PLoS ONE: En kompenserende rolle NF-KB til p53 i respons til 5-FU-kemoterapi for mavekræft Cell Lines

Abstrakt

På trods af bemærkelsesværdig forbedring af postoperative 5-FU adjuverende kemoterapi, tilbagefald på mavekræft patienter, der gennemgår helbredende resektion efterfulgt af adjuverende kemoterapi fortsat stærkt. Derfor er det vigtigt at identificere forudsigelse markører for den kemoterapeutiske effekt af 5-FU. Vi har for nylig identificeret NF-KB som kandidat tilbagefald forudsigelse biomarkør i mavekræft. For at evaluere den biologiske betydning af NF-KB i forbindelse med 5-FU-baseret kemoterapi, analyserede vi NF-KB-afhængige biologiske respons ved 5-FU behandling i gastriske cancercellelinier. Syv gener induceret ved 5-FU behandling i en NF-KB-afhængig måde, blev identificeret, hvoraf fem er kendte p53-mål. Knockdown af

RELA

, som koder for p65-underenheden af ​​NF-KB, faldt både p53 og p53 target-proteinniveauer. I modsætning hertil blev NF-KB ikke påvirket af

TP53

knockdown. Vi viste også, at cellelinjer der bærer Pro /Pro homozygoti i codon72 af p53 exon4, hvilket er vigtigt for NF-KB-binding til p53, er mere modstandsdygtige over for 5-FU end dem med Arg /Arg homozygoti. Vi konkluderer, at NF-KB spiller en vigtig rolle i reaktionen på 5-FU behandling i gastriske cancer cellelinjer, med en mulig kompenserende funktion af p53. Disse resultater antyder, at NF-KB er en potentiel 5-FU-kemosensitivitet forudsigelse markør, der kan afspejle 5-FU-induceret stress-respons veje, herunder p53

Henvisning:. Endo F, Nishizuka SS, Kume K, Ishida K, Katagiri H, Ishida K, et al. (2014) En kompenserende rolle NF-KB til p53 i respons til 5-FU-kemoterapi for mavekræft cellelinier. PLoS ONE 9 (2): e90155. doi: 10,1371 /journal.pone.0090155

Redaktør: Thomas G. Hofmann, tysk Cancer Research Center, Tyskland

Modtaget: Oktober 17, 2013; Accepteret: 28 Januar 2014; Publiceret: 27 feb 2014

Copyright: © 2014 Endo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af MIAST (Medical Innovation af Advanced Technology) projekt af Grant-in-Aid strategiske Medical Science Research center fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Videnskab og Teknologi i Japan, 2010-2014 (SSN, K.Ku. GW); og Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (C) (11.863.286) (S.S.N.), og (12.877.914) (K.Ko.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

de fleste af mavekræft i verden er diagnosticeret i Østasien [1], hvor standardbehandling for avancerede gastrisk kræft forbliver kirurgi og kemoterapi. Nyligt udviklede adjuverende kemoterapeutiske regimer efter helbredende gastrektomi for avanceret mavekræft har gjort betydelige fremskridt med hensyn til at kontrollere tilbagefald og sygdomsfri overlevelse, især i den japanske befolkning [2], [3]. Men 30-40% af patienterne stadig oplever tilbagefald trods kemoterapi efter kurativ gastrektomi [3], hvilket tyder på, at patienten valg baseret på molekylær information potentielt kan være meget effektiv til at øge kemoterapi-medieret ikke-tilbagefald og overlevelse.

for at vælge for gastrisk kræftpatienter, der kan drage fordel kemoterapi, er det vigtigt at forstå de enkelte følsomheder før kemoterapi [4]. Postoperativ adjuverende kemoterapi af mavekræft giver en mulighed for at afprøve patient-afledte tumorer før de modtager kemoterapi. I et forsøg på at identificere potentielle biomarkører i denne indstilling på proteinniveauet, vi tidligere rapporteret en cellelinje panel screening system ved hjælp af kvantitativ proteinekspression profilering med omvendt fase proteinarrays (RPPAs) [5], [6] kombineret med en celle- baseret vækst assay system baseret på begrebet NCI-60 cellelinje screening panel [7], [8]. Kandidat- biomarkører blev isoleret baseret på korrelationskoefficienter fra proteinekspression og lægemiddelfølsomhed matrix og derefter yderligere valideret med kirurgisk fjernede prøver [9]. Baseret på denne tilgang identificerede vi to biomarkører på proteinniveauet, herunder NF-KB og JNK, hvis niveau havde god korrelation med kemoterapeutiske respons. Den højere ekspression af NF-KB syntes at korrelere med en dårligere prognose, mens JNK viste en omvendt korrelation. Disse markører blev også valideres på det molekylære niveau ved hjælp af gastrointestinale cancercellelinier. Det er blevet vist, at siRNA-medieret knockdown af p65 næsten udelukkende påvirker 5-FU følsomhed blandt aktuelt anvendte kemoterapeutiske lægemidler; men dette er ikke tilfældet for JNK knockdown [9]. Vi konkluderede derfor, at NF-KB spiller en dominerende rolle i 5-FU behandling og JNK kan være en indikator for kronisk inflammation af mavens baggrund slimhinder [10]. Som en forlængelse af denne valideringsundersøgelse vi søgt at udforske disse proteiner funktionelt og præcisere den rolle af NF-KB som en stress-inducerbare transskription faktor under 5-FU-behandling. Vi evaluerede også rollen af ​​p53 efter 5-FU-medieret transaktivering af NF-KB [10], [11], fordi det er velkendt, at p53 aktiveres som reaktion på denne genotoksisk stof [12]. I denne undersøgelse rapporterer vi en potentiel kompensatorisk rolle af NF-KB for p53 gennem analyse af en p53-NF-KB bindende polymorfe site, codon 72 af p53. Sammen disse resultater tyder på, at NF-KB /p53-codon72 kunne være en robust biomarkør for 5-FU følsomhed.

Materialer og metoder

cellelinier

Nine menneskelig gastrisk cancer cellelinjer, herunder Kato-III, KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, GSS, GCIY, og MKN45 blev opnået fra Riken Bioresource center Cell Bank. IWT-1 var en

de novo

cellelinie, der er etableret i vores laboratorium fra en japansk mandlig mavekræft patient, som havde tilbagefald bughindebetændelse carcinomatosa. Brugen af ​​IWT-1 celle linje er blevet godkendt af Iwate Medical University Institutional Review Board (H25-116, og HG H25-15) og familien af ​​donor patient, som var død på det tidspunkt, etablering af cellen linje med en skriftligt informeret samtykke med hensyn til prøveudtagning og gøre cellelinien. Cellerne blev dyrket til 70-80% sammenflydning i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i nærvær af 5% CO

2.

Fremstilling af cellelysat

Celler blev høstet ved centrifugering og cellepellets lyseredes under anvendelse Pink puffer indeholdende 9 M urinstof (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), 4% 3 – [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1 -propanesul-fonate (CHAPS; Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland), 2% pH 8,0-10,5 pharma-Lyte (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan), og 65 mM DTT (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan) som tidligere beskrevet [5], [13].

Western Blot

SDS-PAGE blev udført under anvendelse NuPAGE 4-12% Bis-TrisGel elektroforese (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), XCell Sure Lock Mini-celle (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), og Power PAC HC (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). De opløste proteiner på gelen blev overført til en nitrocellulosemembran under anvendelse iBlot Dry Blotting System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De resulterende membraner blev blokeret med 5% iBlot (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og 0,1% Tween-20 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) i TBS (TBST) i 1 time. Membraner blev derefter inkuberet med de angivne primære antistoffer, herunder pan-actin, p53 (Thermo Scientific, Kalamazoo, MI, USA); p21, Tigar, og PUMAα /β (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); og NF-KB, α-tubulin, og PCNA (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japan). Derefter blev membranerne vasket to gange i 5 min med TBST, inkuberet med et HRP-konjugeret sekundært antistof i 1 time og derefter vasket to gange i 5 minutter i TBST. Kemiluminescensdetektion reagenser blev inkuberet med membranerne for 1-5 minutter og derefter billeder blev erhvervet ved hjælp af billede Quant LAS500 (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan). At evaluere protein induktion med 5-FU, blev western blots kvantificeret ved hjælp ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Immuncytokemi

Celler blev dyrket til 70-80 % sammenflydning i RPMI-1640 suppleret med 10% FBS i 4-kammer polystyren fartøj vævskultur-behandlet objektglas og derefter behandlet med 5-FU, som angivet i hvert forsøg. Efter at cellerne blev udsat for 50 uM 5-FU i 4 timer for at se en tidlig transkriptionel respons, blev de fikseret i 4% paraformaldehyd, permeabiliseret under anvendelse af 0,2% Triton X-100 i PBS og farvet med DAPI (0,6 uM DAPI, 50 pi RNase, og 5 ml PBS) ved stuetemperatur i 12 min. Celler blev derefter inkuberet med de følgende primære antistoffer: anti-NF-KB p65, phospho-NF-KB p65 (Ser536), og phospho-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japan), og p53 (Thermo Scientific , Kalamazoo, MI, USA). Endelig blev cellerne inkuberet med enten Alexa Fluor488- eller 568-konjugeret sekundært antistof (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan). En BX43 fluorescerende mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) blev anvendt til billedoptagelse.

genekspressionsprofilering

MKN45 celler blev høstet efter behandling med eller uden 50 uM 5-FU i 4 timer . RNA blev derefter ekstraheret fra den høstede celler og genekspression profilering blev udført ifølge producentens anvisninger (Sure Udskriv G3 Humant GE8 × 60 K, Agilent Technologies Japan, Tokyo, Japan). Rådata blev først normaliseret ved at dividere hver probe signal ved 75

percentil af hele signalet. Hver microarray eksperiment blev udført in duplo resulterer i to kontrol og to 5-FU behandling microarray datasæt. At identificere gener, der blev differentielt udtrykt i respons til 5-FU, blev hver kontrol datasæt sammenlignet separat til hver 5-FU behandling, der er (4 sammenligninger). Differentielt udtrykte gener var dem, der havde en ændring i ekspression 2 gange i hver sammenligning. Vi identificerede den endelige sæt af 10 differentielt udtrykte gener baseret på deres frekvens i de 4 sammenligninger [14]. For at bekræfte reproducerbarheden af ​​disse ekspressionssystemer ændringer, kvantitativ real-time RT-PCR af 5-FU-behandlede prøver efter 0, 4, 8, 12 og 24 timer blev udført for hvert gen. Primersekvenser er opført i tabel S1. For gener induceret ved 5-FU, blev analyse af promotor- bindingssteder udført under anvendelse Jaspar algoritmen (Jaspar, https://jaspar.genereg.net/). En 1000 bp promotorsekvens specifikke for respektive gener blev opnået fra transcriptionale regulatoriske Element Database (https://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home). Bindingssteder blev forudsagt ved scanning promotorsekvenserne med konsensus sekvenser af NF-KB og p53 med 70% af profil score tærskel.

RELA og TP53 Gene Knockdown

Celler blev dyrket til 70-80 % sammenflydning i RPMI-1640 suppleret med 10% FBS i 6-brønds cellekulturplader og derefter behandlet med NF-KB p65 eller p53 siRNA (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japan) i 48 timer. Kort beskrevet knockdown blev udført under anvendelse Trans IT-TKO (Mirus Bio Corporation, Madison, WI, USA) ved en koncentration på 3% i 10 minutter ved stuetemperatur. Passende koncentrationer af siRNA’er for hver cellelinje blev blandet med Trans IT-TKO løsninger efterfulgt af en 20 minutters inkubation ved stuetemperatur. De siRNA anvendte koncentrationer var som følger: 100 nM p65 siRNA for MKN45, og MKN74 celler, og 150 nM for GSS og Kato-III celler; og 100 nM p53 siRNA for MKN45, og GSS celler, og 50 nM for MKN74 celler. Efter 48 timer blev cellerne høstet og proteinniveauer blev undersøgt ved Western blot. To siRNA konstruktioner besidder forskellige sekvenser til samme target-genet blev anvendt til hvert gen at bekræfte knockdown specificitet. Cellecyklusfordeling blev vurderet ved hjælp af Tali Image-baserede cytometer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). For at se den maksimale effekt af siRNA på 5-FU respons, blev stoffet tilsat 48 timer efter siRNA blev transficeret, og den respektive celle cyklus blev målt efter 24 timers inkubation med 5-FU. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange.

TP53 status og Codon72 Variant

DNA blev ekstraheret fra gastriske cancer cellelinjer under anvendelse Qiamp DNA Mini Kit (Qiagen Japan, Tokyo, Japan). PCR-amplifikation for

p53

exon4 codon72 variant (tabel S1) og

p53

exon5-9 mutation blev udført som tidligere beskrevet [15], [16]. Hvert PCR-produkt blev sekventeret ved anvendelse af ABI PRISM 3030xl genetisk analysator (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ifølge producentens protokol. Sekventeringsresultaterne blev analyseret ved anvendelse FinchTV (PerkinElmer Japan, Tokyo, Japan) og MEGA 5.1 Beta 3 [17].

Vækstsuppression Assay

Ti tusind celler per brønd blev podet i en 96-brønds mikroplade. Fireogtyve timer senere blev celler behandlet med 5-FU i 24 timer. Efter 5-FU behandling blev den del af levende celler målt ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan) og en TriStar LB 941 mikropladelæser (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland). Halvtreds procent vækstinhibering fusion (GI

50) blev beregnet ved anvendelse Prism software (Graph Pad Software, La Jolla, CA, USA). GI

50 værdier blev anvendt til at bestemme sammenhænge mellem 5-FU effekt- og protein niveauer baseret på Pearsons produkt-moment korrelationskoefficient (

r

).

Resultater

Fluorouracil inducerer NF-KB

for at bekræfte typiske NF-KB-adfærd som reaktion på 5-FU behandling, vi spores subcellulære lokalisering af NF-KB i MKN45 (p53 vildtype), MKN74 (p53 mutant ), GSS (p53 mutant), og Kato-III (p53 homozygot udgår) cellelinier. Western blot-analyse med nukleare og cytoplasmiske fraktioner viste, at 5-FU-induceret NF-KB i begge rum i MKN45 men blev ikke observeret i p53 mutante cellelinier (fig. 1A-D). Vi undersøgte også virkningen af ​​5-FU på NF-KB lokalisering i cellerne ved immuncytokemi (fig. 1 E-H). NF-KB lokaliseret til cytoplasmaet i ubehandlet MKN45, mens 5-FU-behandling forårsagede en stigning i NF-KB kernelokalisering (figur 1E.); blev imidlertid ingen stigning observeret i p53 mutante cellelinier (fig. 1F-H). Vi har også observeret en drastisk stigning i phosphoryleret NF-KB (p65 Ser536) i kernen af ​​MKN45 behandlet med 5-FU, hvilket indikerer NF-KB blev transaktiveres af 5-FU (fig. 1E). Konstitutiv kernelokalisering og lejlighedsvis phosphorylering af p53 blev observeret i MKN74 men synes ikke at blive induceret af 5-FU (fig. 1G). Kernelokalisering af p53 blev induceret ved 5-FU i GSS, men det aktiverede signal var svag (fig. 1H).

A-D, Western blot-analyse af induktionen af ​​NF-KB i kernen og cytoplasma med 50 uM af 5-FU i 4 timer for de angivne cellelinjer. PCNA og α-tubulin blev anvendt som det nukleare og cytoplasmatiske kontrol indlæsning hhv. E-H, Immuncytokemi af p65 og p53 induktion og lokalisering af 5-FU behandling for de angivne cellelinjer. p65 (rød), fosfor-p65 (Ser536, rød), p53 (grøn), phospho-p53 (Ser15, rød), og DAPI (blå) farvning af kernen uden (kontrol) og med 5-FU-behandling. I, Genekspression med kvantitativ real-time RT-PCR i et tidsforløb for 5-FU behandling. Tigar, PUMA, CDKN1A, og BTG2 blev identificeret som 5-FU inducerede gener. De kvantitative værdier var i forhold til p-actin-ekspression.

p53 Mål induceres ved 5-FU behandling

Siden NF-KB er en transkriptionsfaktor (TF), dens kernelokalisering på 5-FU behandling tyder stærkt transaktivering. Vi identificerede de øverste 7 transkripter blandt mere end 60.000, der blev induceret efter 4 timer af 5-FU behandling i MKN45 vha genekspressionsprofilering (tabel 1). Interessant, fem af de 7 transkripter, nemlig

BBC3

(der koder p53 opreguleret modulator af apoptose, PUMA),

BTG2, C12orf5

(der koder sandsynlige fructose-2,6-bisphosphatase Tigar),

CDKN1A, og GPR87

, er kendt p53 mål [18] – [22]. Tilstedeværelsen af ​​promoter- bindingssteder blev forudsagt ved scanning promotorsekvenser med konsensus sekvenserne af NF-KB og p53 ved hjælp Jaspar algoritme (tabel 1) [23].

Vi fandt at p53 niveauer blev induceret i kernen svarer til dem i NF-KB som reaktion på 5-FU-behandling (fig. 1E). Behandling af 5-FU steg også niveauet af p53 phosphorylering på Ser15, tyder på transaktivering (fig. 1E, ref. [24]). Faktisk er størstedelen af ​​den samlede p53 induceret af 5-FU syntes at være phosphoryleret. Vi observerede også en tidsafhængig induktion af gener, herunder

C12orf5 (Tigar)

,

BBC3 (PUMA)

,

CDKN1A (p21)

, og

BTG2

med 5-FU anvendelse af RT-PCR (fig. 1I). Tilsammen disse resultater tyder på, at det cellulære respons på 5-FU behandling kan involvere både NF-KB og p53 for transkriptionel aktivering i denne sammenhæng, i MKN45.

RELA Knockdown har en større effekt på p53 targetproteiner end TP53 Gene Knockdown

at evaluere den regulatoriske virkning af NF-KB og p53 i respons til 5-FU behandling, vi analyserede proteinniveauer af p65, p53, samt kendte p53-mål, p21, Tigar, og PUMA, ved western blotting efter

RELA

TP53

knockdown i MKN45, MKN74, GSS, og Kato-III.

RELA

knockdown forårsagede et markant fald i p53-niveauer i alle cellelinjer. Som forventet niveauerne af p21, Tigar, og PUMA blev også faldet (fig. 2A). Omvendt mens

TP53

knockdown faldt p53 niveauer, det ikke påvirkede p65 niveauer. Som forventet blev niveauerne af p53 målproteiner faldt med

TP53

knockdown; Men denne reduktion var mindre end reduktionen forårsaget af

RELA

knockdown (Fig. 2B). I cellecyklus-analyse viste MKN74, GSS, og Kato III-cellelinjer en lille stigning i S eller G2 fraktion fase henviser MKN45 udviste en stigning i G1 fraktion efter 24 h udsættelse for 5-FU i p65 og p53 knockdown ligner de tilsvarende forvrænger (fig. 2C). Disse resultater kan indikere robustheden af ​​det cellulære stress respons maskiner, der fastholder cellecyklusfordeling trods knockdown af p65 og p53.

A, Western blot analyse af

RELA

knockdown i fire gastrisk kræft cellelinier. Ud over p53 og p65 proteiner, p53-mål, herunder p21, Tigar, og PUMA, blev evalueret. Actin blev anvendt som en loading kontrol. Resultater fra celler inkuberet med RELA siRNA (siRNA) og uden mål-siRNA (kontrol) er vist. B, Western blot-analyse af

TP53

knockdown i tre gastriske cancercellelinier. p53 allel af Kato-III homozygot slettet så TP53 knockdown ikke blev udført. C, Drug-induceret cellecyklus analyse. Den vandrette akse, styrken af ​​propidium iod (PI), og den lodrette akse angiver celletal for hver cellelinje.

TP53 Codon72 Pro Variant udviser lav 5-FU Sensitivity og High NF-KB niveauer

Gene knockdown eksperimentelle resultater viste, at interaktionen mellem NF-KB og p53-proteinerne kan være vigtigt i forbindelse med 5-FU-behandling. For at undersøge den mulighed, at

TP53

codon72 variant kan påvirke cellulære responser til 5-FU behandling, vi sekventeret

TP53

codon72 samt mutationer i det DNA-bindende domæne kodende regioner (dvs. exoner 5-8) af 9 gastriske cancercellelinier (tabel 2). Status for codon72 variation og

TP53

mutation ikke demonstrere klare associationer.

Vi næste undersøgt sammenhængen mellem 5-FU følsomhed og

TP53

status ( fig. 3A) samt de endogene niveauer af NF-KB og p53 (fig. 3B). GSS, GCIY, og MKN45 linjer, som besidder Pro homozygot variant, udstillet lav følsomhed over for 5-FU, mens KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, og IWT1 linjer besidder Arg allel udviste relativ høj følsomhed. Kato-III, der har en stor

TP53

deletion [25], var den mest følsomme over for 5-FU. NF-KB protein niveauer blev især korreleret med 5-FU følsomhed (

r

= 0,68;

s

= 0,04;. Figur 3C); men der var ingen klar sammenhæng mellem p53 niveauer og 5-FU følsomhed (

r

= -0,04;

s

= 0,95;. figur 3D). Disse resultater antyder, at Pro homozygoti er forbundet med 5-FU modstand, mens hverken p53 mutation eller endogene p53-niveauer påvirker direkte 5-FU følsomhed.

A, Growth suppression assay i 5-FU behandling i gastrisk cancercellelinie linjer. Vandrette akser viser GI

50 værdi af 5-FU. B, endogent protein niveauer af NF-KB, p53, og actin ved Western blot i gastriske cancercellelinier. Actin anvendes som lastning kontrol. C, spredningsdiagram af fordelingen af ​​proteinniveauer af NF-KB i forhold til actin og GI

50 5-FU i hver cellelinie. D, spredningsdiagram af fordelingen af ​​p53 proteinniveauer og GI

50 5-FU i hver cellelinie. Pearsons produkt-moment korrelationskoefficient (

r

) samt

s Drømmeholdet værdi er angivet i hver punktdiagram.

Diskussion

Vi har tidligere identificeret NF-KB som en potentiel forudsigelse markør for postoperativ 5-FU-baseret kemosensitivitet til avanceret gastrisk cancer [9]. NF-KB er en inducerbar transkriptionsfaktor omfatter p65 (RelA), c-Rel, Rel-B, p50 /NF-κB1, og p52 /NF-κB2 [26], og spiller en central rolle i immunresponser og inflammatoriske cytokin regulering [27] – [29]. Chang et al tidligere vist, at NF-KB induceret op eller nedregulering af differentielt udtrykte gener i 5-FU-induceret intestinal mucositis ved at inducere proinflammatoriske cytokiner, såsom IL-6, TNF-α og IL-1β [10]. Disse 5-FU-inducerede inflammatoriske reaktioner er blevet anset for at være en del af stress-undgå processer, der kan føre til desensibilisering af 5-FU effekt i maveslimhinden [30]. Selv om det er blevet foreslået at aktivering af NF-KB ikke er direkte forbundet med tumorudvikling og progression [31], har NF-KB blevet betragtet som en vigtig biomarkør og terapeutisk mål [32]. Den direkte tegn på reduceret kemoresistens til 5-FU af siRNA for

RELA

sammen med den høje diskriminerende effekt af NF-KB nukleare farvning i terapeutiske resultater af kirurgisk fjernede væv fik os til at udføre yderligere validering af NF-KB fra et biologisk synspunkt.

Vores transskriptionsprofilering resultater viste, at adskillige p53 downstream gener var opreguleret i respons til 5-FU, hvori transaktivering af NF-KB også forekommet. Disse to store transskriptionsfaktorer har tidligere vist sig at være co-regulerede som reaktion på genotoksiske midler [33] – [35] og TNF-α [36], [37]. Desuden er det blevet foreslået, at samtidig aktivering af p53 og NF-KB i tumorer behandlet med genotoksiske midler kan føre til terapeutisk svigt som følge af NF-KB-medieret overlevelse signalering [38].

Individuel knockdown af disse transkriptionsfaktorer afsløret gener nedstrøms for p53 påvirket af p65 knockdown, mens effekten var begrænset af p53 knockdown. Tidligere rapporter har foreslået et godt samarbejde mellem p53 og NF-KB i forbindelse med autofagi, apoptose, og S-fase checkpoint aktivering [34], [39] – [41]. Vores resultater viste også, at NF-KB kan kompensere for den transkriptionelle aktivitet af p53, når den intakte funktion er tabt i respons til 5-FU behandling. Faktisk et flertal af gastriske cancere bærer mutationer i p53 DNA-bindende domæne, hvilket gør det transkriptionelt inaktive [42]. En nylig undersøgelse af Frank

et al

. rapporterede, at codon72 polymorfi af

TP53

væsentlig grad påvirker af p53 til at samarbejde med NF-KB til gen-transaktivering, især ved induktion af apoptose gennem caspase 4/11 [40]. Sammen med den foreliggende fund, at nogle transkriptionsaktivitet af p53 kræver NF-KB som reaktion på 5-FU, p53 codon 72 polymorfi for sin NF-KB binding kan være mere indflydelse end mutations status

TP53

eller protein ekspression status af p53

virkningen af ​​codon72 polymorfi på spontan kræftrisiko er tidligere blevet undersøgt, men ikke endeligt fastlagt på grund af begrænsede menneskelige befolkning og dyremodeller [40], [43] -. [45]. Kan dog codon72 polymorfi spille en rolle i at opretholde etablerede kræftceller end udløse cellulær malign transformation. Faktisk har tidligere undersøgelser rapporteret, at Pro /Pro allel er associeret med resistens over for kemoterapi og dårlig prognose i mundhulen [46] samt kolorektal [47], bryst [48] og gastrisk [49] cancere og neuroblastomer [ ,,,0],43]. En række

in vitro Salg undersøgelser støtter også denne hypotese viser, at Arg-allelen er en mere potent apoptoseinducer end Pro allel [40], [50], [51]. Apoptose er en af ​​de store mekanismer fremkaldt af 5-FU og dermed er det rimeligt at hypotesen, at effektiviteten af ​​5-FU-baseret kemoterapi er forbundet med specifikke p53 polymorfier [49]. Vores

in vitro

resultater støtter disse epidemiologiske og eksperimentelle data og foreslå en mulig mekanisme for 5-FU-medieret p53-NF-KB samspil på p53-codon72 bindingssted.

Som forventet vores undersøgelse viste, at cellelinier med Pro allel var mere resistente over for 5-FU end dem med Arg-allelen. Væksten undertrykkelse profil 9 gastriske cancercellelinier viste en god korrelation til NF-KB-proteinniveauer. Disse resultater antyder, at Arg /Arg-genotypen har en stærkere induktion af apoptose end Pro /Pro genotype i nærvær af 5-FU. Blandt de cellelinier (alle stammer fra japanske mavecancerpatienter), forholdet mellem Arg /Arg: Arg /Pro: Pro /Pro var 04:01:03, mens der hos sunde japanske patienter var 4.5:4.4:1 [52] . Dette kan afspejle en udvælgelsesproces, der opstår under tumor udvikling og etablering som en cellelinie. Forrige meta-analyser i kræftrisiko og p53-codon72 polymorfier tyder på, at Pro /Pro genotype har en højere kræftrisiko (lavere for Arg /Arg genotype) i asiatiske befolkningsgrupper [45], [53]. betydningen af ​​”cancer risiko” for kræft malignitet eller behandlingsrespons dog stadig ikke klarlagt, da det generelt er vanskeligt at gennemføre en klinisk undersøgelse domineret af genetiske polymorfismer og vurdere de sande genetiske virkninger af behandlingen. Til dato har de fleste rapporter, der beskriver en sammenhæng mellem p53 codon72 polymorfi og kemoterapeutiske svar viste, at Arg /Arg genotypen har en gunstig reaktion på en lang række kræftformer behandles med konventionelle genotoksiske lægemidler [49], [54], [55] . Vi foreslår en formodet mekanisme for effekt af 5-FU via NF-KB og p53-protein binding forbundet med p53 polymorfi, og dermed en kombinatorisk diagnose af NF-KB proteinekspression og codon72 kan være en nyttig indikator for postoperativ adjuverende kemoterapi. Bortset fra et par skala datasæt [52], store [56], omfanget af demografiske og etniske fordelinger af polymorfi fortsat uklart. Akkumulerende data om etniske forskelle for polymorfi kan forklare forskellene i kræftrisiko eller kemoterapeutiske svarprocent i patientpopulation.

Sammenfattende vores resultater viser, at NF-KB regulerer p53 transkriptionel aktivitet som reaktion på 5-FU, der kan være forbundet med en polymorfe sted af p53 på codon72. Yderligere kliniske og epidemiologiske undersøgelser bør vurdere nytten af ​​samtidig patologisk /genetisk evaluering af NF-KB /p53-codon72 i kirurgisk fjernede mavekræft prøver for at forudsige effekten af ​​postoperativ 5-FU adjuverende kemoterapi.

Støtte oplysninger

tabel S1.

primersekvenserne

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090155.s001

(DOCX)