MFI) blev målt ved anvendelse af Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC Flow Cytometer på ubehandlede celler, celler behandlet med 1 x PBS (puffer behandlede celler) og EV behandlede celler. Alle målinger blev taget 24 timer efter stimulering og blev udført ved anvendelse af hele cellepopulationen, dvs. 1 × 10

6 celler /ml stimuleret i 24 timer.

måling af ændringen i EMMPRIN Sekretion Upon vesikel Stimulation

supernatanten fra kontrolprøven buffer behandlede og EV-behandlede prøver blev opsamlet for at bestemme, om der er nogen ændringer i mængden af ​​udskilt EMMPRIN ved stimulering. 100 pi af supernatanten blev deglycosyleret som beskrevet tidligere, og proteinerne separeret ved anvendelse af SDS-PAGE-elektroforese. EMMPRIN sekretion blev målt ved anvendelse af Western blot-analyse som beskrevet tidligere.

aktivitetsassays Salg

Sekretion af MMP-9 og IL-6 blev målt i flere cellelinjer under anvendelse enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) afsløring kits (ELISA Tech, Aurora, CO, USA). For celler i suspension, 5 x 10

5 celler blev anvendt /ml pr 0,5 ml medier i en 12-brønds plade. For adhærente celler blev stimulationer udført i plader med 12 brønde med celler ved 70-80% konfluens. Alle aktivitetsassays blev udført i serumfrit medie. Supernatant fra de stimulerede celler blev opsamlet 24 timer efter stimulering og lagret i -20 ° C indtil brug. 100 pi af supernatanten blev påført på ELISA-pladen. TGF-β1 udskilles i latent form, derfor prøver blev forsuret til pH 2 ved anvendelse af 1 M saltsyre (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) og inkuberet i en time ved stuetemperatur for at frembringe det immunoreaktive form af TGF-β1 . Prøverne blev derefter neutraliseret med 1 M natriumhydroxid (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). 100 pi af den aktiverede prøve blev påført på ELISA-pladen. Målingerne blev udført som pr fabrikantens protokol (ELISA Tech, Aurora, CO, USA).

Resultater

Full Length EMMPRIN Fungerer som en generel markør for elbiler udskilles i biologiske væsker samt fra dyrkede celler

tilstedeværelsen af ​​ekstracellulært EMMPRIN formular (er) blev først vurderet i adskillige typer af biologiske væsker, herunder humane sera, plasma, og ascitesvæske at afgøre, om EMMPRIN kan anvendes som en generel markør for tilstedeværelse af elbiler som er blevet foreslået for nylig [16]. Prøver blev filtreret under anvendelse af et 0,22 um filter til fjernelse af eventuelle celler eller cellerester og immunpræcipiteret (iPed) under anvendelse af en EMMPRIN antistof. Efter deglycosylering, blev formen den fulde længde af proteinet (28 kDa) påvist i humane sera og plasma fra både raske donorer og cancerpatienter samt i ascitesvæsken opsamlet fra cancerpatienter uden observerbare niveauer af eventuelle spaltede former inden for disse biologiske væsker (se fig. S1A og fig. S1B for humane sera og ascitesvæske, henholdsvis). Massespektrometrianalyse af tryptiske fordøjelser blev anvendt til utvetydigt at bekræfte, at EMMPRIN er i iPed serumprøven, fig. S1c. Adskillige peptider kortlægning til ektodomænet af EMMPRIN blev påvist og anvendt til at bekræfte tilstedeværelsen af ​​ekstracellulært EMMPRIN inden serumprøverne, fig. S1c. Tilstedeværelsen af ​​et fuldlængde transmembrane protein, såsom EMMPRIN identificeret her er i overensstemmelse med en generel sekretion af transmembrane proteiner via elbiler i alle biologiske væsker, men dette blev yderligere vist i det følgende.

For at tilvejebringe en konsistent og pålidelig kilde til elbiler for efterfølgende assays til direkte sonde deres stimulerende roller blev elbiler oprenset fra flere forskellige pattedyr cancer cellelinjer. EMMPRIN blev probet for at bestemme, om denne transmembrane protein kunne anvendes som en generel markør for elbiler for alle disse cellelinjer analoge med elbiler oprenset fra biologiske væsker som ovenfor. To brystcancercellelinier, MCF-7 og MDA-MB-231, blev anvendt, og elbiler oprenset fra disse cellelinier er angivet som EV

MCF-7 og EV

MDA hhv. Endvidere har både en monocytisk leukæmi cellelinje, U937, og en pankreatisk cancercellelinie, L3.6pL, blev anvendt med elbiler afledt fra disse cellelinier betegnet som EV

U937 og EV

L3.6pL hhv. Supernatanter fra celler dyrket i et passende medie, suppleret med antibiotika og 3% EV gratis FBS blev opsamlet hver 48 timer.

Af de tidligere anvendte metoder, der anvendes til at oprense udskilte elbiler, valgte vi at anvende gelpermeationskromatografi [27] . Specifikt blev Superose 6 gelpermeationskromatografi anvendes til at selektere for de store molekylvægtfraktioner, fig. 1A (rød boks). EMMPRIN blev detekteret i EV fraktionen opsamlet fra alle de testede her, fig cellelinier. 1B, hvilket indikerer, at EMMPRIN sekretion er en vidt forekommende proces.

A) Gelpermeationskromatografi elueringsprofilen for rensning af konditionerede medier at isolere elbiler. Den røde kasse svarer til elueringstoppen for de rensede elbiler. B) EMMPRIN udskilles via elbiler i alle testede som vist ved Western blot probet for EMMPRIN i vesiklen fraktionerne cellelinjer oprenset ved anvendelse gelpermeationskromatografi. C) nanopartikel Sporing analyse viser elbiler i oprenset prøve og validerer vores størrelse ekskluderingsmetode at oprense elbiler fra konditionerede medier. D) Elektronmikroskopi blev anvendt til at visualisere de udskilte elbiler. Der vises data for VE

MDA.

Således er vores studier her viser, at ekstracellulær, fuld længde EMMPRIN sekretion via elbiler er en bredt forekommende fænomen snarere end en bestemt proces celletype og EMMPRIN kan være bruges som en generel markør for tilstedeværelse af elbiler.

Bekræftelse og Validering af rensede elbiler bruger nanopartikel Tracking Analysis, Electron Microscopy og massespektrometri

Vi brugte flere metoder der almindeligvis anvendes til EV detektion og visualisering for yderligere at validere vores EV rensningsmetode ud over vores bekræftede tilstedeværelsen af ​​EMMPRIN som en generel EV markør (fig. 1A, B). Specifikt blev nanopartikel sporing analyse (NTA), der anvendes til bestemmelse af størrelsesfordelingen af ​​elbiler i prøver. Baseret på størrelsesfordelingen af ​​de detekterede hjælp NTA (fig. 1C) elbiler, kan det konkluderes, at cellelinierne anvendt i denne undersøgelse udskiller en heterogen population af elbiler spænder i størrelse fra 20-300 nm. Størrelsesområdet indikerer, at disse vesiklerne omfatter mindre elbiler, kendt som exosomer (10-100 nm), og større EVs såkaldte mikrovesikler (100-1000 nm). Bemærk, at yderligere saccharosegradientfraktionering og efterfølgende Western blot analyse identificeret EMMPRIN i begge EV populationer (data ikke vist), hvilket indikerer, at EMMPRIN er en generel markør for begge typer af elbiler. Elektronmikroskopi (EM) blev anvendt til at visualisere elbiler udskilt fra forskellige cellelinier som vist for oprenset EV

MDA (fig. 1D). EM-data viste også heterogenitet i vesikel størrelse som blev bestemt med NTA. Massespektrometrianalyse viste også identifikation af flere andre EV markører, såsom CD63, CD81 og Annexin V som vist i tabel 1, hvilket yderligere validering af oprensningsmetode bruges her. , I betragtning af størrelsen fordeling detekteres med NTA og EM og identifikationen af ​​EV specifikke proteiner, konkluderer således vi, at vores rensning metode giver en blanding af exosomer og mikrovesikler.

elbiler hurtigt internaliseres i recipientceller

EV modulering af recipient-cellefunktion er blevet foreslået at være i det mindste delvist afhængig af deres oprindelige optagelse og overførsel af last (se gennemgang af Lopez-Verrilli [28]). I overensstemmelse med en sådan foreslået mekanisme, fandt vi, at de oprensede elbiler internaliseres inden for minutter efter monocyt leukæmi THP-1-celler (fig. 2) og monocytiske leukæmi U937-celler (fig. S4) hvilket bekræfter den biologiske aktivitet af vores oprensede elbiler. Konkret har vi visualiseret internaliseringen af ​​Texas Red farvede elbiler som særskilte puncti i celler farvet med en EMMPRIN-FITC-antistof, der tillades for visualisering af det cellulære membran (fig. 2, højre). Således i disse forsøg anvendte vi det faktum, at EMMPRIN oprindeligt er overudtrykt på modtageren celleoverfladen som markør for cellemembranen. Enkelte billeder fra gennem celle volumen Z-stakke blev indsamlet til at bekræfte, at elbiler faktisk internaliseres i stedet for blot lokaliseret på celleoverfladen. Vi kvantificeret også procentdelen af ​​celler, der internaliseret de elbiler ved at tælle frekvensen af ​​EV positive celler. Dataenes gennemsnit fra tre uafhængige målinger viser, at vesikel internalisering forekommer i 76% af cellerne. Således vesikel internalisering er ikke en sjælden begivenhed, men en hyppig begivenhed. Disse data viser også lokalisering af Texas Red farvede elbiler på cellemembranen, hvilket indikerer, at elbiler sandsynligvis er indarbejdet i eller associeret med cellemembranen samt at blive internaliseret.

Fluorescens mikroskopi billeder af THP-1 celler behandlet med Texas red farvede elbiler. Venstre panel – THP-1 celle farvet med EMMPRIN FITC og DAPI. Den røde signal er auto-fluorescenssignal af cellen. Midterste panel – THP-1 celle behandlet med Texas Red pletten alene. Signalet observeret er den samme som i den venstre billede og svarer til Texas rød baggrund og celle auto-fluorescenssignal. Right panel – THP-1 celler behandlet med Texas Red farvede elbiler og visualiseret efter en 5-minutters inkubationstid. Den cellemembranen farves med EMMPRIN-FITC-antistof, er elbiler vises med rødt, og DAPI farvede kerne er vist med blåt. Henvisningen bar er 10 um.

elbiler Stimulere Sekretion af flere Cancer-associerede Faktorer

Indledende aktivitet analyser.

Vi oprindeligt screenet flere modtager cellelinjer til at bestemme som, hvis nogen, dyrkede celler var lydhøre over for vores renset EV

MCF og EV

MDA. Specifikt MMP-9 og IL-6-sekretion (fig. S2 og fig. S3, henholdsvis) blev overvåget ved stimulering med EV

MCF-7 og EV

MDA hjælp enzymbundet immunsorbentassay (ELISA), da både af disse proteiner er opreguleret i flere kræftformer sammen med EMMPRIN markør for elbiler [29], [30]. Generelt vores data viser, at der er præferentiel selektivitet i celletypen fremkalde en respons efter EV stimulering. For eksempel U937 monocytiske celler var mere relevant på secernerende både IL-6 og MMP-9 ved stimulering med elbiler sammenlignet med epitelceller. Vi gjorde observere en forøgelse i IL-6-sekretion i både HFF og MBA-MB-231-celler efter stimulering med EV

MDA blev imidlertid hverken sekretion af IL-6 eller MMP-9 stimuleret med EV

MCF- 7. Således da U937-celler fremkaldte den mest bemærkelsesværdige respons på stimulering med begge typer af elbiler, der anvendes i disse indledende ELISA analyser, vi fokuseret på monocytiske celler, THP-1 og U937, i efterfølgende aktivitet assays.

Rensede elbiler stimulere udskillelsen af ​​EMMPRIN tyder på en positiv spiral.

Da tidligere undersøgelser har vist, at EMMPRIN er involveret i en positiv spiral i nogle cellelinjer [31], vi næste ønskede at vurdere effekten af ​​de elbiler på EMMPRIN celleoverfladeekspression og sekretion i monocytter. THP-1-celler blev stimuleret med 10 ug totalt protein for hver type vesikel, dvs. EV

MCF-7 og EV

MDA og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Som vist i fig.