PLoS ONE: nedregulering af Pax6 af shRNA Forhindrer spredning og cellecyklusprogression for Human ikke-småcellet lungekræft cellelinier

Abstrakt

Baggrund

transskription faktor Pax6 er primært udtrykt i fostre. Pax6 udtrykkes også i flere tumorer og spiller en onkogen rolle. Men lidt er kendt om den rolle, Pax6 i lungekræft.

Metoder

Funktionen af ​​Pax6 i lunge kræftceller blev evalueret ved små interfererende RNA-medieret nedbrydning af proteinet efterfulgt af analyser af celleproliferation, forankringsuafhængig vækst, og cellecyklusstop. Ændringerne af cyclin D1, pRB, ERK1 /2, p38-ekspression forårsaget af Pax6 inhibering blev påvist under anvendelse western-blotting. Pax6 mRNA niveau i 52 par af tumorer og tilsvarende matchede tilstødende normale væv fra ikke-små patienter celle lungekræft og lungekræft cellelinier blev opdaget af real-time PCR.

Resultater

Suppression af Pax6-ekspression inhiberes cellevækst og kolonidannelse i A549 og H1299-celler. Procentdelen af ​​celler i G1-fasen øges, når Pax6-ekspression blev inhiberet. Cyclin D1 proteinniveauet, samt pRB phosphorylering niveau, reduceres som følge af Pax6 nedregulering. Aktiviteten af ​​ERK1 /2 og p38 blev også undertrykt i Pax6 knock-down celler. Pax6-mRNA blev højt udtrykt i lungekræft væv og lungekræft cellelinier. I de fleste patienter (ca. 65%), det relative forhold af Pax6 mRNA i primær NSCLC versus tilstødende væv oversteg 100.

Konklusioner

Vores data impliceret, at Pax6 accelererer cellecyklusprogression ved at aktivere MAPK signal pathway. Pax6 mRNA niveauer var signifikant forhøjet i primær lungekræft væv i forhold til deres matchede tilstødende væv

Henvisning:. Zhao X, Yue W, Zhang L, Ma L, Jia W, Qian Z, et al. (2014) nedregulering af Pax6 af shRNA Forhindrer spredning og cellecyklusprogression for Human ikke-småcellet lungekræft cellelinier. PLoS ONE 9 (1): e85738. doi: 10,1371 /journal.pone.0085738

Redaktør: Christina Lynn Addison, Ottawa Hospital Research Institute, Canada

Modtaget: 16. juli 2013; Accepteret: December 1, 2013; Udgivet: 15 januar 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Beijing Novel Program tilskud (nr 2006B34); Beijing Research Foundation for Excellent Talents (nr 20061D03); Beijing Dyrkning Projekt for Key Teknisk og Medicin Produkt (nr Z101100055610030); Den Videnskabelige Research fælles program for Beijing Municipal Kommissionen for uddannelse (nr KM201210025024). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

En nylig overblik over globale statistikker kræft viste, at lungekræft var det mest almindeligt diagnosticeret kræft, samt den førende årsag til kræft død [1]. Tidlig påvisning og målrettet terapi er en potentiel metode til forebyggelse og terapi [2] lungekræft. Det er vigtigt at finde ud af hvilke veje eller proteiner er aktive i lungetumor progression [3]. På grundlag af den “cancer stamceller hypotese,” tumorer menes at opstå gennem vævsspecifik stamcelle ekspression [4] – [6]; med andre ord, er tumorer tilskrives stamcellefaktor overekspression [3], [5], [7]. Parret-box 6 (Pax6) er en vigtig transskription faktor under embryogenese og en stamcelle faktor [3]. Derfor kan Pax6 spille en vigtig rolle i tumorigenese.

Pax6 tilhører PAX-genfamilien, der koder en gruppe af ni parrede-box transkriptionsfaktorer med vigtige roller i udvikling og sygdom [3]. Pax6 er en vigtig transkriptionsfaktor i udviklingen af ​​øjnene, bugspytkirtel og centralnervesystemet [3], [8]. Pax6-ekspression blev for nylig fundet i tumorer, hvilket antyder et onkogent rolle [9]. Pax6 er ofte udtrykt i retinoblastoma, pancreas tumorer, og tarm tumorer [6], [10], [11]. Pax6 ligeledes højt udtrykt i hjerne og brystkræft cellelinier [9]. I pancreas carcinoma cellelinier, inhibering af Pax6-ekspression fører til et fald i cellevækst og overlevelse [12]. Pax6 er også en regulator af MET tyrosinkinasereceptor udtryk i pancreas karcinom cellelinjer [12]. MET er en potentiel biomarkør og terapeutisk mål for tumorer, hvilket bekræfter onkogene rolle Pax6 i tumorigenese [13].

Det var tidligere rapporteret, at PAX8 og PAX5 er højt udtrykt i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC ) og småcellet lungecancer cellelinier henholdsvis [14]; men lidt er kendt om Pax6-ekspression og funktion i lungekræft. I denne undersøgelse undersøgte vi, om Pax6 reguleres celleproliferation af NSCLC. Vores resultater viser, at Pax6 fremmer G1-S progression ved at aktivere MAPK signalvejen. Pax6-mRNA blev ofte udtrykt i lungekræft væv sammenlignet med et tilsvarende tilstødende ikke-neoplastisk væv. Dette antyder, at Pax6 er en ny potentielt mål i lungekræft.

Materialer og metoder

RPMI 1640, føtalt bovint serum (FBS), og Trizol Reagent blev indkøbt fra Invitrogen (Carlsbad, CA) ; M-MLV revers transkription, CellTiter 96® vandig ikke-radioaktivt celleproliferationsassay, oligo-dT, og dNTP blev opnået fra Promega (Madison, WI); SYBR® Green PCR Master Blanding var fra Applied Biosystems (Carlsbad, CA); anti-Pax6-antistoffer blev anskaffet fra Abnova (Taibei, Taiwan), anti-pRB, -ERK1 /2, p38, -pERK, -pp38, -cyclin D1, og -pRB (S780 phosphorylering) antistoffer blev opnået fra Abcam (Cambridge, England, UK); og forøget kemiluminescens (ECL) reagens blev opnået fra Pierce (Rockford, IL). Propidiumiodid (PI), RNase A, og protease inhibitor cocktail blev købt hos Sigma (St. Louis, MO).

Prøver Salg

tooghalvtreds NSCLC prøver blev opnået fra patienter, der gennemgår kirurgisk resektion på Beijing Chest Hospital. Primære lungekræft prøver og matches, tilstødende normale væv blev brugt.

Undersøgelsen og brug af prøver blev gennemgået og godkendt af Research Etik udvalget i Beijing Chest Hospital, Capital Medical University (Beijing, Kina). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. De kliniske karakteristika for de patienter, er anført i tabel 1.

Cellekultur

human lunge-adenocarcinom cellelinier A549 og NCI-H1299, humane storcellet lungecarcinom cellelinier NCI-H460 , småcellet lungecancer cellelinje NCI-H446, menneskelige embryo lungefibroblaster (MRC-5) blev opnået fra National Platform of Experimental Cell Resources Sci-Tech. Humane store celle lunge karcinom cellelinjer, 95C, blev 95D og 801D fås fra tumoren centrum af kinesiske Academy of Medical Sciences. Human lunge-adenocarcinom-cellelinje A2 og pladecellecarcinom cellelinie L blev isoleret og etableret ved vores laboratorium. Lungekræft cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco, Los Angeles, CA, USA). MRC-5 blev opretholdt i MEM-EBSS tilsat 10% FBS.

Konstruktion af et Pax6 shRNA lentiviral vektor og infektion i celler

Fire RNA-interferens (RNAi) kandidat målsekvenser blev designet baseret på det menneskelige

Pax6

mRNA-sekvens og klonet ind i pGCSIL-GFP-vektoren (GeneChem, Shanghai, Kina). RNAi-sekvensen GAGTAGCGACTCCAGAAGT var den mest effektive til at undertrykke Pax6-mRNA i H1299 og A549-celler, og blev anvendt i efterfølgende eksperimenter for at vælte endogen Pax6. Nonsilencing (NS)-lille interfererende RNA (shRNA) (TTCTCCGAACGTGTCACGT) blev også klonet i pGCSIL-GFP-vektoren og anvendt som en kontrol (GeneChem). Den rekombinante virus blev pakket i 293T-celler under anvendelse af en Lentivector Expression System (GeneChem).

I cellulær infektion blev H1299 og A549-celler subdyrket ved 5.000 celler /brønd i 96-brønds kulturplader og inficeret med lentivirus-medieret Pax6-shRNA eller NS-shRNA. GFP-ekspressionsniveauet blev påvist via fluorescensmikroskopi (Nikon, Tokyo, Japan) for at bestemme infektionseffektivitet.

RNA-isolering og real-time PCR

Samlet RNA fra væv og celler blev isoleret med Trizol Reagent ifølge fabrikantens protokol. Den totale RNA-koncentrationen blev beregnet ved at måle OD

260, og prøverne blev opbevaret ved -80 ° C.

Totalt RNA (2 ug) blev revers-transkriberet under anvendelse af en M-MLV revers transkriptase Kit ifølge til fabrikantens protokol. CDNA’et (20 ng) blev blandet med SYBR® Green Master Mix, og gener blev amplificeret med passende primere under anvendelse af en real-time PCR detection system (ABI7500; Life Technologies, Carlsbad, CA). De relative ekspressionsniveauer af Pax6-mRNA blev beregnet ved normalisering til β-actin mRNA-niveau. De anvendte PCR-primere var som følger: Pax6 fremad, 5′-TTCAGCACCAGTGTCTACCA-3 ‘; Pax6 omvendt, 5’-GCTGTAGGTGTTTGTGAGGG-3 ‘; β-actin fremad, 5’-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3 ‘; og β-actin omvendt, 5’-GCTGTCACCTTCACCGTTC -. 3 ‘

Celleproliferationsassay

Et proliferationsassay blev udført under anvendelse ikke-radioaktivt celleproliferationsassay ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt, 5.000 celler /brønd blev podet i 96-brønds dyrkningsplader i RPMI 1640 indeholdende 10% FBS. Cellerne blev dyrket i 5 dage, derefter 20 pi af 3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) blev tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 3 timer hver 24 timer. Absorbansen blev registreret ved 490 nm med en universal mikropladelæser (Bio-Rad, Hercules, CA). Alle forsøgene blev gentaget tre gange. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SEM.

Kolonidannelse assay

Celler blev podet i tre eksemplarer ved 300 celler /brønd i en 6-brønds plade. Efter 7 dages dyrkning blev cellerne vasket to gange med NaCl (0,9%), farvet med 2% ensianviolet i 20 minutter, vasket med vand, og lufttørret. Foci blev talt ved mikroskopi. Forsøgene blev gentaget tre gange, og data er vist som middelværdi ± SEM.

Soft-agar-assay Salg

Celler (1.000) blev podet i plader med 6 brønde i 2 ml vækstmedium indeholdende 0,3 % agar og anvendes til at overlejre 1,4-ml lag af vækstmedium indeholdende 0,6% agar. Efter 21 dages dyrkning blev kolonierne talt. Alle forsøgene blev gentaget tre gange. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SEM.

Cellecyklusanalyse

Celler blev høstet, vasket med koldt PBS to gange og fikseret i 70% ethanol ved -20 ° C natten over. Cellerne blev derefter centrifugeret (1.500 rpm, 10 min) og vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS). Derefter blev cellerne resuspenderet i 0,5 ml PBS indeholdende 50 ug /ml RNase A i 1 time ved 37 ° C. Cellerne blev derefter ladet med 65 pg /ml PI i 30 minutter i mørke ved 4 ° C. Procentdelen af ​​celler i forskellige faser af cellecyklus blev målt ved flowcytometri (Beijing Bestemmelse af traditionel kinesisk medicin Research Institute). Forsøgene blev gentaget tre gange. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SEM.

Western blotting

Celler blev spaltet med trypsin og centrifugeret. Cellepelleten blev vasket to gange med PBS. Derefter blev cellerne sprængt i lysisbuffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% SDS og 1 × proteaseinhibitorcocktail) på is i 15 minutter og centrifugeret ved 12.000 rpm i 20 min. Uopløseligt materiale blev fjernet og proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af et bicinchoninsyre kit. Til Western blot-analyse, cellelysater (30 ug /brønd) blev underkastet SDS-PAGE og overført til nitrocellulose filtermembraner. Membranerne blev inkuberet med primære antistoffer (anti-Pax6, -ERK1 /2, p38, -pERK, -pp38, -cyclin D1, -RB, eller -RB S780 phosphorylering) natten over ved 4 ° C. Sekundære antistoffer konjugeret med peberrod peroxidase blev efterfølgende anvendt. Signaler blev påvist under anvendelse af ECL og eksponeret for Kodak X-OMAT film. Resultaterne blev scannet og analyseret ved hjælp af Alpha View analyseværktøjer.

Statistisk analyse

Alle værdier er angivet som middelværdi ± SEM. Gennem real-time RT-PCR, MTS assay, kolonidannelse, soft-agar-analyser, cellecyklus analyse og western-blot-assay, til sammenligning mellem hjælp af 2 grupper blev statistiske forskelle testet med uparret Student

t

-tests. Statistisk signifikans blev testet ved hjælp af SPSS Statistics, udgave 13.0. P 0,05 (*) blev betragtet anderledes; P 0,01 (**) blev betragtet signifikant forskellige

Resultater

Pax6 mRNA-ekspression blev hæmmet i celler inficeret med Pax6 shRNA lentiviral vektor

Pax6 mRNA-ekspression blev bestemt. i denne undersøgelse. Som vist i figur 1A, blev Pax6 stærkt udtrykt i de fleste lungekræft cellelinier. I modsætning hertil MRC-5, en normal human føtal lunge fibroblastcellelinie, udtrykte ikke Pax6 (figur 1A).

A, Real-time PCR-analyse for Pax6-mRNA-ekspression niveau i H460, A2, 95C , 95D, H1299, H446, 801 D, A549 og L-lungekræft linjer, samt i normal human føtal lunge fibroblastcellelinie MRC-5. B, -C, Bekræftelse af Pax6-mRNA knockdown af real-time RT-PCR-assays udført på totalt RNA isoleret fra A549 (B) og H1299 (C) celler inficeret med Pax6-shRNA, eller en tilfældig shRNA. Pax6-mRNA ekspressionsniveauer i A549 og H1299-celler blev målt ved kvantitativ realtids-RT-PCR. Y-aksen repræsenterer det normaliserede Pax6-mRNA-ekspression i forhold til A549 (B) eller H1299 (C) celler. ** P 0,01. D proteinet niveauer af Pax6 blev bestemt ved western-blot og GAPDH ekspressionsniveauet blev anvendt som kontrol. Kvantificering blev foretaget ved at bestemme det grå niveau af Pax6-protein, som blev normaliseret mod GAPDH niveauer. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM af uafhængige forsøg (tidspunkter af eksperimenterne er anført ovenfor histogrammerne). Pax6 udtryk var tydeligvis svækket i A549 Pax6 KD og H1299 Pax6 KD celler.

For at belyse, om Pax6 udtryk har nogen effekt på væksten af ​​lungekræft celler, RNAi blev anvendt til at generere Pax6 knock-down ( Pax6-KD) cellelinier. Vi valgte to mål cellelinjer: H1299, som viste høje niveauer af Pax6 udtryk, og A549, som viste lave niveauer af udtryk. I den foreliggende undersøgelse blev pGCSIL-Pax6 shRNA-GFP inficeres i H1299 og A549-celler. Celler blev også inficeret med pGCSIL-NS shRNA-GFP (Pax6-NS) som negativ kontrol (NC). For at bestemme funktionen af ​​Pax6, H1299, H1299NC, A549 eller A549NC celler blev anvendt som kontroller i alle assays.

Pax6-mRNA-niveau i H1299 Pax6 KD og A549 Pax6 KD-celler blev bestemt ved real-time PCR at bekræfte, om Pax6 udtryk specifikt blev hæmmet gennem RNAi i A549 og H1299 celler. Som vist i figur 1B, blev Pax6-ekspression i A549 Pax6 KD-celler inhiberes med 80-90% sammenlignet med celler inficeret med lentivirus-medieret NS-shRNA. Vi fandt lignende resultater i H1299 Pax6 KD-celler. Pax6-mRNA-ekspression i disse celler blev også inhiberet af 90-95% sammenlignet med NC-celler (*

* P

0,01, figur 1C).

Pax6-protein-ekspression i disse celler var detekteret ved Western blotting. Som vist i figur 1D, Pax6-protein i H1299 Pax6 KD og A549 Pax6 KD-celler blev ikke opdages hurtigt, hvorimod en klar Pax6 proteinbånd var tydelig i kontrolcellerne.

Inhibering af Pax6-ekspression fører til et fald i celleproliferation

Pax6 er en kritisk transkriptionsfaktor som spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​proliferation og differentiering under human embryonisk udvikling [3]. En celle proliferation assay blev udført for at bestemme, om Pax6 spiller en rolle i cellulær vækst. A549 Pax6 KD, H1299 Pax6 KD, og ​​kontrolceller blev podet i plader med 96 brønde og celleproliferation blev målt under anvendelse af et celleproliferationsassay kit. A549 og H1299 cellevækst var naturligvis undertrykt da Pax6-ekspression blev inhiberet af RNAi (figur 2A og B). Som vist i figur 2A og B, faldet i cellevæksten som følge af inhibering af Pax6-ekspression i H1299 var meget stærkere end den, A549-celler. Disse forskellige resultater kan tilskrives de forskellige Pax6-ekspressionsniveauer mellem H1299 og A549-celler er vist i figur 1A og D.

A, -B, A549 Pax6 KD, H1299 Pax6 KD celler og kontrolceller blev podet i plader med 96 brønde og en MTS-assay blev udført. Absorbansen ved 490 nm (y-akse) blev målt ved 24-timers intervaller, op til 120 timer. C, D, Kolonidannelse effektivitet i A549 Pax6 KD, H1299 Pax6 KD-celler, og kontrolceller. Y-aksen repræsenterer det normaliserede kolonidannelse rate i forhold til A549 (C) eller H1299 (D) celler. E, -F, En blød -agar assay blev udført for at undersøge virkningerne af Pax6 på tumorigenese in vitro. Y-aksen repræsenterer det normaliserede bløde -agar kolonidannelse rate i forhold til A549 (E) eller H1299 (F) celler. Dataene er udtrykt som middel ± SEM fra tre separate forsøg. Times af forsøgene er anført over grafen * P. 0,05, ** P. 0,01

Reduceret kolonidannelse og soft-agar kolonidannelse i Pax6 KD celler

Kolonidannelse repræsenterer et tab af kontaktinhibering eller evnen til at opretholde cellevækst og bevægelse trods kontakt med omgivende celler. At afklare, hvorvidt Pax6 kan indebære et tab af kontaktinhibering, celler inficeret med pGCSIL-Pax6 shRNA-GFP samt deres kontrolceller blev podet i plader med 6 brønde og dyrket i 7 dage. Efter 2% ensianviolet farvning blev kolonier indeholdende mere end 50 celler talt under et lysmikroskop. Som vist i figur 2C og D, inhibering af Pax6-ekspression i A549 og H1299-celler førte til en tydelig nedgang i antallet af foci genereret sammenlignet med kontrolcellerne (*

* P

0,01).

for yderligere at studere funktionen af ​​Pax6 blev blød agar kolonidannelse analyseres for at afgøre, om Pax6 bidraget til forankringsuafhængig kolonidannelse i lunge kræftceller. Hastigheden for blød-agar kolonidannelse faldt i A549 Pax6 KD og H1299 Pax6 KD celler i forhold til NC-celler (*

* P

0,01,

* P

0,05; Figur 2E og F).

Pax6-ekspression øget cellevækst ved at fremme hurtigere progression til S-fasen af ​​cellens cyklus

at påvise effekten af ​​Pax6 på cellecyklusprogression, cellecyklus progression af A549 Pax6 KD, H1299 Pax6 KD, A549 Pax6 NC, H1299 Pax6 NC, A549, og H1299-celler blev analyseret ved flowcytometri. Som vist i figur 3A, blev procentdelen af ​​celler ind i S-fasen faldt i A549 Pax6 KD cellelinje sammen med en stigning i populationen af ​​G0-G1-fase celler. Et lignende resultat blev observeret i H1299 Pax6 KD, H1299 Pax6 NC, og H1299-celler (figur 3B). I disse eksperimenter Pax6-ekspression førte til cellevækst ved induktion cellecyklusprogression.

A, B, Cellecyklusanalyse. Celler blev farvet med propidiumiodid (PI) og analyseret for cellecyklus fasefordeling. Histogrammet var de statistiske data fra tre uafhængige eksperimentelle replikater. * P 0,05, ** P. 0,01

I denne undersøgelse ekspressionsniveauet af cyklin D1, en relevant cyklin regulerer G1-S progression [15], [16], var påvist i A549 Pax6 KD og H1299 Pax6 KD-celler. Som angivet i figur 4A, blev cyclin D1-ekspression faldet i A549 Pax6 KD cellelinjer sammenlignet med kontrolceller. Vi fandt et lignende resultat i H1299 Pax6 KD-celler (figur 4A). En anden relevant cyclin regulerer G1 /S progression er cyclin E [17]. Vi bestemt også, om cyklin E blev reguleret af Pax6 udtryk. Som et resultat blev cyclin E-ekspression ikke påvirkes af den stabile shRNA-medieret knockdown af Pax6 i lungecancerceller (data ikke vist). Dette viser, at Pax6 kan fremme cellevækst ved at inducere cyklin D1 udtryk.

A, B, Udtrykket af cyklin D1, pRB og det phosphorylerede pRB i A549 Pax6 KD, A549 NC, A549 celler samt H1299 PAX6KD , H1299NC blev H1299-celler bestemt ved Western blotting. β-actin og GAPDH-ekspression blev målt som interne loading kontrol hhv. Cyclin D1 og PRB niveauer blev målt ved den grå niveau og blev normaliseret ved interne lastning kontrol. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM. Times af eksperimenterne er anført ovenfor histogrammerne. * P 0,05, ** P. 0,01

Den største substrat af cyklin D1-CDK4 /6-komplekser er retinoblastoma protein (pRB) [18]. Således blev pRB S780 proteinphosphorylering også detekteret ved Western blotting (figur 4B). Den S780 phosphorylering af pRB blev nedsat, når Pax6-ekspression blev inhiberet i A549-celler. Et lignende resultat blev opnået, når H1299 Pax6 KD celler blev anvendt (Figur 4B).

MAPK signal pathway blev undertrykt ved inhibering af Pax6

MAPK (mitogenaktiveret proteinkinase) pathway har været impliceret i reguleringen af ​​G1 /S overgange og celle mitose [19]. I vores undersøgelse blev nogle centrale regulatoriske molekyler af MAPK pathways undersøgt under anvendelse western blot analyse. Som vist i figur 5, blev phosphoryleringsniveauerne af ERK1 /2 og p38 faldet både i A549 Pax6 KD og H1299 Pax6 KD-celler. Det viste, at MAPK signal blev svækket skyldtes RNAi indblanding af Pax6.

Western-blot-analyse af A549, A549 NC, A549 Pax6 KD, H1299, H1299NC, H1299 Pax6 KD med antistoffer mod ERK1 /2 ( A) blev p38 (B) og deres phosphorylerede former vist i figuren. GAPDH og β-actin blev anvendt som interne lastning kontrol hhv. ERK1 /2 og p38 niveauer blev normaliseret ved GAPDH og β-actin henholdsvis. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM. Alle forsøgene blev gentaget tre gange. * P 0,05, ** P. 0,01

Pax6 blev stærkt udtrykt i lungekræft væv

Pax6 mRNA i lungekræft væv, samt matchede tilstødende væv, blev påvist at bekræfte rolle Pax6 i lungekræft. De kliniske karakteristika for de 52 patienter er angivet i tabel 1. Som vist i figur 6A, blev Pax6-mRNA rigeligt udtrykt i tumorvæv i sammenligning med tilstødende normale væv. Ekspressionen af ​​Pax6 repræsenteret af en cancer-til-tilstødende nontumorous væv-forholdet for hver enkelt blev angivet i figur 5B. Pax6-ekspression i lungekræft væv var højere end i hvert matchet hosliggende normalt væv i alle undtagen tre tilfælde (figur 6B). De statistiske resultater blev anført i skema 2, og forholdet (tumor /tilstødende væv) af 65% af patienterne (34 prøver) oversteg 100. Det vil sige, i de fleste tilfælde blev Pax6 hovedsageligt udtrykt i lungekræft væv.

A, Real-time PCR-analyse af Pax6 ekspressionsniveau i lunge cancer væv, såvel som de matchede tilstødende væv, fra 52 patienter. Pax6-mRNA niveau blev normaliseret ved β-actin ekspressionsniveau. B, hver kolonne repræsenterer det relative forhold af Pax6-mRNA i primær NSCLC versus tilstødende lungevæv, og linjen på tværs af grafen repræsenterer værdien 1 og 10. Alle forsøgene blev gentaget tre gange. ** P. 0,01

Diskussion

I vores undersøgelse blev funktionen af ​​Pax6 i lungekræft celler undersøgt. Væksten evne A549 og H1299 celler blev afvist, da Pax6 udtryk blev hæmmet af specifik Pax6 shRNA. Vi foreslår, at Pax6 fremmer G1-S progression ved at aktivere MAPK signal-vejen. Og Pax6 blev stærkt udtrykt i lungekræft væv og lungekræft cellelinier.

transskription faktor Pax6 spiller forskellige roller i forskellige tumorer. Den er ofte udtrykt i bugspytkirtelkræft og retinoblastomceller, implicerer en onkogen funktion, mens Pax6 er anerkendt som en tumor suppressor i gliomer og prostatakræft [6], [10], [11], [20], [21] .PAX6 ekspression er signifikant reduceret i glioblastomer og ekspressionsniveauet er korreleret med længere patientoverlevelse [22]. Pax6 undertrykker glioblastom cellevækst, forankringsuafhængig vækst og gliom angiogenese samt invasivitet af glioblastom celle, via inhibering af matrixmetalloproteinase-2 (MMP2) ekspression og vaskulær endotel vækstfaktor A (VEGFA) ekspression [20], [23], [24]. I prostatacancer, Pax6-ekspression var lavere i cancervæv og cancercellelinjer end normale epitelceller [21]. Overekspression af Pax6 undertrykte spredning og koloni dannelse af prostata kræftceller [8].

Men Pax6 spiller en onkogen rolle i bugspytkirtelkræft og retinoblastoma [4], [22] .I pancreas adenocarcinom og kræft i bugspytkirtlen cellelinjer , nedregulering af Pax6 ved specifik siRNA fører til et fald i cellevækst og celle apoptose [12]. Methylering af Pax6-promotorer forøges i begyndelsen blærecancer og methyleret Pax6-promotorer kunne være en repræsentere biomarkør for denne sygdom [25]. Og undertrykkelsen af ​​Pax6-mRNA-ekspression resulterede i en hæmmet vækst og en øget apoptose af dyrkede humane retinoblastomceller [26]. Vores resultater viser også, at Pax6 implicerer et onkogent funktion i lungekræft. I vores resultater, blev Pax6-mRNA stærkt udtrykt i begge lungekræft væv og lungekræft cellelinier. A549 og H1299 cellevækst blev inhiberet ved specifik Pax6 shRNA. Undertrykkelse af Pax6-ekspression ført til nedsat cellevækst og kolonidannelse, samt forankringsuafhængig kolonidannelse. Men vores resultater viser, at celle apoptose ikke var påvirket af hæmning af Pax6 (data ikke vist). Og celle migration blev heller ikke påvirket af undertrykkelse af Pax6 mRNA (data ikke vist)

Pax6 er kræft-afhængig og har forskellige signalveje i forskellige tumorer [13], [20] – [24]., [26]. I HeLa-celler, Pax6 regulerer cellecyklus-progression ved at fremkalde ekspressionen af ​​human RFPL1 (hRFPL1), som nedregulerer cyclin B1 og Cdc2 ekspression og fører til akkumulering af celler i G2-M-fasen [27]. Vi fokuserede også på den rolle Pax6 i reguleringen af ​​cellecyklusprogression i lungekræft. I vores cellecyklusanalyse blev cyclin D1 undertrykt i A549 Pax6 KD og H1299 Pax6 KD-celler. Det viste, at Pax6 udtryk forfremmet cellecyklusprogression ved overgang celler fra G1 til S-fasen. I overensstemmelse med disse resultater viste cellecyklus analyse en væsentlig reduktion i G0 /G1 anholdelse og en betydelig induktion af G2 /M anholdelse i Pax6 overekspression humane retinoblastomceller [28].

cyclin D1-CDK4 og cyklin D1 cdk6 komplekser i begyndelsen til midten af ​​G1 fasen phosphorylere og inaktivere pRB [29], [30]. Vores resultater i denne undersøgelse indblande at pRB S780 fosforylering niveau blev svækket, da Pax6 udtryk blev hæmmet. demonstrerede således, vi, at Pax6 øget ekspression af cyclin D1 og forøget cellevækst ved at fremme G1-S overgangen. Mitogen-induceret Ras-signalering fremmer transkription af cyclin D1-genet og det afhænger af MAPK signal pathway [31]. Vores resultater indikerer, at inhibering af Pax6 nedsætter phosphorylering niveau af ERK1 /2 og p38. Disse undersøgelser tyder på, at Pax6 regulerer celle G1 /S progression via MAPK signal vej hos lunge kræftceller.

Men den reguleringsmekanisme af Pax6 i lungekræft er stadig uklart. En nylig undersøgelse viste, at Pax6 fremmer cellevækst ved at aktivere MET tyrosinkinasereceptor genet i pancreascarcinom [13]. I lunge kræftceller, er ERK1 /2 signal pathway involveret i MET-vejen [32]. Vores fund viste, at ERK1 /2 blev aktiveret ved Pax6-ekspression. For at vi formoder, at Pax6 aktiverer MAPK signalering og fremmer cellecyklusprogression via MET gentranskription i lungekræft

Pax6 er primært udtrykt under embryogenese.; ringe eller ingen Pax6-protein detekteres i voksne væv [3]. Som Pax6 ofte udtrykkes i tumorer [9], bestemte vi Pax6 niveauet i primære lungekræft væv. Pax6 ekspressionsniveau i matchede tilstødende væv blev målt som en kontrol. Svarende til pankreatiske tumorer, Pax6-ekspression var stærkere i lungekræft væv end i tilstødende væv. Den nontumorous væv-forholdet cancer-til-nabostillede Pax6-mRNA-ekspression for hver enkelt blev beregnet. Kun 3-forhold var mindre end 1, og de fleste af forholdene var meget mere end 100. Alle disse resultater viste, at Pax6 fungerede som en onkogen faktor i lungekræft.

Konklusioner

I denne undersøgelse, vi rapporterer, at øget ekspression af Pax6 blev bemærket i primære lungekræft væv. Pax6 fremmes cellevækst ved at aktivere MAPK signalering og fremskynde cellecyklusprogression. Endvidere Pax6 reguleres G1-S progression ved at inducere cyclin D1-ekspression og pRB phosphorylering. Vores data tyder på, at Pax6 er en ny potentielt mål i lungekræft.

Tak

Forfatterne vil gerne takke Meng Gu for assistance med prøver kollektion.