PLoS ONE: krystalstruktur Crataeva Tapia Bark Protein (CrataBL) og dens virkning i Human prostatakræft Cell Lines

Abstrakt

Et protein isoleret fra barken af ​​

Crataeva Tapia

(CrataBL) er både et Kunitz-typen plante proteasehæmmer og et lectin. Vi har bestemt aminosyresekvensen og tredimensionale struktur af CrataBL, samt kendetegnet sine udvalgte biokemiske og biologiske egenskaber. Vi fandt to forskellige isoformer af CrataBL isoleret fra den oprindelige kilde, afviger i positionerne 31 (Pro /Leu); 92 (Ser /Leu); 93 (Ile /Thr); 95 (Arg /Gly) og 97 (Leu /Ser). CrataBL viste forholdsvis svag inhibitorisk aktivitet over for trypsin (K

IAPP = 43 uM) og var mere potent mod faktor Xa (K

IAPP = 8,6 uM), men var ikke aktiv over for en række andre proteaser. Vi har bekræftet, at CrataBL indeholder to glycosyleringssteder og danner en dimer ved høj koncentration. De højopløselige krystalstrukturer af to forskellige krystal former for isoform II kontrolleret β-trefoil fold af CrataBL og har vist tilstedeværelsen af ​​dimerer bestående af to næsten identiske molekyler gør omfattende kontakter (~645 Å

2). Strukturen afviger fra dem af de mest nært beslægtede proteiner af manglen på den N-terminale β-hårnål. I nogle eksperimenter med henblik på at undersøge de biologiske egenskaber af CrataBL har vi vist, at tilsætning af 40 uM af proteinet i 48 timer forårsagede maksimal vækstinhibering i MTT-assayet (47% af DU145 celler og 43% af PC3-celler). Den apoptose af DU145 og PC3-cellelinjer blev bekræftet ved flowcytometri under anvendelse Annexin V /FITC og propidiumiodid-farvning. Behandling med CrataBL resulterede i udgivelsen af ​​mitokondrie cytochrom

c

i aktivering af caspase-3 i DU145 og PC3 celler

Henvisning:. Ferreira RDS, Zhou D, Ferreira JG, Silva MCC , Silva-Lucca RA, Mentele R, et al. (2013) Crystal struktur

Crataeva Tapia

Bark Protein (CrataBL) og dens virkning i Human Prostata Cancer cellelinier. PLoS ONE 8 (6): e64426. doi: 10,1371 /journal.pone.0064426

Redaktør: Enrique Pérez-Payá, Centro de Investigacion Principe Felipe og IBV-CSIC, Spanien

Modtaget: 17. december, 2012; Accepteret: April 15, 2013; Udgivet: 18 juni 2013

Copyright: © 2013 Ferreira et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Anvendelse af APS blev støttet af det amerikanske Department of Energy, Kontoret for Videnskab, Office of Basic Energi Videnskaber under kontrakt nr W-31-109-Eng-38. Forfatterne er taknemmelige for CAPES, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og São Paulo Research Foundation (FAPESP) (Proces 09 /53.766-5) for at yde økonomisk støtte. Dette projekt blev også støttet delvist af Intramural Research Program for National Institutes of Health (NIH), National Cancer Institute, Center for Cancer Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Et stort antal proteiner er karakteriseret ved deres β-trefoil fold [1]. Medlemmer af denne superfamilie deler strukturelle træk men ikke nødvendigvis andre egenskaber og deres biologiske rolle kan være vidt forskellige [2]. Fremtrædende blandt dem er plante protease inhibitorer af Kunitz typen, kaldet Kunitz-P eller Kunitz-STI-inhibitorer [2], [3]. Disse proteiner inhiberer primært serinproteaser, selv om nogle også hæmme cystein og asparaginproteaser [4]. Kunitz-P-inhibitorer er karakteriseret ved molekylmasse på ca. 20.000 Da (for hele protein eller et domæne) lavt indhold af cysteinrester, og en eller to reaktive steder, som er grundlaget for deres inhiberende aktivitet. Men nogle strukturelt beslægtede β-trefoil-proteiner ikke proteasehæmmere overhovedet, men udviser forskellige andre egenskaber, f.eks klorofyl binding [5], smag modifikation (miraculin) [6], binding til cytokinreceptorer (IL-1) [7 ], ribosom forgiftning (ricin) [8] eller carbohydratbindende, eksemplificeret ved

tåge-tragthat

lectin, CNL [9].

Plant lektiner er proteiner, der besidder mindst en ikke-katalytisk domæne, der binder reversibelt og specifikt mono- eller oligosaccharider [10], [11]. På grund af disse egenskaber, er sådanne proteiner udnyttes i karakterisering af glycokonjugater og i celle-overflade eller celle-celle-arkitektur undersøgelser [12], [13]. Enkelte proteasehæmmere viser også lectin aktivitet, et eksempel, som inhibitoren isoleret fra epidermis af ål, opkaldt Eel-CPI-1 [14]. Troncoso et al. [15] isoleret en inhibitor med lectin egenskaber fra

Peltophorum dubium

frø, der nedsætter levedygtigheden af ​​NB2 rotte lymfomceller.

Crataeva Tapia

(også kendt som

Crateva Tapia

) tilhører Capparaceae familien, der findes i det nordøstlige Brasilien. Et protein fra

Crataeva Tapia

bark er blevet renset ved hjælp af omvendt miceller i isooctan [16] og gennem kromatografiske processer [17]. Opkaldt CrataBL (

Crataeva Tapia

Bark Lectin), dette protein blev vist at have en vis specificitet for binding glucose og galactose [17]. En række af sine biologiske egenskaber er blevet karakteriseret, herunder forsinket koageldannelse ved at ændre den iboende koagulationsvej kaskade [18]. Endvidere blev CrataBL vist at udvise anti-inflammatorisk, analgetisk [19], insekticid [17], og anti-tumor [19].

Prostatacancer er den mest almindelige cancer hos mænd [20], med DU145 og PC3 er de mest omfattende undersøgt prostatakræft-cellelinier, der tjener som

in vitro

modeller for kræftbehandling undersøgelser [21], [22], [23]. Prostatacancer er forbundet med et højt niveau af ekspression af proteaser [24] og glycoproteiner [25], hvilket gør CrataBL et potentielt nyttigt værktøj til undersøgelser med prostatakræft-cellelinier, på grund af sin kombination af egenskaber, der omfatter både proteaseinhibering og carbohydratbindende.

i dette arbejde, vi bestemt aminosyresekvens og den tredimensionelle struktur af CrataBL og også undersøgt en række biokemiske aktiviteter, sammenligne dem til egenskaberne af andre medlemmer af denne superfamilie. Efterfølgende vi karakteriseret effekten af ​​CrataBL på vækst og stabilitet i menneskelig prostata cancer cellelinjer.

Materialer og metoder

Isolering af CrataBL

Isolering af proteinet blev udført i overensstemmelse med proceduren ifølge Araújo et al. [17]. Kort fortalt, 10% (vægt /volumen) ekstrakter fra

Crataeva Tapia

bark blev fraktioneret med 30-60% ammoniumsulfat. Fraktionen indeholder proteinet blev dialyseret mod 10 mM phosphat citratpuffer pH 5,5 og påført en søjle af CM-cellulose ækvilibreres med den samme buffer. Adsorberet protein blev elueret med en ækvilibreringspuffer indeholdende 0,5 M NaCl og indholdet af enkelt top blev underkastet gelpermeationskromatografi på Superdex 75-søjle, ækvilibreret i 0,15 M NaCl under anvendelse af en ΔKTA purifier (GE Healthcare, Uppsala, Sverige). Dette blev efterfulgt af højtydende væskekromatografi (HPLC) på en C18-søjle, for at bekræfte homogenitet af prøven. De elueringer blev overvåget ved 280 nm.

Proteinkoncentration og kulhydrat assays

Proteinbestemmelse blev udført som beskrevet af Lowry et al. [26] under anvendelse af bovint serumalbumin (BSA) som standard. Indholdet af CrataBL sukker blev bestemt ved phenol-svovlsyre-metoden af ​​Masuko et al. [27], med mannose ved koncentrationer på 2, 4, 6, 8, og 10 ug som en standard.

MALDI-TOF /MS-analyse

molekylmasse på CrataBL blev analyseret ved MALDI-TOF /MS. 1 pi CrataBL (2 mg /ml) blev tilsat til 1 pi α-cyano-4-hydroxykanelsyre (10 mg /ml) matrix-opløsning, spottet på en rustfri stål MALDI target plade og tørret ved stuetemperatur før analyse. Massespektre blev opnået med et Bruker Daltonics Microflex LT instrument (Billerica, USA), der opererer i lineære, positiv ion-mode, der tidligere kalibreret med insulin, ubiquitin, cytochrom C, og myoglobin. Til analysen af ​​proteinet blev massespektre erhvervet ved hjælp af følgende instrumenter parametre: pulserende ion udvinding forsinkelse på 30 ns, ion kilde spænding én, 20 kV, ion kilde spænding to, 18,65 kV, og ion kilde linse spænding 7.1 kV. For hver prøve blev massespektre erhvervet ved at akkumulere 50 laser skud ved 50% laser magt i m /z intervallet 8000-25.000 Da.

Primær struktur CrataBL

sekventering af nativt protein blev udført ved Edman-nedbrydning [28]. Prøven blev reduceret, alkyleret og underkastes derefter fordøjelse med trypsin, chymotrypsin, Asp-N, og Lys-C endopeptidaser (sekventeringskvalitet, Roche, Tyskland). Fragmenter fra behandling med endopeptidaser blev oprenset på en 1 × 150 mm Jupiter Proteo 90A-søjle (Phenomenex, Aschaffenburg, Tyskland) ved en strømningshastighed på 0,1 ml /minut, under anvendelse af en acetonitrilgradient (0-60%) med 0,1% ( v /v) trifluoreddikesyre i 40 minutter. Sekventering blev udført på en automatisk gasfase-sequencer (492cLC; Applied Biosystems, Foster City, USA). De glycosylerede peptider blev analyseret ved massespektrometri til bestemmelse af molekylvægten af ​​kulhydratdele. Sekvensligheder blev vurderet med programmet BLAST mod proteinet database NCBI [29]. Sekvenserne blev opstillet under anvendelse af programmet MULTALIN [30].

enzyminhibering assays

Den inhiberende aktivitet af CrataBL mod proteaser blev målt under anvendelse af specifikke kromogene eller fluorogene substrater i 96-brønds mikrotiterplader ved 37 ° C. Enzymerne (human faktor Xa, bovint trypsin, bovin chymotrypsin, human plasma kallikrein (HuPK), porcin pancreatisk kallikrein (PoPK), human neutrofil elastase (HNE), humant plasmin, og papain) blev præinkuberet med enten CrataBL eller med opløsningsmiddel i 10 min. Reaktionerne blev initieret ved tilsætning af substraterne, og farven eller fluorescensen blev monitoreret kontinuerligt ved 405 nm ved anvendelse af et spektrofotometer (Packard, SpectraCount), eller ved 380/460 nm ved anvendelse af et Hitachi F-2000 spektrofluorimeter (Tokyo, Japan), henholdsvis i 30 minutter, og stoppet ved tilsætning af 50 pi 30% (v /v) eddikesyre. Enzymatiske aktiviteter blev analyseret i de følgende buffere (slutkoncentrationer): human faktor Xa (21 nM i 0,02 M Tris-HCI, pH 7,4, indeholdende 0,14 M NaCl, 5,0 mM CaClz

2 og 0,1% bovint serumalbumin, 0,57 mM Boc -lle-Glu-Gly-Arg-AMC); bovin trypsin (40 nM i 0,1 M Tris-HCI, pH 8,0 indeholdende 0,02% (v /v) CaCb

2; 0,8 mM Bz-Arg-pNan); bovin chymotrypsin (88 nM i 0,05 M Tris-HCI, pH 8,0; 0,8 mM Suc-Phe-pNan); HuPK (14,7 nM i 0,1 M Tris-HCI, pH 8,0 indeholdende 0,5 M NaCI; 0,4 mM H-D-Pro-Phe-Arg-pNan); PoPK (2,6 nM i 0,1 M Tris-HCI, pH 9,0; 0,16 mM HD-Val-Leu-Arg-pNan); HNE (1,3 nM i 0,05 M Tris-HCl, pH 7,0 indeholdende 0,5 M NaCI; 0,88 mM MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNan); human plasmin (3,5 nM i 0,1 M Tris-HCI, pH 7,4 indeholdende 0,2 M NaCl; 0,9 mM HD-Val-Leu-Lys-pNan) og papain (87 nM i 0,1 M Na

2HPO

4, pH 6.3 indeholdende 0,4 M NaCl, 0,01 M EDTA, 0,4 mM Z-Phe-Arg-pNan). De tilsyneladende K

IAPP værdier blev bestemt ved at tilpasse de eksperimentelle punkter til ligningen for langsomt tæt binding [31] ved hjælp af Grafit, version 4.0 (Erithacus Software, Staines, UK) [32].

reaktivt sted bestemmelse ved affinitetskromatografi på trypsin-Sepharose

en prøve indeholdende 1,8 mg protein i 0,1 M Tris-HCI-buffer pH 8,0 blev påført på en 1,0 ml trypsin-Sepharose-søjle ækvilibreret med den samme buffer. Inhibitoren blev elueret ved 0,5 M KCI /HCI, pH 2,0 og holdes i denne pH indtil den N-terminale bestemmelsestrinnet.

Protein krystallisation

En stærkt oprenset proteinprøve puljet fra en Superdex 75 søjlen blev dialyseret i en buffer bestående af 20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl og 3% glycerol, og blev derefter opkoncentreret til 8,5 mg /ml under anvendelse centrifugalfilter Units (Millipore, Billerica, MA). Indledende krystallisering forsøg blev udført ved hjælp af en Phoenix robot (Art Robbins Instruments, Mountain View, CA). Et antal hits blev opnået fra flere forskellige krystallisations- skærme [JCSG (Qiagen, Valencia, CA), Crystal Screen HT, Index (Hampton Research, Aliso Viejo, CA), og Wizard1-2 (Emerald Biosystems, Bedford, MA)]. Diffraktionskvalitet krystaller blev opnået fra skærme JCSG-CORE-II D12 (0,2 M Li

2SO

4, 30% PEG3350) og G8 (0,16 M ammoniumsulfat, 0,08 M ​​natriumacetat pH 4,6, 20% PEG4000, 20 % glycerol). Krystaller optrådte på andendagen og voksede til fuld størrelse inden for flere dage ved 20 ° C.

X-ray indsamling og behandling af data

Diffraktion data blev indsamlet på den sydøstlige Regional Collaborative Access Team (SER-CAT) beamline 22-ID på Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory. Enkelte krystaller blev overført til en kryobeskyttende opløsning (moderlud med ekstra 10-20% glycerol) i ca. 2 minutter og derefter blev lynfrosset ved 100 K i en strøm af flydende nitrogen. En krystal fra JCSG-CORE-II tilstand G8 (navngivet formular I) diffrakterede røntgenstråler til løsningen af ​​1,5 Å. Diffraktionsdataene blev indekseret, integreret, og skaleres med programmet XDS [33]. Krystallen hører til rummet gruppen

C

2 med enhedscelleparametre a = 114,9 Å, b = 46,2 A, C = 71,5 Å, β = 103,4 ° og indeholder en dimer af CrataBL i den asymmetriske enhed. Den anslåede Matthews koefficienten er 2,26 Å

3 Da

-1, svarende til 45,5% indhold af opløsningsmidler. En krystal fra JCSG-CORE-II tilstand D12 (navngivet formular II) diffrakteret røntgenstråler til løsningen af ​​1,75 Å. Diffraktionsdataene blev også bearbejdet med programmet XDS. Krystallen også hører til rumgruppe

C

2 men med forskellige enhedscelleparametre, a = 95,6 Å, b = 76,3 Å, c = 62,3 Å, β = 120,1 °, med en enkelt CrataBL dimer i asymmetriske enhed. Den anslåede Matthews koefficienten er 2,66 Å

3 Da

-1, svarende til 53,9% indhold af opløsningsmidler. Databehandling statistik for begge krystalformer er vist i tabel 1.

Strukturbestemmelse og forfining

Strukturen af ​​CrataBL blev indledningsvist bestemt ved anvendelse diffraktionsdata af krystalform I, og den resulterende koordinater blev efterfølgende anvendt som udgangspunkt model for molekylær udskiftning med data indsamlet for krystalform II. Strukturen af ​​CrataBL blev løst ved molekylær erstatning med programmet Phaser [34], [35] ved hjælp af strukturen af ​​vandopløselig klorofyl protein (PDB ID: 2DRE) som et udgangspunkt model. Sidstnævnte protein blev valgt på grund af sin højeste primære struktur identitet med CrataBL ( 30%). Der blev fundet en unik løsning, der repræsenterer to molekyler i den asymmetriske enhed for data mellem 20,0 og 2,5 Å, med en Log-Likelihood gevinst på 122,3. Den resulterende elektrontæthedskort var fuldt fortolkelige, kontrollere rigtigheden af ​​løsningen. Yderligere raffinement blev udført med REFMAC5 [36] og PHENIX [34], ved hjælp af alle data mellem 20 og 1,5 Å, efter annullation 2% af tilfældigt udvalgte refleksioner (1172 i alt) til beregning af R

gratis [37]. Isotrope individuelle temperatur faktorer var raffineret, med TLS parametre tilføjet i de sidste faser af raffinement. Efter flere yderligere runder af automatiseret raffinement og manuel korrektion ved hjælp Coot [38], blev den strukturelle model endelig raffineret til en R-faktor på 17,3% og R

fri for 20,8%. Strukturen af ​​krystalform II blev løst med Phaser og formen I koordinater som udgangspunkt model; som nærmere udførtes under anvendelse af en protokol svarende til den, der er rapporteret for krystalform I. Den endelige model blev raffineret til 1,75 Å opløsning, hvilket resulterer i en R-faktor på 18,5% og R

fri på 23,2%. Udbygningen statistik for strukturerne af CrataBL i de to krystalformer er vist i tabel 1. Strukturerne blev sammenlignet under anvendelse Dali serveren [39] med det sæt af Protein Data Bank strukturer med mindre end 90% sekvensidentitet.

Cell levedygtighed assay

cellelinier.

cellelinjer DU145 (HTB-81 ™) og PC3 (CRL-1435 ™) blev købt fra ATCC. Celler blev holdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium suppleret med 10% (vol /vol) varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS), 100 ug /ml streptomycin og 100 IU /ml penicillin, ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2. Cellelevedygtighed blev bestemt ved den modificerede kolorimetrisk assay under anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). DU145 eller PC3 blev udpladet i plader med 96 brønde (TPP, Trasadingen, Schweiz) med en tæthed på 5,0 x 10

3 celler per brønd i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af CrataBL (5, 10, 20 og 40 uM) eller sojabønnetrypsininhibitor (SBTI) (5, 25, 50, 100 uM) fremstillet i RPMI medier ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2. Efter 24, 48 og 72 h dyrkning, 10 pi MTT (5 mg /ml i phosphatbufret saltvand, PBS) blev tilsat til brøndene (2 H, 37 ° C), efterfulgt af fjernelse af mediet og tilsætning af 100 pl /brønd af dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) for at solubilisere krystallerne af formazan. Absorbansen blev målt ved 540 nm under anvendelse af et spektrofotometer (Packard, SpectraCount). Hvert eksperiment blev udført tre gange.

Celledød analyse ved flowcytometri

DU145 og PC3-celler (1 x 10

5-celler) blev podet på plader med 6 brønde (TPP, Trasadingen , Schweiz) i 24 timer for komplet vedhæftning. Brøndene blev derefter vasket tre gange med RPMI-medium uden FBS (ved inkubationsperioder på 15 min ved 37 ° C og 5% CO

2). Cellerne blev inkuberet i 24 timer i RPMI medier uden FBS at synkronisere cellecyklussen. Derefter blev cellerne behandlet med CrataBL (40 uM) i 24 og 48 timer i RPMI uden FBS ved 37 ° C og 5% CO

2. Ved afslutningen af ​​hver inkubation blev cellerne fjernet fra pladen under anvendelse af trypsin-EDTA-opløsning (Cultilab, Campinas, Brasilien) [40], overført til cytometri rør, vasket med 500 pi bindingspuffer (BD PharMingen kit), centrifugeret, og resuspenderet i 50 pi af den samme buffer også indeholdende 3 pi Annexin V-FITC og 5 pi propidiumiodid (PI). Reaktionsblandingen blev inkuberet i 30 minutter i mørke, og derefter 300 pi af den samme bindingspuffer blev tilsat til hvert rør og analyseres ved flowcytometri (FACSCalibur, BD, San Diego, USA) [41], [42].

Analyse af mitokondrie cytochrom c-frigivelse

DU145 og PC3-celler blev podet på 13-mm dækglas (5 × 10

4 celler /brønd), som er tilføjet i 24-brønds plader og inkuberet i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO

2 for fuld vedhæftning. Cellerne blev efterfølgende inkuberet i RPMI-medium uden FBS i 24 timer, efterfulgt af behandling med 40 pM CrataBL i RPMI medier uden FBS, og inkuberet ved 37 ° C og 5% CO

2 i 12 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev cellerne vasket med PBS og mitokondrier blev mærket med Mitotracker Deep Red 633 (1:500) (Molecular Probes) i 20 min i mørke og fikseret med 2% (vol /vol) paraformaldehyd i PBS i 15 min. Cellerne blev vasket igen tre gange med PBS indeholdende 0,01 M glycin og derefter permeabiliseret med 0,01% saponin i 15 min. Cellerne blev efterfølgende farvet i 2 timer med det primære antistof, mus-anti-cytochrom c (1:400) (R 0,05; **

s

0,01; ***

s

. 0,001

Data deposition

De atomare koordinater og struktur faktorer er blevet deponeret hos Protein Data Bank, www.rcsb.org (FBF tiltrædelse koder 4IHZ og 4II0 for krystalformer i og II, henholdsvis). De protein sekvensdata rapporteret her vises i UniProt Vidensbase under deponeringsnumrene B8WI86 og C0HJA4.

Resultater og Diskussion

Rensning af CrataBL og vurdering af sine aktiviteter

CrataBL er et basisk protein (pi 10), som kunne oprenses på en relativt enkel måde [17]. De indledende trin involveret ekstraktion i 0,15 M NaCl og ionbytningskromatografi i CM-Cellulose (figur 1A). Gelpermeationskromatografi på en Superdex 75-søjle (figur 1B) tillod oprensning af proteinet til en homogen form egnet til strukturelle studier, med kun en enkelt stor top synlig efter omvendt fase-kromatografi på en C

18 HPLC-søjle (figur 1C ). Native protein migrerer mest som en homodimer ved den anvendte koncentration i forsøgene krystallisering (se nedenfor).

(A) Fraktionen 30-60% blev underkastet ionbytningskromatografi på CM cellulose i ligevægt med 10 mM phosphat citratbuffer (PCB), pH 5,5. To ml fraktioner blev opsamlet ved en strømningshastighed på 0,3 ml /min. En pil angiver eluering med 10 mM phosphat citratpuffer, pH 5,5, indeholdende 0,5 M NaCl; (B) Størrelse eksklusion kromatografi på Superdex 75 ækvilibreret med 0,15 M NaCl ved en strømningshastighed på 0,5 ml /min. (C) Den fraktion protein blev elueret med en lineær gradient (5-100%) af 90% acetonitril i 0,1% TFA i Milli-Q-vand (opløsningsmiddel B) ved strømningshastighed på 0,7 ml /min (

t

= 0,1 min, 5% B;

t

= 5 min, 5% B;

t

= 30 min, 40% B;

t

= 50 min , 50% B;

t

= 60 min, 100% B;

t

= 65-68 min, 0% B)

Lectin og hæmagglutinerende. aktiviteter CrataBL blev noteret tidligere [17], og disse egenskaber er ikke blevet analyseret yderligere. Imidlertid har vi vurderet evne CrataBL til at fungere som en protease-inhibitor. Vi fandt, at det kunne inhibere bovin trypsin og faktor Xa, men ingen andre serinpeptidaser herunder chymotrypsin, plasmin, humant neutrofil elastase, humant plasma kallikrein, porcin pancreatisk kallikrein, eller en cysteinprotease papain (tabel 2). K

IAPP, beregnet ved anvendelse af ligningen beskrevet af Morrison et al. [32], var 43 uM for trypsin og 8,6 pM for faktor Xa, hvilket indikerer, at CrataBL er en relativt svag inhibitor, langt mindre potent end nogle andre inhibitorer, der hører til den samme familie som ofte nanomolær af selv picomolær [43], [ ,,,0],44].

primær struktur, glykosylering, og biokemiske egenskaber af CrataBL

Den primære struktur af moden CrataBL består af et enkelt polypeptid 164 eller 165 aminosyrer langt, til stede i det mindste to forskellige isoformer, som adskiller sig i positionerne 31 (Pro /Leu); 92 (Ser /Leu); 93 (Ile /Thr); 95 (Arg /Gly) og 97 (Leu /Ser) (figur 2). Den C-terminale Gly165 kan være til stede i kun en brøkdel af molekylerne. Tilstedeværelsen af ​​fem cysteinrester angivet en mulighed for at danne to intramolekylære disulfidbindinger, hvis tilstedeværelse blev kontrolleret af krystalstrukturer (se nedenfor).

En sammenligning af aminosyresekvensen af ​​isoform I af CrataBL med sekvenserne af strukturelt lignende proteiner, som bestemt med programmet Dali [39]. Cysteinrester er vist i sorte bokse og stærkt konserverede aminosyrer er fremhævet med gråt. Restpositioner P1 og P1 ‘, mellem hvilke den proteolytiske spaltning forekommer, er angivet i feltet. Stjerner angiver glykosyleringssteder i CrataBL. Sekvensen for isoform II afviger i positionerne 31 (Pro /Leu); 92 (Ser /Leu); 93 (Ile /Thr); 95 (Arg /Gly) og 97 (Leu /Ser).

Araújo et al. [17] anslået molekylvægten af ​​CrataBL ved ca. 21 KDa på SDS-PAGE og har vist ved Schiff-farvning, at proteinet er glycosyleret. Yderligere analyse af glycosylering ved massespektrometri og proteinsekvens bestemmelse har vist tilstedeværelsen af ​​N-bundne oligosaccharider på Asn27 og Asn57. MALDI-TOF MS-analyse af den molekylære masse af nativ protein gav en top ved m /z 20388, med en skulder ved ca. 19700 (M + H)

+, hvilket viser tilstedeværelsen af ​​en isoform. En yderligere højdepunkt på 10229 skyldes molekylær ion (M + 2H)

+ (figur 3). Phenol-svovlsyre-metoden [27] blev anvendt til at bestemme koncentrationen af ​​carbohydrat på proteinet, hvilket indikerer -6% kulhydratindhold.

molekylmasse af kulhydratdele blev estimeret ved forskellene mellem den massespektrometri af de glycosylerede peptider og deres aminosyresekvenser. I tilfælde af Asn57, er molekylvægten vist sig at være 1.170 Da henviser ved Asn27, blev påvist yderligere signaler af 162 Da eller mere (data ikke vist).

Sekvenserne af begge isoformer af CrataBL viser høj lighed med en række proteiner med β-trefoil fold (figur 2), herunder Kunitz typen inhibitorer fra STI (sojabønnetrypsininhibitor) familie [45]. Sådanne inhibitorer fungerer ved tæt binding til deres mål-protease og indsætte deres reaktive løkke til dets aktive site, undertiden også fungerer som langsomme substrater [2].

Placeringen af ​​reaktionssted i CrataBL blev bestemt ved kromatografi på trypsin -Sepharose i 0,1 M Tris-HCI, pH 8,0. Efter binding til bæreren, blev inhibitoren holdt i 30 minutter på søjlen og blev derefter elueret med 0,5 M KCI /HCI pH 2,0 og holdt ved denne pH. Trypsin bundet til Sepharose hydrolyserer specifikt inhibitoren ved reaktivt sted, og prøven blev holdt under forhold valgt at undgå re-ligering af peptidbindingen. Den resulterende modificerede protein blev sekventeret, og to N-terminale aminosyrer blev fundet i eluatet, en af ​​dem svarer til den N-terminale Ala1 af det intakte inhibitor, mens den anden kunne identificeres som Ser59. Dette resultat indikerer, at sidstnævnte rest skal være til stede i P1-positionen, som defineret af Schechter og Berger [46], således Ser58 skal udfylde P1 position. De mest potente trypsininhibitorer indeholder sædvanligvis en basisk rest (Lys eller Arg, såsom Arg63 i STI [44], [45]) i P1-positionen. Kun et par kendte Kunitz-P inhibitorer har Ser ved P1 position [47], men det har vist sig, at tilstedeværelsen af ​​serin i P1 ‘forbedrer interaktioner med trypsin [48]. Den observerede spaltningsstedet af CrataBL svarer til den reaktive løkke i de fleste kendte Kunitz-P typen inhibitorer, såsom STI [44] (figur 4).

En sammenligning af aminosyresekvensen af ​​isoform I af CrataBL med sekvenserne af BvTI – trypsininhibitor rensede fra

Bauhinia variegata

; Buxi – inhibitor af faktor Xa fra

Bauhinia ungulata

; ECTI – trypsininhibitor renset fra

Enterolobium contortisiliquum trypsin inhibitor

[42], [43]. Cysteinrester er vist i gråt og stærkt konserverede aminosyrer er fremhævet med sort. Restpositioner P1 og P1 ‘, mellem hvilke den proteolytiske spaltning forekommer, er angivet i kasser. Stjerner angiver glykosyleringssteder i CrataBL.

Crystal struktur CrataBL

Den tredimensionale struktur CrataBL blev bestemt i to krystalformer. Begge af dem var i rummet gruppe

C

2 og indeholdt to molekyler i den asymmetriske enhed, men enheden celle parametre og krystal pakning var anderledes. Strukturerne blev forfinet med forholdsvis høj opløsning, 1,5 Å til krystalform I og 1,75 Å til krystalform II, med acceptable geometriske parametre (tabel 1). De endelige modeller var komplet for alle fire uafhængige molekyler med resterne 1-164 spores. Tilstedeværelsen af ​​meget veldefineret C-terminale carboxylat i molekyle A i krystalform I tyder på, at den sidste rest var Ser164 og at Gly165, selv kommenteret i den primære struktur, ikke var til stede i den krystalliserede protein (figur 5). Selv om, som nævnt ovenfor, CrataBL isoleret fra sit naturlige kilde er en blanding af isoformer, fremgår det, at det primært molekyler af isoform I blev krystallisering, idet elektrontætheden svarende til resterne, der afveg mellem de to isoformer var helt klar. Omfattende glycosylering ved Asn27 blev bemærket, med op til fire carbohydratenheder bundet til denne rest er synlige. Den bedste tæthed var til stede i molekyle A i krystallinsk form I, hvor den typiske plante-typen glycosyleringsmønster [Manβ1-4GlcNAcβ1-4 (Fucα1-3) GlcNAcβ-Asn] [49] kunne observeres. Kulhydraterne blev mindre godt bestilles i andre molekyler af begge krystalformer. En svag tæthed, der kunne svare til en kulhydrat bundet til Asn57 i krystalform jeg ikke tillade ordentlig modellering. I krystalform II imidlertid densiteten støder op til Asn57 var helt klar og tilladt modellering af en kovalent bundet GlcNAc. To disulfid obligationer blev foretaget af Cys33-Cys80 og Cys126-133, mens Cys74 var til stede i alle molekyler i form af sulfensyre.

2F

på

c kortet blev kontureret på 1,2 σ niveau. Formen af ​​densiteten svarende til C-terminale carboxylat viser klart, at Gly165, skønt fundet i sekvensen, ikke er til stede i isoformen danner krystal. Figur tilberedt med PyMOL [69].

fold CrataBL består af en β-kløverblad, typisk for dette protein familie. Zhang et al.