PLoS ONE: Small RNA sekventering for Profilering MikroRNA’er i Long-Term Bevares formalinfikserede og paraffinindlejrede Ikke-småcellet lungekræft Tumor Specimens

Abstrakt

Baggrund

Bevarelsen af ​​microRNA i formalin-fikseret og paraffin-indstøbt (FFPE) væv gør dem særligt nyttigt for biomarkør undersøgelser. Nytten af ​​små RNA-sekventering for microRNA ekspression profilering af FFPE prøver er endnu ikke fastlagt.

Metoder

Total RNA blev ekstraheret fra de-paraffinized og proteinase K-behandlede FFPE prøver (15- 20 år) af 8. humane lunge adenocarcinom-tumorer ved affinitetschromatografi på silica kolonner. MikroRNA’er i RNA-præparater blev kvantificeret ved Illumina HiSeq 2000 sekventering platform med sekventering biblioteker fremstillet med TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit (version 2.0) for at opnå uparrede læser af 50 B for små RNA-fragmenter. MikroRNA’er blev også kvantificeret ved hjælp af Agilent Menneskelig miRNA (frigive 16,0) microarrays, der kan opdage 1.205 modne microRNA og ved kvantitativ revers transkription (RT) -PCR analyser.

Resultater

Mellem 9,1-16.900.000 læser blev opnået ved små RNA-sekventering af ekstraherede RNA-prøver. Af disse er kun 0,6 til 2,3% (middelværdi = 1,5%) repræsenteret microRNA. Den sekventering metode opdaget 454-625 microRNA /prøve (middelværdi = 550) sammenlignet med 200-349 (gennemsnit = 286) microRNA’er opdaget af microarray. I Spearman korrelation analyser, den gennemsnitlige korrelationskoefficient for de 126 microRNA’er påvises i alle prøver ved begge metoder var 0,37, og 0,5 for 63 microRNA. I sammenhæng analyser af sequencing- og RT-PCR-baserede målinger, koefficienterne var 0,19-0,95 (middelværdi = 0,73), og 0,7, henholdsvis for 7 af 9 undersøgte microRNA. Den gennemsnitlige inter-replikat Spearman korrelationskoefficient for sekventering metode var 0,81.

Konklusioner Salg

små RNA-sekventering kan anvendes til opnåelse af microRNA profiler af FFPE vævsprøver med ydeevne svarende til dem i microarrays egenskaber på trods af fragmenteringen af ​​ribosomale og messenger-RNA’er, som reducerer metodens informativ kapacitet. Nøjagtigheden af ​​metoden kan tænkes forbedres ved at øge sekventering dybde og /eller nedbrydende FFPE væv RNA af ribosomale RNA-fragmenter

Henvisning:. Buitrago DH, Patnaik SK, Kadota K, Kannisto E, Jones DR, Adusumilli PS (2015) Små RNA sekventering for Profilering MikroRNA’er i Long-Term Konserverede formalinfikserede og paraffinindlejrede Ikke-småcellet lungekræft Tumor Prøver. PLoS ONE 10 (3): e0121521. doi: 10,1371 /journal.pone.0121521

Academic Redaktør: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, UNITED STATES

Modtaget: August 27, 2014 Accepteret: 3 februar 2015; Udgivet 26. marts, 2015

Copyright: © 2015 Buitrago et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. forfatternes laboratoriearbejde er støttet af tilskud fra National Institutes of Health (R21 CA164568-01A1, R21 CA164585-01A1, R01 CA136705-06, U54 CA137788, P30 CA008748, og P50 CA086438-13), det amerikanske forsvarsministerium (PR101053 og LC110202), og Mr. William H. Goodwin og Fru Alice Goodwin, Commonwealth Foundation for Cancer Research, og Experimental Therapeutics center Memorial Sloan Kettering Cancer center. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. To af medforfattere til dette manuskript (PA og SKP) er PLoS ONE Redaktionelle bestyrelsesmedlemmer. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

MikroRNA’er er enkeltstrengede, ikke-kodende RNA af 18-25 nukleotider i længde, der fungerer som epigenetiske regulatorer ved at hæmme protein oversættelse fra eller fremkalde nedbrydning af messenger-RNA (mRNA) afskrifter, at de målrette [1, 2]. MikroRNA’er er involveret i vigtige biologiske processer, såsom celleproliferation, differentiering og apoptose [3], og dysregulering af microRNA er blevet påvist i initiering og progression af en række humane maligniteter [4-8]. Karakterisering af microRNA udtryk har været nyttig i klassificeringen, diagnose og prognose af flere maligniteter [9-12].

Vævsprøver, der er blevet bevaret via fiksering i formalin er en værdifuld ressource for retrospektive undersøgelser. På grund af sin enkelhed og lave omkostninger, er enorme mængder af kliniske prøver rutinemæssigt arkiveret efter formalin fiksering. I modsætning mRNA’er, microRNA bevare godt i formalin-fikseret væv på grund af deres ultra-kort længde [13, 14]; dette tillader anvendelsen af ​​sådanne væv til microRNA målinger til kliniske og forskningsmæssige formål. MiRNA profiler af formalinfikserede og paraffinindstøbte (FFPE) væv er sammenlignelige med dem, der opnås fra matchede, frisk-frosne vævsprøver (fx [15, 16-19]), hvilket understreger egnethed FFPE prøver så passende ressourcer til microRNA ekspression analyser. Et stort antal undersøgelser af deres biologiske rolle og biomarkør nytten af ​​microRNA er derfor blevet udført under anvendelse af FFPE prøver (f.eks, [20, 21]).

Hybridiseringsbetingelser microarrays anvendes rutinemæssigt til global microRNA ekspression profilering af FFPE prøver. Lille RNA-sekventering har vist sig som en ny teknologi til microRNA ekspression profilering. Det giver fordelene ved høj følsomhed og specificitet, detektion af både nye og kendte microRNA’er, identifikation af microRNA sekvens polymorfier og redigering, og enklere data normalisering strategier for at sammenligne prøver [22]. Med prisen på tilstrækkeligt informative RNA sekventering analyser nærmer sig mikroarrays og forbedringer af brugervenlighed og robusthed af metoder til RNA-sekventering dataanalyse, lille RNA-sekventering er sandsynligvis vil blive anvendt mere almindeligt end mikroarrays i den nærmeste fremtid. RNA i FFPE prøver er kemisk modificeret ved tværbinding på grund af formaldehyd, og det er væsentligt fragmenteret [23] ved oxidation ved eksponering for luft, aktivitet af endogene ribonucleaser under fiksering, og anvendelsen af ​​høje temperaturer i løbet af paraffin-indlejring proces. Nedbrydning af RNA forekommer også under dets isolering fra FFPE prøver, som involverer langvarig udsættelse for høje temperaturer (55 ° C-70 ° C). Små fragmenter af ribosomale RNA’er (rRNA’er) og mRNA’er, der resulterer fra nedbrydning konkurrere med endogene små RNA’er (fx microRNA) under RNA-sekventering. For eksempel Sanger DNA-sekventering af cDNA’er klonet fra FFPE væv RNA viser, at mere end 80% af 18-25 nucleotid-sized små RNA’er i FFPE væv er fragmenter af rRNA’er og transfer RNA’er [24]. På trods af disse negative virkninger af formalin fiksering, er det teoretisk muligt at profilere microRNA i FFPE væv, hvis RNA-sekventering udføres med en passende dybde. Derfor søgte vi at undersøge muligheden for små RNA-sekventering til kvantificering af microRNA i FFPE prøver. Når vi indledte dette arbejde, var der kun én offentliggjort undersøgelse, der havde forsøgt at løse dette spørgsmål [25].

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev foretaget med underforstået informeret og skriftligt samtykke fra deltagere og godkendes af Institutional Review Board of Memorial Sloan Kettering Cancer center (MSK) i New York, NY (IRB nummer WA0269-08).

Tumor prøver

FFPE eksemplarer af 8 terapi-naive ensomme patologiske trin i lunge adenocarcinom tumorer resektion på MSK mellem januar 1995 og december 1999, blev anvendt. De 8 tumorer var fra et sæt af trin I lungeadenocarcinom sager, der tidligere er blevet beskrevet [26, 27]. Valsede profiler af 4 um og 20 um tykkelse blev opnået fra prøverne til RNA-ekstraktion. De 4 um snit blev farvet med hæmatoxylin og eosin til histologisk vurdering under et BX51 mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) for at sikre, at RNA blev ekstraheret fra væv med 70% tumor indhold

RNA ekstraktion og kvantificering.

Totalt RNA blev isoleret fra 4 sektioner, eller ca. 3 mm

3 af hver tumor under anvendelse af affiniteten spinsøjle-baserede High Pure FFPE RNA Isolation Kit (Roche, Indianapolis, USA). RNA blev kvantificeret via absorbans-spektrofotometri på en NanoDrop 2000-instrumentet (Thermo Scientific, Waltham, USA) og via RiboGreen farvestof fluorescens på en qubit fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, USA). Integritet af RNA blev vurderet ved anvendelse af elektroforese på Eukaryot Total RNA Pico chip på Bioanalyzer 2100 (Agilent, Santa Clara, USA). RNA portioner blev opbevaret ved -80 ° C.

Microarray analyse af microRNA

Otte RNA-prøver blev analyseret i to eksemplarer og i separate microarray eksperimenter for de to sæt gentagelser. Agilent SurePrint G3 Menneskelig miRNA 8x60k (frigive 16,0) microarray platform [28] blev anvendt. Denne platform kan registrere 1205 mennesker og 287 humane virale modne microRNA. For hvert af disse microRNA og kontrolrum RNA’er, mikroarrayet har 1-4 forskellige DNA-prober af 40-60 B; hver af disse blev syntetiseret på mikroarrayet på 10-40 pletter af 30 um diameter. RNA (120 ng) blev mærket med 3 ‘, 5′-cytidin bisphosphat med cyaninfarvestof fæstnet til 3’-phosphat og de blev hybridiseret i 45 pi til et mikroarray i 20 timer ved 45 ° C under rotation ved 1/3 Hz, ved anvendelse af reagenser og metoder, der følger med Agilent miRNA Complete Mærkning og hybridisering Kit. Efter post-hybridisering vask blev microarray dias scannet på en Agilent G2505C microarray scanner og data fra billederne blev ekstraheret ved hjælp af Agilent Feature Extraction software (version 9.5.3). Rå microarray data blev deponeret i NCBI Gene Expression Omnibus repository [29] (accession nummer GSE57835).

små RNA-sekventering

Et ug RNA blev anvendt til at generere en lille RNA-sekventering bibliotek under anvendelse af reagenser og metoder, der følger med TruSeq Lille RNA Sample Prep Kit version 2 (Illumina, San Diego, USA). Kort fortalt blev T4 RNA-ligase anvendt til at ligere RA5 og RA3 RNA oligonukleotider til 5 ‘og 3’ enderne af RNA, henholdsvis. Adaptorligerede RNA blev revers-transkriberet under anvendelse af en RTP-primer, og det resulterende cDNA blev amplificeret i en 11-cyklus PCR, som anvendes RP1 og indekseret RP1 primere. PCR-produkter af 140-160 bp blev isoleret efter elektroforese gennem en 6% Novex Tris-borat polyacrylamidgel (Life Technologies). Kvaliteten af ​​det genererede små RNA-sekventering bibliotek blev bekræftet ved hjælp af Agilent Høj følsomhed DNA Analysis Kit på Bioanalyzer 2100 instrument. Quadruplexed sekventering af biblioteker til at generere en enkelt ende læser af 50 B blev udført på Illumina HiSeq 2000 instrument ved hjælp HiSeq clustering og sekventering reagenser (version 2.0). Illumina HCS (version 1.4.8), RTA (version 1.12.4.2), og casava (version 1.8.2) software blev anvendt til basen-opkald og generering af rå, de-multiplex sekventering data i FASTQ format. Rå sekventering data blev deponeret i NCBI Sequence Læs Archive [30] (accession nummer SRP047429).

revers transkription (RT) -PCR assays af små RNA’er

Kort fortalt 50 ng RNA blev revers transkriberet i 15 pi ved anvendelse af en microRNA-specifik oligonucleotid; reagenser og metoder blev leveret i TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit (Life Technologies). CDNA’et (1,33 pi) blev anvendt som template i realtid PCR af 40 cykler og 15 pi, der blev udført tre gange på en 7900HT maskine (Life Technologies) med denaturering i 15 s ved 95 ° C og kombinerede annealing og forlængelse i 60 s ved 60 ° C. SDS-software (version 2.4, Life Technologies) blev anvendt til at beregne kvantificering cyklus (C

q) værdier med automatisk baseline og tærskel afsløring. DNA-oligonukleotider leveres med TaqMan MicroRNA RT-PCR-analyser [31] med identifikationsnumre 397, 509, 1097, 398, 526, og 2340 (Life Technologies), blev anvendt til at kvantificere de menneskelige modne microRNA’er

miR-21-5p

–

205-5p

, –

146b-5p

, –

22-3p

, –

223-3p

, og-

423-5p

hhv. Ældre microRNA

miR-16-5p

, –

210-3p

, og-

486-5p

blev målt ved hjælp af brugerdefinerede analyser, der blev designet baseret på princippet om TaqMan microRNA RT-PCR assays og blev efterfølgende valideret (referencer [31, 32], og S1 Tabel). Alle RT-PCR-analyser blev udført i et enkelt forsøg og data-sæt af rå C

q værdier blev normaliseret ved hjælp af den globale gennemsnitlige metoden [33].

Behandling og analyser af microarray data

Rå data fra alle microarrays blev behandlet sammen ved hjælp af AgiMicroRna BioConductor pakke [34] (version 2.10.0) i R (version 3.0.2). Kort fortalt og som pr optimal arbejdsgang identificeret for microarray platform [35], den robuste multi-chip gennemsnit (RMA) metode [36] blev første gang brugt til probe-sæt sammendrag uden baggrund korrektion; data på tværs arrays blev derefter normaliseret med den fraktil metode. En enkelt outlier microarray blev identificeret ved undersøgelse af normaliserede data ved hjælp af relativ log udtryk, opsyn hierarkisk klyngedannelse, inter-matrix korrelation, og principal komponent plots; den rå microarray data blev re-behandlet efter eksklusive outlier. Ældre microRNA identifikationsnumre (MIMAT IDS) af microRNA påviselige med microarray platformen blev opnået fra miRBase microRNA sekvens repository [37] (version 20). Værdien af ​​IsGeneDetected flag, som blev deermined af Agilent Feature Extraction software, blev anvendt til at bestemme, om microRNA blev påvist ved platformen.

Behandling og analyse af RNA-sekventering data

Trimmomatic [38 ] (version 0.32) blev anvendt til at trimme læser af adapter og dårlig kvalitet baser med disse kriterier, i rækkefølge: (1) fjerne læste segmenter som matcher sekvenser af adaptere og primere anvendt til sekventering bibliotek forberedelse; (2) fjerne førende /efterstillede baser med Phred

33 basis-kvalitet score 3; (3) ved hjælp af en glidende vindue på 4 baser, fjerne 5’terminal base, hvis den gennemsnitlige Phred

33 point af de 4 baser var 15; og (4) helt udsmid trimmet læser med 16 resterende baser. Til bestemmelse modne microRNA ekspression blev miRExpress [39] (version 2.0) anvendes til at kortlægge det forarbejdede læser mod human pre-microRNA og modne microRNA sekvenser (miRBase frigive 20). Standardindstillingerne for miRExpress blev brugt under processen (100% identitet mellem læse- og pre-microRNA sekvens for tilpasning, læse længde ≥80% af moden microRNA længde, og ≤4 ekstra førende /efterstillede baser i en læse i forhold til modne microRNA sekvens ). For at opsummere tæller værdier læser, at kortlagt til en enkelt moden microRNA men flere pre-microRNA’er, den afrundede middelværdi eller median værdi af præ-microRNA-kortlægning tællinger blev brugt, da den maksimale værdi var 50% eller ≥50% af minimum, henholdsvis. Den samlet rå modne microRNA tælledata blev derefter normaliseret tværs prøver under anvendelse den trimmede middelværdi af M-værdier (TMM) normaliseringsmetode, som anført i Edger BioConductor pakke [40] (version 3.2.4). Til bestemmelse af biotyper af RNA (fx mRNA, rRNA, microRNA, etc.), at sekventering læser repræsenteret, subread-align funktion af Subread aligner software [41] (version 1.4.4) blev anvendt til at tilpasse forarbejdes læser-med multi-mapping tilladt, og en ungapped genom indeks-til det humane genom (Ensembl GRCh37.75 primær samling). Den featureCounts funktion [42] af Subread blev derefter anvendt, med multi-overlappende tilladt, at identificere de RNA’er ‘biotype, at sekventering læser repræsenteret via undersøgelse af anmærkninger genomdata steder at læser blev kortlagt til. Den Ensembl s GRCh37.75 gen annotation data med . 25 forskellige gene_biotype tillægger værdier blev brugt

Andet

For analyser, der involverede sammenligning af gentagelser, normaliseret microarray og normaliserede og logge

2-transformeret (med offset = 0,1) sekventeringsdata blev yderligere behandlet med den parametriske Combat funktion af SVA BioConductor pakke [43] (version 3.6.0) for at justere for batch virkning af separate microarray eller sekventering eksperimenter, der anvendes til replikater. For korrelation analyser, normaliseret microarray- og sekventering-baserede microRNA målinger var log

2-transformeret og RT-PCR-baserede normaliserede C

q målinger for microRNA var negative-transformeret. Prism software (version 6.0c, GraphPad, La Jolla, USA) blev anvendt til at plotte data. En

P

-værdi 0,05 var forbundet med statistisk signifikans. RT-PCR-analyser og data blev udført ved Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, USA; alt andet arbejde blev afsluttet ved MSK.

Resultater og Diskussion

Vi udvundet total RNA fra FFPE eksemplarer af resektion trin I lunge adenocarcinom tumorer. RNA blev isoleret under anvendelse silica matrix-holdige spinsøjler fra ca. 3 mm

3 i FFPE væv (n = 8) efter natten over fordøjelse med proteinase K. RNA udbytterne spændte fra 8.0-59.7 ug, som kvantificeret ved absorbans ved 260 nm, men 6,1-34,6 ug, som kvantificeret med RiboGreen farvestof. Dette har mere specificitet for RNA end for DNA (fig. 1A), og det tyder på tilstedeværelsen af ​​DNA i præparaterne, som det er blevet bemærket af andre [32]. Som forventet, gelelektroforese assay på Bioanalyzer instrument viste, at RNA isoleret fra FFPE prøver var stærkt nedbrudt (fig. 1B), med værdier af RNA integritet i området fra 1.9-2.5 [44].

A. Korrelation mellem målinger af RNA udbytte (ug) opnået ved anvendelse af absorbans ved 260 nm eller fluorescens med RiboGreen farvestof (n = 8). Linjerne i identitet og lineær regression (mindste kvadraters metode) og værdier og 95% konfidensintervaller for Pearson koefficient (

r

) og hældningen af ​​lineær regression (

m

);

P

-værdier er også noteret. B. elektroforetogram af de 8 RNA-prøver (

A

–

H

). Prøver blev kørt på en Agilent Eukaryot Total RNA Pico chip på Bioanalyzer 2100. Størrelser på molekylvægtmarkører og RNA integritet numre er noteret.

Sequencing biblioteker blev frembragt fra 1 ug hver af de totale RNA-prøver ved ligering af adapter RNA’er ved 5 ‘og 3’ ender, efterfulgt af revers transkription og PCR under anvendelse af Illumina TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit. Bibliotekerne blev størrelsesselekteret til sekventering af RNA-fragmenter på 15-25 nukleotider. Sekventering blev udført på Illumina HiSeq 2000 platform til opnåelse af enkeltstrenget ende læser af 50 baser. Mellem 9,1 og 16,9 mio opnåedes læser for hver af de 8 prøver (middelværdi = 13,2 mio SD = 3,5 millioner; Tabel 1). Efter læser blev forarbejdet for at fjerne nukleotidsekvenser af adaptere der anvendes til biblioteket forberedelse og baser af dårlig kvalitet, 67.6-% 83,4% (middelværdi = 76,8; SD = 4.5) af den læser kan kortlægges mod hg19 henvisning humane genom samling (Ensembl GRCh37.75 primære samling). Mere end 90% af det tilknyttede læser justeret mod transskriberede områder af genomet. Dog kun 0,14% -0,53% (middelværdi = 0,29; SD = 0,13) af læser kortlagt til loci for microRNA, hvorimod 49,4% -54,6% og 34,8% -39,3% kortlagt til regioner, der kodes for rRNA’er og mRNA’er (tabel 1). Det er således kun en meget lille fraktion (ca. 0,1% -0.5%) af små RNA’er af de 15-25 nukleotider, der blev isoleret fra FFPE vævsprøver var microRNA’er; det overvældende flertal af dem var rRNA og mRNA fragmenter.

miRNA udtryk profiler blev udvundet fra de små RNA sekventering data ved hjælp af miRExpress værktøjet [39]. MiRExpress kortlagt 0,6% -2,2% af det forarbejdede sekventering læser at modne menneskelige microRNA. Per miRBase microRNA sekvens database frigivelse 20 (juni 2013), 2.620 modne menneskelige microRNA var kendt [37]. blev påvist i alt 1.021 mikroRNA (kortlagt læst count ≥1) blandt de 8 prøver, med 454-625 opdaget per prøve (middelværdi = 550; SD = 69), og 283 påvist i alle prøver. For at validere de små RNA-sekventering-baserede microRNA målinger blev kvantitative RT-PCR-assays anvendes til at kvantificere 9 arbitrært valgte microRNA, der blev anset som påvist ved både microarray og små RNA sekventering platforme i alle de 8 RNA-prøver. I Spearman korrelation analyser af microRNA målinger opnået ved RT-PCR og små RNA-sekventering, korrelationskoefficienterne var 0,19-0,95 (middelværdi = 0,73; SD = 0,24). Koefficientværdien var 0,7 til 7 af de 9 microRNA (tabel 2), hvilket indikerer en beskeden nøjagtighed af RNA-sekventering metode. For at estimere teknisk replikabilitet af microRNA ekspression profilering via sekventeringsfremgangsmåden, 2 af de 8 RNA-prøver blev underkastet små RNA-sekventering i en dublet eksperiment. Den inter-replikere Spearman korrelationskoefficienter for de duplikerede microRNA målinger af de 2 prøver var 0,75 og 0,88 (fig. 2).

MikroRNA’er i 2 prøver (

A

og

B

) blev profileret i to eksemplarer af både de små RNA sekventering og microarray platforme. Scatter-plots skildrer den inter-replikat korrelation af normaliserede microRNA målinger. Den kumulative brøkdel af microRNA langs X-aksen (

sort og), og værdierne af Pearson korrelationskoefficient af microRNA målinger i et glidende vindue langs X-aksen af ​​størrelse 51 på midten af ​​vinduet (

grå

) er også vist.

Kvantificering af microRNA via hybridisering af RNA til DNA-prober på mikroarrays er i øjeblikket standardmetoden for global microRNA profilering af FFPE væv. Til mere grundigt vurdere resultaterne af den lille RNA sekventering metode, vi målte microRNA i 120 ng af hver af de 8 FFPE væv RNA-prøver ved hjælp af Agilent 8x60k menneskelige miRNA microarray platform, der er i stand til at detektere 1.205 modne menneskelige microRNA. blev påvist i alt 368 microRNA’er (IsGeneDetected flag-værdi = 1) blandt de 8 prøver, med 200-349 opdaget per prøve (middelværdi = 286; SD = 45) og 175 påvist i alle prøver. Af disse 175 microRNA’er blev 126 også påvises i alle 8 prøver ved den lille RNA-sekventering metode. I sammenligninger med RNA sequencing- og microarray-baserede microRNA målinger, den gennemsnitlige The Spearman korrelationskoefficienten for de 126 microRNA’er var 0,37 og for de 63 microRNA var 0,5. Sammenhæng mellem FFPE væv microRNA målinger opnået ved små RNA sekventering og microarray-platforme er blevet bekræftet af andre grupper [45-47].

Microarray-baserede microRNA analyser blev gentaget for 7 af de 8 RNA-prøver. Målt i forhold til en gennemsnitlig inter-replikere Spearman korrelationskoefficient på 0,81, set med den lille RNA sekventering metode, de inter-replikat korrelationskoefficienter for microarray platform var i 0,98-0,99 interval (middelværdi = 0,99; SD = 0,01). Men i Spearman korrelation analyser af microRNA målinger opnået ved RT-PCR og microarray-analyser, korrelationskoefficienterne var, -0.36-0.84 (middelværdi = 0,22; SD = 0,55) og var mindre end dem, der observeres i RNA sekventering-baserede målinger (tabel 2). Således, mens den lille RNA sekventering platform registreret en større mængde microRNA med større nøjagtighed end microarray platform, dets præcision var ikke så god. Tabel 3 opsummerer karakteristika ydeevne, der blev observeret i de 2 microRNA profilering platforme, der anvendes i denne rapport.

Samlet set vores resultater demonstrere muligheden for små RNA-sekventering for microRNA profilering af FFPE væv RNA på trods af dens kompromitteret kvalitet og integritet. Selvom kun 1,54% af 12,1 mio lille RNA-sekventering læser af FFPE væv blev identificeret som repræsenterende 550 kendte microRNA i denne undersøgelse, er antallet af microRNA der blev påvist og kvantificeret var mere end det ved mikroarray platform (tabel 1 og 3). De Spearman korrelationskoefficienter for målinger foretaget af sekventering og microarray platforme for halvdelen af ​​de 126 microRNA der blev detekteret i alle prøver fra begge platforme var 0,5. I korrelation analyser af sequencing- og RT-PCR-baserede målinger af ni microRNA der blev undersøgt, koefficienterne var 0,7 til 7 (tabel 2). Den tekniske replikabilitet af den lille RNA-sekventering metode var imidlertid relativt dårlige forhold til microarray metode (gennemsnitlige inter-replikate Spearman korrelationskoefficienter på 0,81 og 0,99, henholdsvis; tabel 3). Det er tænkeligt, at præcisionen af ​​sekventering metode kunne forbedres ved at øge sekventering dybde til opnåelse af et større antal læser og ved at anvende metoder til at depletere rRNA fra RNA præparater [48-50] eller at mindske dets repræsentation i sekventering biblioteket ved hjælp af strategier som ‘gift primer “blokere [24].

Kun én undersøgelse [25] havde rapporteret, at muligheden for at anvende små RNA-sekventering for microRNA profilering af FFPE væv RNA, når vi indledte arbejdet er beskrevet i denne papir. Siden da inden for det seneste år, har mindst 5 andre undersøgelser vist, at RNA-sekventering kan bruges til præcist profil microRNA i FFPE prøver (S2 tabellen) [45-47, 51, 52]. Disse undersøgelser meste udføres fra cellelinjer og humane FFPE væv af 2-9 år har vist, at microRNA ekspressionsprofiler opnået ved små RNA-sekventering er stærkt overensstemmende mellem FFPE og frisk-frosset væv [25, 47, 51, 52], og at lille RNA sekventering og microarray platforme generere lignende microRNA profiler af FFPE væv [25, 47]. Resultaterne af disse og vores undersøgelser udført på NSCLC prøver på 15 til 20 år derfor vise, at små RNA-sekventering kan bruges til at opnå microRNA profiler af FFPE vævsprøver med ydeevne, der svarer til mikroarrays egenskaber.

Støtte Information

S1 Table. Tilpasset TaqMan microRNA revers transkription (RT) -PCR analyser for humane modne microRNA’er

miR-210-3p

miR-486-5p

doi:. 10,1371 /journal.pone. 0121521.s001 Hotel (DOCX)

S2 Table. Seks studier, der har vurderet RNA-sekventering til profilering microRNA i formalinfikserede, paraffinindlejrede væv

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0121521.s002

(DOCX)

Tak

Vi takker Alex Torres i Thoraxkirurgisk service på MSK for hans redaktionelle hjælp.