PLoS ONE: A Novel Compound NSC745885 Udøver en anti-tumor effekt på Tongue Cancer SAS Cells in vitro og in Vivo

Abstrakt

Målsætning

Oral pladecellekræft (OSCC) er en udbredt cancer, især i udviklingslandene. Anthracycliner og deres anthraquinonderivater, såsom doxorubicin, udviser en cellevækst inhiberende virkning og er blevet anvendt som anti-cancerlægemidler i mange år. Imidlertid kardiotoksicitet anthracyclinantibiotika er et stort problem i deres kliniske anvendelse. NSC745885 er en ny forbindelse syntetiseret fra 1,2-diaminoanthraquinon, som efterfølgende reagerer med thionylchlorid og triethylamin. Den foreliggende undersøgelse havde til formål at undersøge den anti-oral cancer potentiale og sikkerhed NSC745885.

Metoder

Vi undersøgte anti-cancer potentiale NSC745885 i orale planocellulære karcinom cellelinjer og i en

in vivo

kræft i mundhulen xenograft musemodel. Ekspressionen af ​​apoptotiske beslægtede gener blev evalueret ved real-time RT-PCR og western bloting, og

in vivo

vurdering af apoptotisk markør blev målt ved immunhistokemisk farvning. Den anti-tumor effektivitet og sikkerhed mellem doxorubicin og NSC745885 blev også sammenlignet.

Resultater

Vores resultater viste, at NSC745885 udviser anti-oral cancer-aktivitet gennem induktion af apoptose i cancerceller og i tumor -fyldt mus, og denne behandling inducerede ikke markant toksicitet i eksperimentelle mus. Denne forbindelse udviser også en sammenlignelig anti-tumor effektivitet og en højere sikkerhed i eksperimentel mus sammenlignet med doxorubicin.

Konklusioner

Data fra denne undersøgelse bevis for NSC745885 som en potentiel ny terapeutisk lægemiddel til behandling af human OSCC

Henvisning:. Chen YW, Huang HS, Shieh YS, Ma KH, Huang SH, Hueng DY, et al. (2014) en hidtil ukendt forbindelse NSC745885 udøver en antitumorvirkning på Tongue Cancer SAS celler in vitro og in vivo. PLoS ONE 9 (8): e104703. doi: 10,1371 /journal.pone.0104703

Redaktør: Arianna L. Kim, Columbia University Medical Center, USA

Modtaget: Januar 20, 2014 Accepteret: 16. juli 2014 Udgivet: 15 August, 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af forskningsbevillinger fra National Science Rådet, Taiwan, ROC (NSC101-2320-B-016-016 til G.-J. Lin og NSC102-2314-B-016-018-MY3 at Y.-W. Chen), Tri-service General Hospital, Kina (Grant Ingen . TSGH-C102-019, TSGH-C100-034 og TSGH- C101-009-S06), og dels af CY Foundation for Advancement of Education, Natur- og Sundhedsvidenskabelige. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blandt orale planocellulære karcinomer (OSCCs), den største størstedelen af ​​maligniteter er hoved og hals planocellulært karcinom (HNSCCs). OSCC er den sjette mest udbredte kræft på verdensplan [1], og den tredje mest almindelige kræftform i udviklingslandene [2] – [4]. Traditionelle terapier for OSCC omfatter kirurgi, strålebehandling, og kemoterapi. Men den afhjælpende virkning af sådanne behandlinger på slutstadiet kræft i mundhulen er ensartet dårlig. Derudover efter fuldført tumorresektion kan ca. 20% af patienterne har tilbagefald af tumorer på andre site [5]. Derfor udvikler nye terapeutiske strategier for maligne orale tumorer er et presserende problem.

antracykliner og deres anthraquinonderivater udviser celle væksthæmmende virkninger og er blevet brugt som anti-cancer medicin i mere end 30 år [6]. Daunorubicin og doxorubicin, to anthracyclin antibotics, anvendes ofte til behandling af akut myeloid leukæmi samt diverse faste tumorer [7]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at disse lægemidler inducerer apoptose i tumorceller [8], [9]. De cytostatiske og cytotoksiske virkninger af disse lægemidler er blevet observeret gennem hæmning af topoisomerase II og efterfølgende initiering af DNA-beskadigelse [10]. Oxidativ skade er blevet betragtet som en kritisk mekanisme i anti-tumor aktivitet af anthracyclin [11]. Anthracyclinantibiotika også demonstrere evnen til at reducere telomeraseaktivitet og hTERT-ekspression. Doxorubicin behandling inducerer senescens i brysttumorcellelinje MCF-7 celle gennem øget aktivitet af p53, og reducerer aktiviteten af ​​telomerase-aktivitet i denne cancercelle [12]. En tidligere undersøgelse rapporterede, at telomerase-aktivitet og hTERT-mRNA-ekspression blev inhiberet ved behandling med doxorubicin i forælder gastriske carcinoma cellelinier, men ikke i doxorubicin-resistente cellelinier [13]. Resultaterne af disse undersøgelser antydet en effekt af anthracycliner til inhibering af telomeraseaktivitet, og denne virkning har bidraget til den antitumoraktiviteten af ​​disse lægemidler.

Selvom anthracyclinantibiotika er blevet anvendt som anti-cancer lægemidler til mange år, deres kardiotoksicitet rejser en klinisk terapi bekymring [14]. Funktionerne i antracyklininduceret kardiomyopati i biopsier af behandlede patienter omfatter myofibriller tab, reticulum dilation, cytoplasmatisk vakuolisering, et øget antal lysosomer, og hævelse af mitokondrier i cardiomyocytter [15]. Tidligere undersøgelser har vist, at udviklingen af ​​kardiomyopati i doxorubicin behandling er forbundet med den indgivne dosis [16]. Denne bivirkning forekommer typisk inden for 1 år; men det kan også forekomme flere år senere under lægemiddelindgivelse. Endvidere kan anthracycliner også føre til sjældne (mindre end 1%) akut cardiotoksicitet (generelt forekommende inden for 1 uge) [17]. Derfor er udviklingen af ​​et nyt lægemiddel udøver en effektiv anti tumor effekt, men som udviser en mindre bivirkning såsom cardiotoksicitet, er fortsat søges cancerterapi.

NSC745885 er en ny forbindelse udviklet i 2009. Denne forbindelse blev syntetiseret fra 1,2-diaminoanthraquinon, som efterfølgende reagerer med thionylchlorid og triethylamin [18]. En tidligere undersøgelse fandt, at NSC745885 udviser en anti-cancer virkning, når anvendt på 60 cellelinien primær screening af National Cancer Institute (NCI). Resultaterne indikerede, at leukæmi, melanom, og æggestokkræft linjer var meget følsomme over for NSC745885. Ikke-småcellet lungecancer, coloncancer, neuroblastom, prostatacancer og brystcancer cellelinjer er også følsomme over for denne forbindelse. Endvidere denne tidligere undersøgelse rapporterede også, at NSC745885 er effektive til at undertrykke cellevækst i forskellige cancercellelinier, som er delvist opnås ved den inhibitoriske evne i telomeraseaktivitet på disse celler [18]. Men den

in vitro

anti-cancer potentiale og

in vivo

aktiviteten af ​​denne nye forbindelse i kræft i mundhulen er ikke blevet undersøgt.

I denne undersøgelse undersøgte vi anti-cancer potentiale NSC745885 i orale skællede carcinom-cellelinier og i en

in vivo

cancer oral xenotransplantat musemodel. Endvidere har vi også vurderet toksiciteten af ​​NSC745885 i andre organer i behandlede mus. Vores resultater viste, at denne nye forbindelse induceret apoptose af orale kræftceller enten i

in vitro

cellekultur eller i

in vivo

xenograft tumor musemodel. Derudover fandt vi også, at

in vivo

behandling af NSC745885 fremkaldte ingen cytotoksicitet i milten, lunge, lever eller hjerte af forsøgsdyr. Fundet af vores undersøgelse antydede, at NSC745885 kunne anvendes som et effektivt lægemiddel til oral cancerterapi, og denne behandling kan udvise et højere sikkerhedsniveau end traditionelle anthracyclinantibiotika gør.

Materialer og metoder

Celler og kemikalier

SAS blev opnået fra en dårligt differentieret menneske pladecellekræft [19]. Denne cellelinje blev leveret af Dr. Jeng-Fan Lo af Institut for Oral Biologi, Institut for Odontologi, National Yang-Ming University, Taiwan [20]. OECM-1 blev opnået fra gingival epidermoid karcinom i en taiwansk patient. SCC4 og SCC25 blev opnået fra tunge planocellulære kræftceller. Alle cellelinier blev opretholdt i en RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 25 mM HEPES og 1% penicillin /streptomycin. MRC-5-celle er en normal human føtal lunge fibroblast cellelinje (ATCC nr: CCL-171) holdes i en Minimum Essential Medium (MEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 25 mM HEPES, og 1% penicillin /streptomycin. NSC745885 [18] blev leveret af Dr. Hsu-Shan Huang fra Institut for Farmaci, National Defense Medical Center, Taiwan.

Vækst inhiberingsassay

Celler i den logaritmiske vækstfase blev dyrket på en densitet på 5000 celler /brønd i 96-brønds plader. Cellerne blev eksponeret for forskellige koncentrationer af NSC745885 i 24, 48 eller 72 timer. A 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay (Sigma, St. Louis, MO, USA) blev anvendt til at evaluere effekten af ​​NSC745885 på cellevækst, som tidligere beskrevet. IC

50 værdi resulterede fra 50% inhibering af cellevækst, der grafisk blev beregnet som en sammenligning med vækstkontrollen. Salg

Annexin V-farvning

Celler blev vasket med PBS og resuspenderet i 1 X Binding Buffer (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA). Resuspenderede celler blev farvet med FITC-konjugeret Annexin V (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA), og procentdelen af ​​Annexin V-positive celler blev analyseret ved flowcytometri.

Kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol-fremgangsmåden (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og homogenisering af cancercellerne i Trizol lysepuffer blev efterfulgt af chloroformekstraktion (Life Technologies). Til cDNA-syntese, blev 5 ug totalt RNA revers transkriberet ved 50 ° C i 60 minutter ved anvendelse af 200 enheder af Superscript III revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Primerpar for caspase-3 (sense 5′-CTG GAC TGT GGC ATT GAG AC-3 ‘; antisense 5′-ACA AAG CGA CTG GAT GAA CC-3′), XIAP (sense 5’-GAC AGT ATG CAA GAT GAG TCA AGT CA-3 ‘; antisense 5′-GCA AAG CTT CTC CTC TTG CAG-3′), og GAPDH (sense 5’-GGA AGG TGA AGG TCG GAG TCA-3 ‘; antisense 5’-GTC ATT GAT GGC AAC AAT ATC CAC T-3 ‘) blev anvendt til genamplifikation. SYBR Green /ROX qPCR Master Mix kit (Fermentas, Glen Burnie, Maryland, USA) blev anvendt til alle reaktioner med en real-time polymerasekædereaktion (PCR). Kort fortalt blev PCR udført som følger: en cyklus ved 50 ° C i 2 minutter, en cyklus på 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler af 15 sekunder hver ved 95 ° C, og 1 minut ved 60 ° C. Data blev indsamlet i tre eksemplarer og normaliseret med GAPDH udtryk.

Protein Extraction og Western blot analyse

Protein blev udtrukket fra en dyrket celle (SAS) lyseret i en celle lysis indeholder proteasehæmmere (50 mmol /l Tris (pH 7,5), 30 mmol /l MgSO

4, 8 mmol /l EDTA, 2 mmol /l DTT og 2% Triton X-100). Cellelysater blev klaret ved centrifugering ved 13000 rpm ved 4 ° C i 15 minutter. Proteinkoncentrationer af cellelysater blev målt under anvendelse af et BCA-assay (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Western blot-analyse blev udført ved anvendelse af 50 ug proteinekstrakter fra kontrol cancerceller, og celler behandlet med NSC745885 blev fyldt og separeret under anvendelse af 8% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese. Efter elektroforese blev proteinerne elektrooverført på en polyvinyldifluorid (PVDF) -membran (Millipore, Billerica, MA, USA), som derefter blev blokeret med en blokerende opløsning indeholdende 5% fedtfri mælkepulver i PBS plus 0,2% Tween 20 (PBST) i 1 time ved stuetemperatur. Efter blokeringen blev afsluttet, blev membranen vasket 3 gange med PBST. PVDF-membranen blev blottet med de følgende primære antistoffer i PBS: anti-XIAP; caspase-3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); og anti-actin (Sigma, St. Louis, MO, USA). Efter 2 timer ved stuetemperatur blev membranen igen vasket i PBST. PVDF-membranen blev derefter inkuberet med peroxidase-bundet anti-mus eller anti-kanin IgG-antistoffer i 1 time, udviklet anvendelse af et forstærket kemiluminescensdetektion kit (Millipore, Billerica, MA, USA) og analyseret med et Las-3000 billeddannende system ( Fujifilm, Tokyo, Japan).

xenograft Tumor Mouse Model

Otte uger gamle NOD /SCID (NOD.CB17

Prkdc

scid /J, National Laboratory Animal center, Taiwan) mus blev opretholdt i mikro-isolatorer under specifikke patogenfrie betingelser og fodret steril mad og chlorerede sterilt vand. Atten mus blev inddelt i 2 grupper, og hver gruppe mus blev subkutant injiceret med 3 x 10

6 SAS. Ni mus i hver gruppe blev yderligere behandlet med NSC745885 eller doxorubicin (2,0 mg /kg BW /d /i.p.), Og 9 mus i hver gruppe blev injiceret dagligt med en vehikelkontrol. NSC745885 blev først injiceret i hver gruppe af mus på dag 3, før nogen tumor blev palperes og løbende administreres indtil dag 10 i SAS-bærende mus. Størrelsen af ​​de transplanterede tumorer blev målt på hver tredje dag ved hjælp af udmålte bremsekalibre, og tumorvolumenet blev beregnet under anvendelse af følgende formel: volumen (V) = på 1/2 × (længde x bredde

2). Ved afslutningen af ​​behandlingen, blev musene aflivet, og tumorerne blev fjernet, vejet og fotograferet.

Etik erklæring

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier og blev godkendt af NDMC Institutional Animal Care og brug Udvalg. blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelserne for forsøgsdyr. (godkendelsesnummer: IACUC-11-044)

immunhistokemisk farvning

immunhistokemisk farvning blev udført ved hjælp af avidin-biotin metode beskrives som følger. Vævssnit blev afvokset i xylen og rehydratiseret i alkohol. Antigen-genvinding førtes gennem inkubation i 0,01 mol /l citratbuffer (pH 6,0) ved 95 ° C i 40 minutter i et vandbad. Den endogene peroxidase blev blokeret med 0,3% hydrogenperoxid i 30 minutter. Snittene blev derefter inkuberet med 5% normalt hesteserum i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur for at blokere en ikke-specifik antistofreaktion. Efter vask med TBS og 0,1% Tween 20 blev objektglassene inkuberet natten over ved 4 ° C med anti-human caspase-3 og et XIAP-antistof (DAKO, Osaka, Japan). Efter at være blevet skyllet i TBS og 0,1% Tween 20 blev vævssnit inkuberet i 40 minutter ved stuetemperatur med biotinyleret anti-mus IgG efterfulgt af et avidin-biotin-peroxidase-kompleks (Vecstatin Elite ABC kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame , CA) i 40 minutter. Efterfølgende blev vævssnittene farvet med 0,003% 3,3-diaminobenzide tetrahydrochlorid og 0,005% hydrogenperoxid i 0,05 mol /l Tris-HCI (pH 7,2), modfarvet med Mayers hematoxylin, dehydreret, og monteret.

Evaluering af immunhistokemisk farvning

en immunohistokemisk procedure uden tilsætning af det primære antistof blev anvendt som en negativ kontrol i hvert enkelt tilfælde. Intensiteten af ​​caspase-3 og XIAP immunoreaktiviteten af ​​tumorcellerne blev bedømt i 3 grupper, og standardiseres efter farvningen niveau som en positiv intern kontrol på en skala fra 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning), 2 (moderat farvning), og 3 (stærkeste intensitet). Fordelingen af ​​caspase-3 og XIAP mærkning blev også målt som i henhold til den procentdel af positivt farvede tumorceller (fra 0 til 100) i den samlede tumor volumen i hver sektion. For at vurdere distributionsområder af caspase-3 og XIAP udtryk nemmere og mere effektivt, blev 50% anset cutoff point. For at sammenligne kontrol og NSC745885-behandlede gruppe, procentdelen af ​​caspase-3 og XIAP-positive celler ved hver intensitet blev multipliceret med den tilsvarende intensitet (fra 0 til 3) indtil et immunfarvning score i området fra 0 til 300.

Statistisk analyse

det statistiske pakke til Samfundsvidenskab (SPSS Version 10.0 til Microsoft Windows, Chicago, IL, USA) blev anvendt til at fuldføre analysen af ​​de indsamlede data. En

t

-test og envejs variansanalyse (ANOVA) med Scheffe post-hoc test blev anvendt til at bestemme, om eventuelle væsentlige relationer eksisterede blandt de kvantitative resultater. Værdier på

P

0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

Vækst hæmmende virkning af NSC745885 på Oral kræftceller

For at undersøge indflydelsen af ​​NSC745885 behandling på oral planocellulært karcinom, vi behandlede SAS cancer oral celler med forskellige koncentrationer af NSC745885 i 24 timer og observerede deres morfologiske ændringer ved at anvende en fasekontrastmikroskop. Behandlingen af ​​NSC745885 ved koncentrationer på 3 pM til 5 uM faldt betydeligt tætheder af dyrkede celler sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 1A). At evaluere vækstinhiberende virkning NSC745885 blev SAS-celler udført med forskellige doser af NSC745885, og antallet af de overlevende celler blev målt på forskellige tidspunkter og sammenlignet med dem for ubehandlede celler ved MTT-assayet. Antallet af overlevende SAS celler blev væsentligt reduceret efter NSC745885 behandling i tids- og dosisafhængige manerer (fig. 1B-1D). IC

50 i NSC745885 var 0,85 uM på SAS-celler efter 72 timers behandling (fig. 1d). Disse resultater indikerede, at NSC745885 demonstrerede en vækstinhiberende eller død-fremmende virkning på SAS-celler. For at detektere apoptotiske SAS celler, udførte vi annexin V-farvning til at evaluere andelene af annexin V positiv under forskellige doser af NSC745885 behandling efter 24 timer. Procentdelene af annexin V-positive celler blev forøget på en dosis-afhængig måde (Fig. 2A-2E). Der er betydelige forskelle, når dosis behandling var højere end 0,5 uM (fig. 2F). Dette resultat viste, at NSC745885 behandling induceret tidlig apoptose i SAS celle.

(A) Morfologiske forandringer i SAS celler. Celler blev behandlet med angivne doseringer af NSC745885 i 24 timer. Doser højere end 3 μΜ forårsagede celledød i SAS celler. Overlevelsen af ​​NSC745885 behandlede SAS-celler blev vurderet ved MTT-assay på forskellige tidspunkter og doseringer. (B) 24 timer efter behandling, overlevelsen af ​​SAS-celler viste en signifikant forskel i de anvendte doser højere end 1 uM. (C) efter 48 timer, behandling ved 1 uM eller højere end doserne af NSC745885 udviste en signifikant anti-cancer virkning. (D) Efter 72 timers behandling, IC50 for NSC745885 var 0,85 pM i SAS-celler. Survival andel (%) angivet den relative værdi sammenlignet med køretøj kontrolgrupper i SAS (n = 3; *, P 0,05, **, P 0,01, ***, P 0,001;. Ns, ikke-signifikant).

SAS-celler blev behandlet med (A til E) indikerede doser NSC745885 i 24 timer. Høstede celler blev farvet med FITC-konjugeret annexin V og analyseret ved flowcytometri. (F) Procentdelen af ​​annexin V-positive celler under NSC745885 behandling blev sammenlignet med køretøjets kontroller (0 uM) (n = 3; **, P 0,01, ***, P 0,001; ns, ikke-signifikant.).

desuden har vi også undersøgt væksthæmmende effekt i andre orale cancer cellelinjer, herunder OECM-1, SCC25, og SCC4. Vi fandt, at NSC745885 udviste også en signifikant vækstinhiberende virkning i OECM-1-celler ved doseringerne af 1 pM eller mere ved enten 24 eller 48 timer efter lægemiddelbehandling (fig. 3A og 3B). Denne forbindelse udviste endog en højere inhiberende virkning i SCC4-celler (fig. 3C og 3D). Derimod er der betydelige forskelle kun ved 4 pM på SCC25 celler på enten 24 eller 48 timer (fig. 3E og 3F). For at undersøge indflydelsen af ​​NSC745885 i normale væv, vurderede vi også den cytotoksiske virkning af dette stof i MRC-5-celler (en normal human føtal lunge fibroblastcellelinie) [21]. Vores resultater viste, at kun høje koncentrationer af NSC745885 (4 uM) væsentlig indflydelse på væksten af ​​MRC-5 celler (Fig. 3G og 3H), hvilket indikerer, at NSC745885 udviser en specificitet for kræftceller.

Mundtlige kræftceller ( OECM-1, SCC4, og SCC25) og normal lunge fibroblast MRC-5 celler blev behandlet med NSC745885 i 24 eller 48 timer med angivne koncentrationer. Levedygtighed disse cellelinjer blev vurderet ved MTT assay.The resultater viste, at lav mikromolære koncentrationer af NSC745885 induceret (A) SAS celledød men påvirkede ikke væksten af ​​(G og H) MRC-5-celler (n = 3; * , P 0,05, **, P 0,01, ***, P 0,001; ns, ikke-signifikant)

NSC745885 Behandling fremkalder apoptose af SAS Celler

.. for at undersøge virkningen af ​​NSC745885 på induktionen af ​​apoptose i SAS-celler, blev cellerne behandlet med forskellige doser af NSC745885 i 24 timer, og mRNA-ekspressionsniveauer af caspase-3 blev målt ved hjælp af real-time RT-PCR. Vores resultat indikerede, at ekspressionen af ​​caspase-3 blev signifikant forøget med NSC745885 behandling på en dosis-afhængig måde (Fig. 4A). Proteinniveauer af caspase-3 og spaltet caspase-3 i SAS-celler blev også bestemt under anvendelse af western blot. Der var signifikante forøgelser i caspase-3 og spaltes caspase-3 under behandling med højere koncentrationer end 1 uM (fig. 4B). De relative proteinniveauer blandt forskellige doser blev sammenlignet ved anvendelse af en massefylde meter, viser ensartede resultater med direkte observation i Western blot (Fig. 4C og 4D). Disse data viste, at NSC745885 behandling inducerede apoptose af SAS-celler.

(a) de relative RNA-ekspression niveau af caspase-3 i SAS celle behandlet med angivne doseringer af NSC745885 i 24 timer blev vurderet ved anvendelse realtid RT-PCR. Ekspressionen af ​​caspase-3 steg signifikant med NSC745885 behandling i en dosis-afhængig måde. (B) Den caspase-3 og spaltede caspase-3 proteinniveauer i SAS celle behandlet med NSC745885 i 48 timer blev kvantificeret under anvendelse af western blot. (C) Resultaterne af western blot i caspase-3 blev evalueret i 3 uafhængige forsøg og normaliseret med β-actin (*, P 0,05, **, P 0,01, ***, P 0,001; ns., ikke-signifikant). Proteinet niveau af caspase-3 var størst i 1,5 μΜ af NSC745885 behandling. (D) Resultaterne af western blot i kløvet caspase-3 blev evalueret i 3 uafhængige forsøg (*, P 0,05;. Ns, ikke-signifikant).

NSC745885 Formindsker RNA og protein Ekspression af XIAP i SAS celler

X-bundet inhibitor af apoptose protein (XIAP) er blevet identificeret som et anti-apoptotisk protein i pattedyrceller [22]. Det spiller en kritisk rolle ved inhibering af apoptose i både død receptor-medieret og mitokondrier-medierede pathways [23], [24]. En nylig undersøgelse yderligere demonstreret, at XIAP er en indikator for kemoterapi respons og prognose for avancerede kræft hoved og hals patienter [25]. Derfor har vi også undersøge effekten af ​​NSC745885 på XIAP-genet og proteinekspression i orale cancerceller behandlede vi SAS cancerceller med forskellige koncentrationer (0 uM, 0,5 uM, 1,0 uM, 1,5 pM og 2,0 uM) i 24 timer og derefter bestemt deres ændring i genekspression ved hjælp af Q-PCR. Sammenlignet med kontrolcellerne, ekspressionen XIAP genet signifikant med NSC745885 behandling på en dosis-afhængig måde (Fig. 5A). Vi behandlede ligeledes SAS cancerceller med forskellige koncentrationer (0 uM, 0,5 uM, 1,0 pM, 1,5 pM og 2,0 pM) i 48 timer, og derefter bestemt deres proteinekspressionsplasmider ændringer ved hjælp af western blot. Et signifikant fald i XIAP blev observeret under behandling med højere koncentrationer end 1 uM (fig. 5B). De relative proteinniveauer blandt forskellige doser blev også sammenlignet under anvendelse af en massefylde meter, viser ensartede resultater med direkte observation i Western blot (fig. 5C). Disse resultater indikerede, at NSC745885 udviste en apoptose-fremmende virkning i SAS-celler.

Den relative RNA-ekspression niveau af XIAP i SAS celler behandlet med angivne doseringer af NSC745885 blev vurderet efter 24 timer under anvendelse realtid RT- PCR. Ekspressionen af ​​XIAP signifikant med NSC745885 behandling på en dosis-afhængig måde. (B) Ekspression af XIAP i SAS celler behandlet med NSC745885 blev kvantificeret under anvendelse af western blot efter 48 timers behandling. (C) Western blot resultater blev evalueret i 3 uafhængige forsøg og normaliseret med β-actin (*, P 0,05, **, P 0,01, ***, P 0,001). Proteinet niveau XIAP faldt i en dosisafhængig måde.

NSC745885 Forhindrer SAS Cell Growth

in vivo

For at vurdere anti-tumor potentiale NSC745885 på oral cancer

in vivo

gennemførte vi denne behandling i en xenograft tumorbærende musemodel. De SAS-celler blev podet i NOD /SCID-mus og NSC745885 blev injiceret på dag 3 i hver gruppe af mus, før nogen tumor blev palperes, og administreres dagligt indtil dag 10 i bærende mus. Tumorstørrelsen blev reduceret i de behandlede mus sammenlignet med tumorbærende kontrolmus, der blev behandlet med vehiklet alene (fig. 6A). De SAS-xenografter reduceret i vægt med 23 ± 10,39% med NSC745885 behandling (fig. 6B). Legemsvægten af ​​kontrollen og NSC745885-behandlede mus blev også vurderet på dag 1 og 10 efter lægemiddelindgivelse. Ingen signifikante forskelle fandtes i legemsvægt af kontrol eller NSC745885-behandlede mus (fig. 6C). Disse resultater indikerede, at NSC745885 behandling ved 2 mg /kg udviste et anti-oral cancer effekt, og denne behandling ikke førte til markant toksicitet i eksperimentelle mus.

(A) cancercelle implanteret NOD /SCID-mus blev administreret med NSC745885 (2 mg /kg /d). Indpodede tumorer blev isoleret på dag 10 efter lægemiddelindgivelse. NSC745885 behandlingen reducerede tumorstørrelse sammenlignet med vehikelkontrollen. (B) Den gennemsnitlige tumor vægt blev sammenlignet mellem NSC745885-behandlede og PBS-behandlede tumor-bærende mus på dag 10 (n = 9; *, P 0,01). (C) Det legemsvægt eksperimentelle mus ikke signifikant falde med NSC745885 behandling sammenlignet med den PBS behandlede kontroller.

NSC745885 inducere apoptose i xenotransplanteret tumorceller

For at observere direkte apoptotisk virkning NSC745885 på tumorceller

in vivo

udførte vi immunhistokemisk farvning for at vurdere status for den apoptotiske protein caspase-3 i xenotransplantater. Efter 10 dage efter transplantationen blev xenotransplantater fjernet, målt for størrelse og undersøgt med HE og immunhistokemisk farvning. Tumorerne fra NSC745885-behandlede mus udviste vævsskade i tumor del (fig. 7A) og en markant højere optælling af apoptotiske celler (caspase-3 positive celle) sammenlignet med kontrolplanterne tumorer (fig. 7B). Vi evaluerede også udtryk for XIAP i xenotransplantaterne. Resultatet viste, at de NSC745885-behandlede mus udviste en markant lavere optælling af anti-apoptotiske celler (XIAP positive celle) sammenlignet med kontrolgruppen tumorer (fig. 7C). Ekspressionsprodukterne snesevis af caspase-3-positive celler var 1,21 ± 0,04 og 2,87 ± 0,03 i kontrolgruppen og NSC745885-behandlede gruppe, (fig. 7D). Ekspressionsprodukterne snesevis af de XIAP positive celler var 2,24 ± 0,03 og 1,16 ± 0,02 i kontrolgruppen og NSC745885-behandlede gruppe, (fig. 7E). Følgelig vores resultater viste, at NSC745885 reducerer proliferation af SAS cancerceller, og udøvede antitumorvirkning

in vivo

gennem induktion af apoptose.

(A) De histologiske ændringer i tumor transplantater blev vurderet ved anvendelse HE-farvning. Sammenligning af PBS-kontrol med NSC745885-behandlede grupper viste udtalt tumornekrose i NSC745885-behandlede gruppe. (B) Ekspressionsniveauet af caspase-3 i de isolerede tumor transplantater blev vurderet ved anvendelse immunhistokemisk farvning. (C) Ekspressionsniveauet af XIAP i isolerede tumor transplantater blev også evalueret under anvendelse af immunhistokemisk farvning. Ekspressionsniveauerne scorer for caspase-3 (D) og XIAP (E) blev kvantificeret, afslører en stigning i ekspressionen af ​​caspase-3 med NSC745885 behandling (P 0,05). Derimod udtryk for XIAP i tumor transplantater faldt med denne behandling (P 0,05).

Effekter af NSC745885 på kropsvægt i Mus

For at bestemme om NSC745885 behandling årsager tab af kropsvægt, monitorerede vi ændringen af ​​kropsvægten i den eksperimentelle mus. En væsentlig cytotoksisk virkning af NSC745885 blev afsløret med den daglige administration af NOD /SCID ved en dosering på 40 mg /kg /d (Fig. 8A). Legemsvægten af ​​mus behandlet med den højere dosis var signifikant reduceret, og alle musene døde ved dag 14. I denne undersøgelse fandt vi, at den maksimalt tolererede dosis af NSC745885 i mus var 40 mg /kg /d. For at bestemme om NSC745885 behandling skabt cytotoksicitet med organer fra de eksperimentelle mus blev milt, lunger, lever og hjerter høstet fra PBS-behandlede og NSC745885-behandlede mus på dag 14 og blev vurderet under anvendelse af en histologisk analyse. Ingen indlysende forskelle eksisterede i organer PBS-behandlede eller NSC745885-behandlede mus (fig. 8B-8E). Dette resultat indikerede, at den daglige behandling af NSC745885 ved 2,0 mg /kg /d i.p. fremkaldte ingen markante bivirkninger hos musene.

(A) NOD /SCID-mus blev behandlet med PBS eller angivne daglige doser af NSC745885, og kropsvægt disse mus blev målt. Indflydelsen af ​​NSC745885 behandling på organer i eksperimentelle mus blev vurderet ved anvendelse af en histologisk analyse og HE farvning på dag eksisterede 14. Ingen åbenbare forskelle i (B) milt, (C) lunge, (D) lever, eller (E) hjertet af PBS-behandlede og NSC745885-behandlede mus.

Sammenligninger af sikkerhed og anti-tumor Effektivitet mellem NSC745885 og doxorubicin

for at sammenligne sikkerheden i NSC745885 med doxorubicin, vi behandlet NOD /SCID-mus med disse to forbindelser ved 2 mg /kg /d ip i 10 dage. Overlevelse og kropsvægt af eksperimentelle mus blev overvåget dagligt. Vores resultater viste, at 50% af doxorubicin-behandlede mus var døde på dag 11 (fig. 9A). Derimod blev alle NSC745885-behandlede mus overlevende på dag 11 (fig. 9A). Der er betydelige faldt i legemsvægtene af doxorubicin-behandlede mus sammenlignet med NSC745885-behandlede grupper (fig. 9B). Disse resultater viste, at NSC745885 udstillet et højere sikkerhedsniveau end doxorubicin. Endvidere har vi også sammenlignet anti-tumor effektivitet mellem disse to lægemidler ved at måle tumor vægt i xenotransplantat tumorbærende model. NOD /SCID-mus blev inokuleret med SAS-celler og behandlet med 2 mg /kg /d i.p. af doxorubicin eller NSC745885 fra dag 3 til dag 10 efter celleinokulering. Tumorer blev høstet på dag 11 (fig. 9C, n = 9) og tumorvægte blev målt. Der er ingen signifikant forskel mellem doxorubicin-behandlede og NSC745885-behandlede grupper (fig. 9D, n = 9), hvilket indikerer en sammenlignelig anti-tumor effektivitet mellem disse to lægemidler.

cancercelle implanteret NOD /SCID-mus