PLoS ONE: N-Cadherin Dependent Kollektiv Cell Invasion af prostatacancerceller reguleres af N-terminalen af ​​α-Catenin

Abstrakt

Kræft celle invasion er den kritiske første trin i metastase, endnu, lidt er viden om, hvordan kræftceller invadere og initiere metastase i en kompleks ekstracellulære matrix. Anvendelse af en cellelinje fra knoglemetastaser af prostatacancer (PC3), analyserede vi hvordan prostatacancerceller migrerer i en fysiologisk relevant 3D Matrigel. Vi fandt, at PC3 celler migrerede mere effektivt som flercellede klynger end isolerede enkeltceller, hvilket antyder, at tilstedeværelsen af ​​celle-celle-adhæsion forbedrer 3D cellemigrering. Forstyrrelse af N-cadherin funktion ved transfektion af enten den N-cadherin cytoplasmiske domæne eller shRNA specifikt for N-cadherin afskaffet kollektiv cellemigration. Interessant nok PC3 celler ikke udtrykke α-catenin, et actinbindende protein i cadherin-komplekset. Når fuld længde α-catenin blev genindført, fænotypen af ​​PC3-celler vendt tilbage til en mere epitel fænotype med en nedsat cellemigrering sats i 3D Matrigel. Interessant fandt vi, at den N-terminale halvdel af α-catenin var tilstrækkelig til at undertrykke invasiv fænotype. Taget sammen antyder disse data, at dannelsen af ​​N-cadherin kryds fremmer 3D cellevandring af prostatacancerceller, og dette skyldes dels en afvigende regulering af N-cadherin kompleks i fravær af α-catenin.

Henvisning: Cui Y, Yamada S (2013) N-Cadherin Dependent Kollektiv Cell invasion af prostatacancerceller reguleres af N-terminalen af ​​α-Catenin. PLoS ONE 8 (1): e55069. doi: 10,1371 /journal.pone.0055069

Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan

Modtaget: 12. oktober 2012; Accepteret: December 24, 2012; Udgivet: januar 24, 2013 |

Copyright: © 2013 Cui, Yamada. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Beckman Young Investigator Award, en Hellman Family New Faculty Award, en NIH EUREKA GM094798, og midlerne fra University of California Cancer Research koordinationsudvalg. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cancercelleinvasion er den kritiske første trin i metastase og den fænotypiske overgang fra godartet tumor til invasiv cancer kræver ændringer i genekspressionsprofilen. For epitel-afledte cancere, er denne epitel-til-mesenkymale overgang initieret af transkriptionsfaktorer, som nedregulerer tumorsuppressorer og opregulere onkogener, og menes at regulere cancermetastase [1]. De vigtigste epitel og mesenchymale markører, der definerer de respektive fænotyper er epitel (E) og neuronale (N) cadheriner, og dette cadherin switch ofte falder sammen med overgangen fra godartede til aggressive kræftformer [2].

I diverse kræft celler, den abnorme ekspression af N-cadherin korrelerer med induktion af cellemotilitet. For eksempel ekspressionen af ​​N-cadherin inducerer cellemigrering i brystcancerceller [3] – [7], melanom [8], prostatacancer [9], gastrisk cancer [10] og pladecarcinom [11]. Interessant overekspression af N-cadherin forbedrer cellemotilitet og invasion uden at reducere E-cadherin-niveauer [4], hvilket tyder på, at øget cellemotilitet skyldes ekspressionen af ​​N-cadherin snarere end en mangel på E-cadherin. Derfor er den stramme regulering af N-cadherin ekspression er afgørende for normal epitelial cellefunktion. I overensstemmelse med dette begreb, reguleringen af ​​N-cadherin af microRNA-145 har vist sig at undertrykke invasionen og metastase i gastrisk cancer [10].

Mens den kanoniske funktion af N-cadherin er at etablere celle-celle adhæsion, nærvær af N-cadherin inducerer også pro-vandrende signalering. Det ekstracellulære domæne af N-cadherin interagerer med FGF-receptor 1 [12], og denne interaktion minimerer receptorinternalisering, dermed forlænge MAPK-ERK-aktivering [5], [6]. Endvidere N-cadherin-induceret cellemigration er afhængig reduceret Akt3 niveau og aktivering i brystcancerceller [7]. I modsætning hertil rolle N-cadherin-medieret celle-celle-adhæsion i cancer cellemigrering er uklar. Hvis N-cadherin vejkryds fungerer på samme måde som e-cadherin vejkryds ved at stabilisere celle-celle-interaktioner og forhindrer celle migration (kontakt hæmning), derefter N-cadherin vejkryds ville hindre kræft celle migration. Derfor vil sådanne cellulære vejkryds være kontraproduktivt at N-cadherin induceret pro-migrerende signaler.

Brug prostatakræft-cellelinier som et modelsystem, vi søgte at analysere, hvordan N-cadherin regulerer kræftcelle invasion. I prostatacancer, er N-cadherin ekspression opreguleres og E-cadherin ekspression nedreguleres [13], [14]. En lignende cadherin switch er også forbundet med klinisk tilbagefald [15], og blev identificeret i metastatiske læsioner [16]. Endvidere N-cadherin-niveauer steg i kastrationsresistent tumorer hos patienter med etablerede metastaser [17]. Desuden blev der observeret forhøjede niveauer af N-cadherin højkvalitets prostatatumorer sammenlignet med lav kvalitet tumorer [18]. Behandling med en N-cadherin-specifikt monoklonalt antistof reduceret proliferation, adhæsion og invasion af prostata kræftceller

in vitro

, og bremset væksten af ​​flere etablerede xenotransplantater, blokerede lokal invasion og metastase, og ved højere doser, førte at fuldføre regression [9]. Tilsammen disse undersøgelser fremhæver forholdet mellem N-cadherinekspression og prostatakræft progression, men den specifikke rolle N-cadherin vejkryds under cancercelleinvasion er ukendt.

Tidligere undersøgelser fokuseret på kræft celle migration på en todimensionale (2D) substrat, mens lidt om hvordan prostatacancerceller migrerer i en mere fysiologisk relevant tredimensionale (3D) matrix. Brug af time-lapse mikroskopi, fandt vi, at i 3D Matrigel, prostatacancer (PC3) celler migrerer i multicellulære klynger, og denne kollektive cellevandring af PC3-celler forstærkes i nærvær af celle-celle-adhæsion. Prostata kræftceller over-udtrykker N-cadherin cytoplasmatisk domæne eller N-cadherin knockdown celler ikke migrere i en 3D-matrix. Som PC3-celler mangler endogen α-catenin, re-ekspression af α-catenin fremmet en epitelial fænotype i en 3D matrix. Taget sammen antyder disse resultater, at N-cadherin junctions fremmer 3D kollektiv cellevandring af prostatacancerceller delvis som følge af fraværet af α-catenin.

Resultater Salg

Collective cellemigration er en unik ejendom PC3-celler i 3D matrix

i modsætning til de stive 2D dækglas ofte anvendes til at studere kræft cellemigration, 3D Matrigel giver en blød matrix, som bedre efterligner tumormikromiljøet. Vi sammenlignede den vandrende fænotype af prostata cancer cellelinjer (PC3, 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 og RWPE-2) i 3D matrix. Kun PC3 celler invaderede omgivende matrix effektivt, mens 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 og RWPE-2 celler forblev rundt og dannede sfæriske celleklynger uden tydelige membran extensions (figur 1A). Interessant nok i 3D-matrix, PC3 celler migreret kun ved kontakt med naboceller (figur 1A, hvide pilespidser peger på en enkelt ikke-migrerende celler). Desuden PC3-celler var stærkt vandrende på overfladen af ​​Matrigelcoatede dækglas (figur 1B, Movie S1), men havde cellerne ikke opretholde celle-celle-kontakter på 2D overfladen og migrerende celler passeret hinanden uden at danne stabile celle- celle sammenvoksninger (figur 1B).

(A) Morfologi af prostatakræft-cellelinier i 3D Matrigel. PC3 celler danner multi-cellulære invasiv klynge men 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 og RWPE-2 celler danner flercellede sfæroider og er ikke invasive. Pilespidser indikerer enkelt, ikke-migrerende PC3 celler. Højre panel viser immunoblots for N-cadherin (Ncad), E-cadherin (ECAD), α-catenin (α-cat) og tubulin (Tub) af prostatakræft-cellelinier. (B) Cell migration på 2D overflade. Rød stjerne og sort pil separat markere og spore to tilstødende celler passerer hinanden uden at danne og opretholde celle-celle kontakt. Tid i minutter. (C) Time-lapse billeder af kollektiv celle migration af PC3 celler i 3D Matrigel. Tid i timer. (D) Repræsentative baner (til venstre), gennemsnitlig hastighed (midten) og end-to-end forskydning (højre) af enkelte celler (N = 33) og flercellede klynger (N = 43) i 3D Matrigel (**, p 0,01 ). (E) EDTA tilsætning afbryder celle-celle interaktioner. EDTA blev tilsat i en slutkoncentration på 1,4 mM. Tid i minutter. (F) Immunfarvning for N-cadherin i PC3-celler podet i 3D Matrigel. N-cadherin (klon 6G11) co-lokaliseres med actin (phalloidin) ved celle-celle-kontakter. Pilen angiver celle-celle-kontakt. Alle skala søjler er 10 um.

I 3D Matrigel, aflange PC3 celleklynger migreret i en vedvarende retning (figur 1C, D, Film S2), mens enkelte celler migreret tilfældigt med en lavere gennemsnitlig hastighed og netto forskydning end de enkelte celler i celleklynger (figur 1D). Disse data antyder, at kollektiv cellemigration af PC3-celler er unikke for migrerende celler i 3D Matrigel, og tilstedeværelsen af ​​celle-celle-interaktioner kan fremme effektiv cellevandring (celle hastighed og persistens) i 3D Matrigel.

Cadheriner er potentielle regulatorer af kollektiv celle migration

Da mange celle-celleadhæsionsproteiner er calcium-afhængig, vi analyserede kollektiv celle migration i 3D Matrigel under lave calcium. Ved chelaterende calcium med EDTA, PC3-celler i aflange klynger adskilles fra naboceller i løbet af 30 minutter (figur 1E, Film S3). Dette antyder, at calcium-afhængige adhæsionsproteiner (fx cadheriner) sandsynligvis ansvarlig for PC3 celle-celle interaktioner. Interessant, PC3-celler udtrykte højere N-cadherin og lavere E-cadherin-niveauer sammenlignet med de 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 og RWPE-2 prostata cancercellelinier (figur 1A). Desuden kun PC3 celler invaderede 3D matrix mens de øvrige prostatakræft-cellelinier ikke gjorde (figur 1A). I 3D Matrigel, N-cadherin lokaliseret til celle-celle-kontakter i PC3-celler (figur 1F), hvilket antyder, at N-cadherin medierer celle-celle interaktioner i 3D matrix.

immunmærkning af N og E-cadherin afsløret at de fleste PC3 celler blev N-cadherin positive (figur 2A), men en meget få PC3 celler blev E-cadherin positive (figur 2A). Interessant observerede vi, at, mens størstedelen af ​​PC3-celler kollektivt migreret i 3D Matrigel, et par celler forblev i sfæriske celleklynger. Vi mistanke om, at ikke-migrerende PC3 celler kan udtrykke E-cadherin. For præcist at vurdere den rolle, både cadheriner i 3D cellemigration blev PC3 celler subklonet at isolere E-cadherin udtrykker PC3 celler. Af enogtyve PC3 subkloner genereret, fleste subkloner havde mindst samme niveau for N-cadherin til de parentale celler (se figur S1). To sub-kloner blev valgt (PC3E og PC3n) for deres karakteristiske cadherin udtryk. PC3E havde en højere E-cadherin ekspression niveau end både den parentale PC3 og PC3n, mens PC3n havde en højere ekspressionsniveau af N-cadherin (figur 2B, C, S1). E og N cadherin proteiner lokaliseret til celle-celle-kontakter i PC3E og PC3n kloner (figur 2c). Desuden cadherinekspression analyse viste, at forældrenes og PC3n klon udtrykte også en høj grad af cadherin 11, mens PC3E primært udtrykte E og P-cadherin (Figur 2E). I 3D Matrigel, gjorde PC3E celler ikke migrere og forblev som sfæriske klynger (figur 2D, Film S4). I modsætning hertil PC3n havde en langstrakt morfologi og migrerede i en vedvarende retning på samme måde som de parentale PC3 celler (figur 2D, Film S5). Disse data antyder, at ekspressionsniveauerne af E /P og N /11-cadheriner svarer til den sfæriske og aflange fænotype i 3D matrix henholdsvis.

(A) immunfarvning af N-cadherin med phalloidin (øverste panel) og E-cadherin med phalloidin (nederste panel) af forældrenes PC3 celler belagt på dækglas. (B) To repræsentative subkloner fra forældrenes PC3 celler, PC3E og PC3n blev immunoblottedes for E-cadherin og N-cadherin. Tubulin er vist som en loading kontrol. De oprindelige blots er vist i supplerende Figur S1. (C) immunofarvning af PC3 subkloner for E-cadherin og N-cadherin (klon 32). (D) Cell morfologier, cell hastighed og retningsbestemt persistens- af PC3E (N = 19) og PC3n (N = 20) kloner i 3D Matrigel (**, P 0,01, N = 42 for forældrenes celler og N = 11 for N-cyto celler). Fejlsøjler er standard på middelværdien. Scale bar, 40 um.

I stedet for en løst organiseret og elongatged morfologi på en 2D overflade, N-cyto udtrykkende celler havde strammere celle-celle kontakt end forældrenes celler. Immunfarvning for det ekstracellulære domæne af N-cadherin detekteret lave niveauer af endogen N-cadherin, som ikke blev lokaliseret ved celle-celle-kontakter (figur 3D). I 3D Matrigel, både N-cyto # 1 og # 4 celler dannede sfæriske klynger og var ikke invasive (figur 3E, Film S6). Selv om disse to N-cyto udtrykkende kloner havde samme ikke-invasiv fænotype i 3D Matrigel, har de distinkte cadherin 11 niveauer, hvilket antyder, at cadherin 11 ekspression er uafhængig af PC3 cellemigrering fænotype og adfærd i 3D Matrigel.

Silencing N-cadherin afskaffer celle migration i 3D Matrigel

for yderligere at bestemme, om N-cadherin er den primære regulator af 3D celle migration, vi stabilt tavshed N-cadherin i PC3 celler. Af tre N-cadherin specifikke shRNA testede sekvenser og 44 transfekterede kloner analyseret, er to kloner med 50% (KD1) og 99% reduktion (KD2) af endogen N-cadherin vist. Kontrolgruppen med tilsvarende scrambled sekvenser (sCR1, SCR2) viste lignende N-cadherin niveauer af forældrenes PC3-celler (figur 4A, B). Resterende endogen N-cadherin blev observeret i KD1 celler, men ikke i KD2 celler (figur 4B). Endvidere har inaktivering af N-cadherin ikke ændre E-cadherin og cadherin 11 niveauer i KD1 og KD2 celler (figur 4A).

(A) Immunoblots for N-cadherin, E-cadherin og cadherin 11 i N -cadherin knockdown celler og celler transficeret med scrambled sekvenser. Tubulin er vist som en loading kontrol. KD1, KD2 er to knockdown kloner. SCR1, SCR2 er to kloner transficeret med tilsvarende scrambled sekvenser. (B) immunfarvning af N-cadherin i kontrolceller (øverste felt) og knockdown-celler (nederste panel). (C) Cell aggregatdannelse af knockdown-celler og kontrolceller løbet af 3 timer i suspension. Ved time 0, 1, 2, 3 i suspension, antallet af celleaggregater analyserede var 144, 101, 133, 62 for parentale PC3-celler, 147, 117, 107, 81 for KD1 celler, 142, 121, 107, 73 for KD2 celler, 146, 115, 87, 88 for sCR1-celler, 131, 147, 107, 68 for SCR2 celler. (D) 3D cellevandring analyser af parental (N = 17), scramble shRNA (N = 17 for sCR1, N = 20 for SCR2) og knockdown-celler (N = 37 for KD1, N = 33 for KD2). Statistisk analyse af gennemsnitshastigheden vises (**, P 0,01). Alle fejl barer er standard på middelværdien. Alle skala søjler er 20 um.

Trods det lavere niveau af N-cadherin, knockdown-celler stadig dannede celleaggregater samme størrelse som parentale PC3 celler i suspension (figur 4C), hvilket antyder, at tilstedeværelsen af andre cadheriner, f.eks cadherin 11, kan være tilstrækkelig til kontakt celle-celle-dannelse. Men i 3D Matrigel, det delvist knockdown (KD1) celler aflange lighed med de parentale celler, men dannede meget løsere celleklynger (figur 4D). De komplette Knockdown (KD2) celler forblev rundt med minimale membran udvidelser i 3D Matrigel (figur 4D). I modsætning til de forældre eller krypterede shRNA transfekterede celler, har disse celler ikke udvikle store aflange celleklynger (figur 4D).

I 3D Matrigel, begge Knockdown cellelinier ikke migrere så hurtigt som den forældre- eller krypteret shRNA transficeret celler. Mens KD1 celler migrerede med en reduktion i hastighed 50%, KD2 celler var næsten immobil (figur 4D, Film S7). Disse data tyder på, at i 3D Matrigel, N-cadherin regulerer både det aflange morfologi og udvikling af celleklynger, foruden cellemigrering.

Ekspression af α-catenin vender tilbage PC3 celler til normal epitelial fænotype

Cadheriner spiller en kritisk rolle for opbygningen og fastholde stærke celle-celle sammenvoksninger og kræver støtte fra det underliggende actincytoskelettet at opretholde celle-celle-kontakter. Et centralt medlem af cadherin-komplekset, α-catenin, indeholder en actin-bindende domæne i den C-terminale ende. Interessant modsætning 22Rv1 eller LNCaP-celler, PC3-celler udtrykker ikke α-catenin (figur 1A, 5A). For at forstå, hvordan α-catenin ekspression påvirker N-cadherin afhængig kollektiv cellemigration, vi stabilt transficeret GFP-mærkede α-catenin i PC3-celler (figur 5A, B). De GFP- α-catenin udtrykkende celler havde en mindre stigning i N-cadherin niveau og et mindre fald i E-cadherin niveau sammenlignet med de parentale celler (figur 5A). Interessant nok α-catenin udtrykkende celler dannede strammere celle-celle-kontakter i mere kompakte celleklynger i forhold til de løst organiserede, aflange parentale celler på 2D overflade (figur 5B). Derudover GFP tagged α-catenin lokaliseret til celle-celle-kontakter (figur 5B), og co-lokaliseret med N-cadherin (figur 5C).

(A) Immunoblots for α-catenin, N-cadherin og E-cadherin i α-catenin udtrykkende celler. Tubulin er vist som en loading kontrol. LNCaP blev anvendt som en positiv kontrol for α-catenin og E-cadherin. (B) Lokalisering af α-catenin i parentale PC3-celler og GFP-mærket α-catenin udtrykkende celler i bundpanelerne. (C) Co-lokalisering af GFP-mærkede α-catenin med N-cadherin. (D) Cell sammenlægning analyse af forældrenes og α-catenin udtrykker celler i suspension. Indsat: forstørrede billeder af celleklynger. GFP signal overlejret på lysfeltsbillede for GFP-mærkede α catenin udtrykkende celler. Gennemsnitlige sammenlægning størrelser på hver tidspunkter er vist i søjlediagrammet. (E) Cell migration analyser i 3D Matrigel. GFP kanal af GFP-mærkede α-catenin udtrykkende celler i det hvide felt (nederste venstre panel) er vist i nederste højre panel. Statistisk analyse af cellemigration hastigheden vises (**, P 0,01, N = 35 for parentale celler, N = 31 for GFP-α-catenin udtrykkende celler). Alle skala barer er 20 um.

I suspension, α-catenin udtrykker celle aggregater var sammenlignelige i størrelse til forældrenes PC3 celler (Figur 5D). Imidlertid celle-celle-kontakter af α-catenin udtrykkende celler var meget strammere uden åbenlyse celle-celle grænser end de løsere parentale PC3 celleaggregater (figur 5D). Komprimering af celleaggregater i α-catenin udtrykkende celler antyder, at N-cadherin-medieret celle-celle-adhæsion sandsynligvis forstærkes af tilstedeværelsen af ​​α-catenin.

På trods af evnen til at danne celle-celle-adhæsion i suspension ( Figur 5D), gjorde α-catenin udtrykker PC3 celler ikke aflang at danne store celleklynger i 3D Matrigel som forældrenes PC3 celler gjorde. Disse celler forblev som enkelte celler eller små enheder med en mere rund morfologi (figur 5E). I 3D Matrigel, α-catenin lokaliseret til celle-celle-kontakter af små celleklynger (figur 5E). I overensstemmelse med denne morfologi, α-catenin-celler var ikke motile i 3D Matrigel (figur 5E, Film S8). Disse resultater tyder på, at α-catenin udtryk styrket N-cadherin medieret celle-celle-adhæsion og forhindrede celle migration i 3D Matrigel, og at nedregulering af α-catenin kan være et vigtigt skridt i prostatakræft metastaser.

den N-terminale halvdel af α-catenin er tilstrækkelig til at undertrykke invasiv fænotype

for at teste rollerne for α-catenin i reguleringen celle-celleadhæsion, vi gradvist trunkeret α-catenin konstrukt (figur 6A) og stabilt transficeret PC3 celler. C-terminalen af ​​α-catenin består af vinculin bindende inhiberende domæne (AA 509-633), og actin-bindende domæne (AA 697-906), som kræver korte C-terminale ende (AA 848-906) for actin binding [ ,,,0],19]. Fuldlængde α-catenin og de trunkerede mutanter var sammenlignelige i deres ekspressionsniveauer (figur 6b, S2), og ekspressionen af ​​de trunkerede mutanter ændrede ikke cadherinekspression profil (figur 6B). Mens alle trunkerede mutanter lokaliseret til stederne for celle-celle-adhæsion (figur 6C), det trunkerede mutante udtrykkende celler dannede løsere celleklynger end det fuldlængde α-catenin udtrykkende celler på en 2D overflade (figur 6C). Interessant, afstumpningsmutanter α-catenin 1-509 og α-catenin 1-848 udtrykkende celler dannet relativt kompakte klynger end a-catenin 1-670 udtrykkende celler på en 2D overflade (figur 6C).

(A ) Skematisk af fuld-længde α-catenin og dens C-terminale trunkerede mutanter. GFP tag, Vinculin binding (Vin), den hæmmende (Inhibit), F-actin-binding (Actin) domæner er vist. (B) Immunoblots for α-catenin, N-cadherin og E-cadherin i forskellige α-catenin udtrykkende celler. Tubulin er vist som en loading kontrol. 22Rv1 blev anvendt som en positiv kontrol for α-catenin og E-cadherin. De oprindelige blots er vist i supplerende Figur S2. (C) Cell morfologi (øverste felt) og lokalisering af α-catenin (bundpanel) i forskellige α-catenin udtrykkende PC3-celler. (D) Cell sammenlægning analyse af forældrenes, forskellige α-catenin udtrykkende celler, og 10 uM cytochalasin D (CD) behandlede celler. Indsat: forstørrede billeder af celleklynger. GFP signal overlejret på lysfeltsbillede for GFP-mærkede α-catenin /trunkering mutante udtrykkende celler. Aggregering størrelse af cellerne på hver tidspunkter er vist i middel ± standardfejl på middelværdien; blev anvendt ANOVA analyse kombineret med posthoc test Tukey HSD mellem grupperne på tidspunkterne timer 3 (**, P 0,01). (E) Cell migrationsanalyser i 3D Matrigel for parental (N = 35), fuld-længde α-catenin (N = 31), α-catenin 1-509 (N = 73), α-catenin 1-670 (N = 39), og α-catenin 1-848 (N = 52) udtrykkende celler. Gennemsnitlig hastighed og endpoint afstand af migration er vist i gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien; ANOVA og posthoc test Tukey HSD blev anvendt (***, P 0,001). Alle skala barer er 20 um.

De morfologiske fænotyper på en 2D overflade var i overensstemmelse med resultaterne af celle sammenlægning analyse i suspension. Mens trunkerede mutant udtrykkende celler dannede celle aggregater sammenlignelig størrelse med den, forældre- og fuld-længde α-catenin udtrykkende celler viste celleaggregater forskellige fænotyper (figur 6D). Svarende til fuld længde α-catenin udtrykkende celler, α-catenin 1-509 udtrykkende celler dannede stram celle-celle-kontakt uden indlysende cellegrænser (figur 6D), hvilket antyder, at N-terminalen af ​​α-catenin er afgørende for denne stram celle-celle-adhæsion. Dette er i overensstemmelse med α-catenin mutant, der mangler den C-terminale ende afgørende for actin binding (1-848) var også i stand til at inducere stramme celleklynger, omend løsere klynger end den fulde længde α-catenin udtrykkende celler (figur 6D ). Bemærk, at actin organisation stadig er nødvendig for dannelsen af ​​celle-celle-adhæsion som cytochalasin behandling elimineret celleaggregering dannelse (figur 6D). Imidlertid overraskende α-catenin 1-670 udtrykkende celler dannede løs celleaggregater svarer til den for parentale celler (figur 6D).

Da α-catenin mutant, der mangler den C-terminale ende essentiel for actinbinding (1-848) former relativt stramme celleklynger (figur 6D), direkte actin bindende ved α-catenin har kun en mindre rolle i reguleringen af ​​celle-celle-adhæsion. Derudover vores data tyder på, at i fravær af actin-bindende domæne (AA 697-906), den vinculin-bindende inhiberende domæne undertrykker evnen til at danne tætte celle-celle kryds, hvilket er i overensstemmelse med den opfattelse, at vinculin kræves til styrkelse af celle-celle-adhæsion [20], [21]. Til støtte for denne model, var minimal vinculin rekruttering observeret langs celle-celle kontakter α-catenin 1-670 udtrykkende celler (figur S3).

På trods af forskellige fænotyper i suspension, alt afkortede mutant udtrykker celler opnået lignende epithelmorfologi med den for fuld længde α-catenin udtrykkende celler i 3D Matrigel (figur 6E). De α-catenin mutant-udtrykkende celler forblev som enkelte celler eller dannede små klynger med minimum membran extensions, og var ikke bevægelige i 3D Matrigel (figur 6E). Mens disse a-catenin mutant-udtrykkende celler har forskellige niveauer af celle-celle sammenvoksninger (figur 6D), ekspressionen af ​​N-terminale halvdel af α-catenin var tilstrækkelig til at minimere celleinvasion i 3D Matrigel, hvilket antyder, at celle invasionsevne bestemmes ved de protein-interaktioner ved N-terminale halvdel af α-catenin (f.eks ß-catenin).

Discussion

Tidligere undersøgelser viste, at N-cadherin inducerer pro-vandrende signalering ved direkte at interagere med FGF receptorer på det ekstracellulære domæne [5], aktiverer MAPK /ERK signalvej [5], [6], og undertrykker Akt3 signalering [7]. Alligevel har den rolle, N-cadherin-medieret celle-celleadhæsion i prostatacancer celleinvasion ikke blevet undersøgt. Vore data tyder på, at tilstedeværelsen af ​​N-cadherin-medieret celle-celle-adhæsion fremmer effektiv cellemigration ved at øge celle hastighed i en vedvarende vandrende bane i 3D Matrigel.

Denne kollektive cellevandring af PC3-celler er en unik migration fænotype kun vist i en 3D matrix. Mens N-cadherin lokaliseret til celle-celle-kontakt af PC3-celler udpladet på en 2D overflade (figur 2A, 3D og 4B), har disse celler ikke opretholde stabile celle-celle-kontakter og migrere som enkelte celler (Figur 1B). Eftersom ekspressionen af ​​vigtige signalmolekyler er forskellige i 2D vs 3D miljø [22], kan sådanne faktorer ændrer celle-celle-adhæsion og migration fænotype. Alternativt kan forskellen i 2D vs 3D celle-celle adhæsion være resultatet af matricen elasticitet. For eksempel, i modsætning til i 3D matrix, to bringe celler bevæger sig i en modsat retning kan ofte mekanisk forstyrre celle-celle-adhæsioner på en 2D overflade. Dette skyldes den stive 2D substrat giver en bedre trækkraft end blød 3D matrix. Den tydelige migration fænotype i 3D matrix antyder, at N-cadherin kryds kan spille en vigtig rolle i prostatacancer celleinvasion

in vivo

.

modsætning E-cadherin-medieret celle-celle sammenvoksninger, der forhindrer cellevandring (kontaktinhibering, se 22Rv1, LNCaP og RWPE i figur 1A), N-cadherin-medieret celle-celle sammenvoksninger fremme kollektiv cellemigration. Et unikt træk ved N-cadherin-adhæsion er at undertrykke tilfældige membran fremspring follower celler, således at kun de leder cellerne kan udvide forkanterne. Denne lokale kontakt hæmning fastholder cellepolaritet med en tydelig forkant for celle migration; derfor sikre vedholdenhed kollektiv celle migration. Cadherin-medieret celle-celle-adhæsion har vist sig at generere polariseret cellemorfologi i i Xenopus mesendoderm celler [23] og transformerede epitelceller i en 3D-matrix [24]. N-cadherin kryds i epitelceller afledt cancerceller tilvejebringe en polarisering cue afgørende for retningsbestemt cellemigrering i en 3D matrix.

Interessant cadherin 11, en type II cadherin, er også opreguleret i det stærkt invasive klon af PC3-celler (PC3n, figur 2E), og kan være ansvarlig for dannelsen af ​​celle-celle sammenvoksninger i N-cadherin deficiente celler (figur 4C). Denne cadherin 11 opregulering antages at fremme cellulære interaktioner mellem cancerceller og cadherin 11 udtrykkende osteoblaster, der er typisk for knoglemetastaser [25] – [27]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at ekspressionen af ​​cadherin 11 shRNA nedsætter celle migration af PC3-celler [26]. Tilstedeværelsen af ​​cadherin 11 alene ikke tilstrækkelig til 3D cellemigrering. For eksempel N-cadherin deficient men cadherin 11 udtrykkende celler ikke vandrende i en 3D matrix (se figur 4). Derfor kan ekspression af både N-cadherin og cadherin 11 eller de potentielle interaktioner mellem disse to distinkte cadheriner være afgørende for prostatakræft cellemigrering.

cadherin switch E-til-N observeret i PC3-celler er almindeligvis observeret i forskellige cancerformer [2]. Ofte kræftceller nedregulere normalt udtrykkes cadheriner (E-cadherin i tilfælde af prostata) og opregulere mesenchymal cadheriner (fx N-cadherin, cadherin 11 osv).