PLoS ONE: MicroRNA-302a Undertrykker tumorcelleproliferation ved at hæmme AKT i prostatakræft

Abstrakte

Micro (mi) RNA er vigtige regulatorer er involveret i forskellige fysiske og patologiske processer, herunder kræft. Den miRNA-302 familie er blevet dokumenteret som spiller en afgørende rolle i carcinogenese. I denne undersøgelse undersøgte vi rollen af ​​miRNA-302a i prostatacancer (PSA). MiRNA-302a udtryk blev påvist i 44 PCA væv og 10 normale prostata væv, og deres klinisk-patologisk betydning blev analyseret. Celledeling og cellecyklus-analyse blev udført på PCA-celler, der stabilt udtrykte miRNA-302a. Målet gen af ​​miRNA-302a og nedstrøms vej blev yderligere undersøgt. Sammenlignet med normale prostata væv, blev miRNA-302a udtryk nedreguleret i PCA væv, og var endnu lavere i PCA væv med et Gleason score ≥8. Overekspression af miRNA-302a induceret G1 /S cellecyklusstandsning i PCA-celler, og undertrykte PCa celleproliferation både in vitro og in vivo. Desuden, miRNA-302a inhiberer

AKT

udtryk ved direkte binding til dets 3 utranslateret område, hvilket resulterer i efterfølgende ændringer af

AKT-GSK3p-cyclin D1

AKT-p27

Kip1

vej. Disse resultater afslører miRNA-302a som en tumor suppressor i PCa, hvilket tyder på, at miRNA-302a kan anvendes som et potentielt mål for terapeutisk intervention i PCa

Henvisning:. Zhang GM, Bao CY, Wan FN, Cao DL , Qin XJ, Zhang HL, et al. (2015) MicroRNA-302a Undertrykker tumorcelleproliferation ved at hæmme

AKT

i prostatakræft. PLoS ONE 10 (4): e0124410. doi: 10,1371 /journal.pone.0124410

Academic Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, KINA

Modtaget: Oktober 21, 2014 Accepteret: 13 Marts 2015; Udgivet: 29 April, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (Grant nr NSFC 81.202.003) (https://www.nsfc.gov.cn . /) og Science Foundation of Shanghai Municipal Kommissionen for sundhed og familieplanlægning (Grant nr 2.010.145) (https://www.wsjsw.gov.cn/wsj/) til GHS

Konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

som den mest udbredte malignitet blandt mænd i de udviklede lande [1], prostatakræft (PCA) ligeledes viser en støt stigning i forekomsten i Kina i løbet af de seneste årtier. Ifølge de kinesiske Cancerregisteret Årsrapport (2012), har PCa blevet den sjette mest almindelige kræftform og den niende hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald hos mænd, især i byområderne [2]. Derudover op til 70% af patienter med PCa har metastaser på diagnosetidspunktet, hvilket resulterer i dramatisk reduceret langtidsoverlevelse [3]. Der er derfor tvingende nødvendigt at udforske de mekanismer, som PCa generation og progression er indledt.

Voksende data viser, at microRNA (miRNA), en form for endogen, små ikke-kodende RNA, deltage i forskellige cellulære processer. Gennem specifikt at binde og spalte mRNA’er eller inhibering deres oversættelse [4,5], miRNA funktion som enten onkogener eller tumorsuppressorer [6]. Den miRNA-302 familie blev første gang identificeret i humane embryonale stamceller (hESCs) og humane embryonale carcinomaceller i 2004. Siden da har forskellige undersøgelser af miRNA-302 familien med fokus på dens potentielle rolle i reprograming somatiske celler i induceret pluripotente stamceller samt embryonale selvfornyelse [7]. Adskillige transkriptionsfaktorer, som udtrykkes tidligt i kræft stamceller udvikling og vedligeholdelse, såsom

Oct4

,

Sox2

, og

Nanog

, blev fundet afgørende for den transkriptionelle regulering af miRNA-302 familien [8]. Interessant Fareh et al. viste, at stabil ekspression af miRNA-302 var i stand til at fremkalde tab af

Oct4

,

Sox1

, og

Nanog

[9]. Rollen af ​​miRNA-302 i tumorigenese har været debatteret for nylig, da modstridende konklusioner er tegnet af forskellige forskergrupper. For eksempel blev endogen miRNA-302 ikke påvist i cervicale cancerceller, og ektopisk ekspression af miRNA-302 inhiberede celleproliferation og tumordannelse [10]. I modsætning hertil transfektion af miRNA-302b i Colon kræftceller resulterede i en øget evne til koloni-dannelse, invasion, og migration in vitro [11]. Men til dato er blevet udført få studier for at undersøge den mulige rolle af miRNA-302 i PSA.

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at sammenlignet med normale prostata væv, PCA væv udtrykte lavere miRNA-302a niveauer, og miRNA-302a-ekspression blev omvendt forbundet med Gleason score (GS). Vi viser også, at overekspression af miRNA-302a i PCA-celler kan inducere cellecyklusstandsning og inhibere celleproliferation in vitro og tumordannelse in vivo. Desuden har vi identificeret

AKT

som et mål gen hvorigennem miRNA-302a udøver sin hæmmende rolle i PSA.

Materialer og metoder

Patient prøver

PCa væv og godartet prostata væv blev opnået fra vævet bank på Fudan University i Shanghai Cancer center. Klinisk-patologisk funktioner i disse patienter blev hentet fra Urologisk afdeling database. Undersøgelsen Protokollen blev godkendt af Institutional Research Review Board på Fudan University i Shanghai Cancer Center og underskrevet informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere.

Cell kultur

Menneskelig PCA cellelinjer, humane embryonale nyre 293T-celler (HEK293T) og normale prostata epitelceller (RWPE-1) blev købt fra Institut for Cell Research af det kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Folkerepublikken Kina). LNCaP og 22Rv1, PC-3, DU145, og HEK293T celler blev dyrket i RPMI 1640 medium, F-12K-medium, MEM-medium, og DMEM-medium, henholdsvis alle suppleret med 10% føtalt bovint serum. RWPE-1-celler blev dyrket i K-SFM medium suppleret med ekstrakt fra bovin hypofyse og human rekombinant epidermal vækstfaktor. Celler blev dyrket ved 37 ° C ved 5% CO

2.

RNA, miRNA ekstraktion, og kvantitativ real-time polymerasekædereaktion

Totalt RNA blev isoleret fra dyrkede celler og tumor væv under anvendelse af Trizol-reagens. Første streng cDNA blev syntetiseret under anvendelse af RevertAid First Strand cDNA-syntese kit (Life teknologi, Carlsbad, CA), som derefter blev anvendt til real-time polymerasekædereaktion (PCR) sammen med forward og reverse primere og Power SYBR Green PCR Master Blande.

β-actin

blev anvendt som en intern kontrol for

AKT

transkriptniveauer. Primersekvenserne var som følger:

AKT

-forward: GGGTTTCTCCCAGGAGGTTT, omvendt: GTCCATGGTGTTCCTACCCA; β-actin-forward: ACCGAGCGCGGCTACAG, omvendt:. CTTAATGTCACGCACGATTTCC

Ifølge producentens anvisninger, miRNA fra væv og celler blev ekstraheret ved hjælp af Mirvana miRNA isolation kit (Life teknologi, Carlsbad, CA), og ekspressionsniveauerne af miRNA-302a blev opdaget af TaqMan miRNA assays (Life teknologi, Carlsbad, CA), ved hjælp af U6 lille nukleare RNA som en intern kontrol.

Vector konstruktion, lentivirus produktion, og celle transfektion

den modne HSA-miRNA-302a-sekvens blev syntetiseret og introduceret i PLKO.3G vektoren til frembringelse PLKO.3G-mIR-302a. En AKT restaurering vektor blev konstrueret ved at indføre

AKT

CDS, som blev forstærket fra PC-3 cDNA i pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP vektor. Den luciferase-3 utranslaterede region (UTR) reporter vektor blev genereret gennem konstruere

AKT

3UTR, der bærer en formodet miRNA-302a bindingssted i vektor MT01. Alle konstruerede vektorer blev bekræftet ved sekventering.

PLKO.3G-MIR-302a blandet med psPAX2 og PMD2-G blev transficeret i HEK293T celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol . Otteogfyrre timer senere, lentivirus blev høstet og anvendt til at inficere PC-3 og DU145 celler. Dernæst blev cellerne sorteres ved flowcytometri (Beckman Coulter, Brea, CA) til at etablere stabile cellelinier konstitutivt udtrykker miRNA-302a (PC-3-302a og DU145-302a celler).

luciferaseassays

Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne lyseret med 50 pi passiv lysebuffer. Dernæst blev en dual-luciferase-assay udført som anvist af producenten (Promega, Madison, WI). Forholdet mellem ildflue at Renilla luciferaseaktivitet blev anvendt til at udtrykke luciferaseaktiviteter. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

Protein høst og western blot

Totalproteiner blev høstet under anvendelse af CelLytic ekstraktionssæt (Roche, Basel, Schweiz) indeholdende proteaseinhibitorer og derefter kvantificeret under anvendelse af BCA Protein analysereagenskit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ifølge producentens instruktioner. Efter adskillelse proteiner under anvendelse af natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese blev protein overført til polyvinyliden fluorid membraner og derefter blokeret i 5% fedtfrit mælk. Under anvendelse af de primære antistoffer og anti-kanin knyttet til peberrodsperoxidase (1: 5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) som det andet antistof, blev målproteinerne probet og derefter visualiseret ved anvendelse af ECL PlusWestern Blotting System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

β-actin

var brug som en loading kontrol. De primære antistoffer omfattede følgende:

AKT Hotel (1: 1000), phosphoryleret

AKT

(

Pakt

)

(Ser473) Hotel (1: 500 ),

GSK3p Hotel (1: 500),

pGSK3β (Ser9) Hotel (1: 500),

cyclin D1 Hotel (1: 1000),

p27

Kip1 Hotel (1: 1000),

PI3K Hotel (1: 1000), (Cell Signaling Technology, Boston, MA) og

β-actin

(1: 2000). (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX)

celledeling og cellecyklus analyser

CCK-8 og Edu-analyser blev udført for at detektere celleproliferation. Kort fortalt blev CCK-8-assays udført som følger: celler blev podet i en 96-brønds plade ved en koncentration på 1 x 10

4 celler /brønd. Efter adhærens, blev cellerne dyrket i frisk medium blandet med CCK-8 (10: 1) (Dojindo, Shanghai, Kina) i 2 timer, før absorbansen blev målt med en mikropladelæser ved 450 nm. For edu assays blev celler inkuberet i edu-opløsning (1: 5000) i 2 timer, derefter blev høstet og farvet under anvendelse af Cell-Light edu Apollo 643 In vitro Flowcytometri Kit (Ribobio, Guangzhou, Kina), i henhold til producentens anvisninger . Cellerne blev derefter analyseret ved flowcytometri

En celle cyklus assay blev også udført ved anvendelse af flowcytometri:. Kort fortalt blev cellerne fikseret med 75% kold ethanol natten over og derefter vasket med phosphatbufret saltvand. Dernæst blev propidiumiodid (50 ug /ml) indeholdende RNase tilsat til cellerne til DNA-farvning før flowcytometrianalyse.

Kolonidannelse assay

isolerede celler blev podet i 60 mm plader ved en koncentration på 500 celler /brønd og derefter inkuberet i 5% CO

2 ved 37 ° C. Tyve dage senere blev cellerne farvet med 0,5% krystalviolet i 30 minutter. Colony numre i hver plade blev talt ved hjælp af et omvendt mikroskop.

In vivo tumorgenicitet

PLKO.3G-Scr-transficerede PC-3-celler (PC-3-Scr celler) og PC 3-302a celler blev injiceret subkutant i enten bageste flanke af samme 4-6 uger gamle BALB /c nøgne mus, der blev indkøbt fra Shanghai SLAC Laboratory Animals Co, Ltd (Shanghai, Kina). Tumorstørrelser blev målt ved anvendelse skydelære mindst tre gange om ugen. Musene blev aflivet med CO

2 på dag 44. Tumor volumen blev beregnet og tumor vægt blev målt efter aflivning. Tumorer blev derefter opdelt i to dele, hver del fikseret med 10% formalin eller konserveret i -80 ° C. Forsøgene dyr blev udført med godkendelse af Animal Studies etiske komité for Fudan University Shanghai Cancer Center.

Immunhistokemi

Immunhistokemi (IHC) farvning af paraffinindlejrede prøver blev udført som beskrevet tidligere [ ,,,0],12]. Kort fortalt, kanin-anti-

AKT

antistof og anti-muse /kanin peberrodsperoxidase-mærket antistof (Univ-bio, Shanghai, Kina) blev anvendt som den primære og det andet antistof, henholdsvis.

statistiske analyser

forskellen mellem kontinuerlige variabler blev analyseret ved hjælp af Students

t

-test eller variansanalyse. Tosidet

P

-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-version 20.0 (IBM Corporation, NY).

Resultater

miRNA-302a udtryk undertrykkes i PCA væv og er lavere med højere GS

PCa væv blev erhvervet fra i alt 44 mandlige patienter med en gennemsnitsalder på 67 år (range, 49 til 77 år) med nydiagnosticerede, patologisk bekræftet PSA. Blandt dem, havde 32 patienter fik radikal prostatektomi og 12 patienter havde modtaget transuretral resektion af prostata. Patologisk bekræftede normale prostata væv blev erhvervet fra 10 mandlige patienter med blærekræft, som havde fået radikal cystektomi. De kliniske og patologiske træk af alle patienter er beskrevet i S1 tabel.

Vi har detekteret miRNA-302a ekspressionsniveauerne i 44 PCA væv og 10 normale prostata væv og fundet, at sammenlignet med normale prostata væv, PCA væv udtrykte lavere niveauer af miRNA-302a (fig 1A). Derudover analyserede vi sammenhængen mellem miRNA-302a niveauer og klinisk-patologiske træk i PCA patienter. Der var ingen signifikant sammenhæng observeret mellem miRNA-302a niveauer og alder, prostata-specifikke antigen niveauer, eller klinisk fase (S1 tabel). sammenligning af miRNA-302a ekspressionsniveauerne i forskellige PCA væv viste imidlertid, at ekspressionen af ​​miRNA-302a faldt betydeligt, når GS 7 (figur 1B). Kollektivt, vi postulere, at nedregulering af miRNA-302a udtryk kan spille en vigtig rolle i PCa progression.

(A) miRNA-302a-ekspression nedreguleret i PCa væv sammenlignet med den normale prostata væv. (B) miRNA-302a udtryk var lavere i PCA væv med GS 7 sammenlignet med dem med GS = 7. (C) Lavere niveauer af miRNA-302a udtryk blev påvist i fire humane PCA cellelinjer sammenlignet med normale prostata epitelceller. (D) Høje niveauer af miRNA-302a udtryk blev påvist i PCA celler stabilt udtrykker miRNA-302a (*

P

0,05).

Overekspression af miRNA-302a hæmmer PCa cellevækst in vitro og in vivo

for at undersøge funktionen af ​​miRNA-302a i PCa, vi målte udtryk for miRNA-302a i fire humane PCA cellelinier (LNCaP, 22Rv1, PC-3, og DU145) og normale prostata-epitelceller (RWPE-1) ved kvantitativ realtids-PCR. Som vist i fig 1C, der var lavere ekspression af miRNA-302a i alle fire cellelinjer sammenlignet med RWPE-1-celler. Fordi vi spekuleret på, at overekspression af miRNA-302a kan inhibere PCa cellevækst, vi stabilt overudtrykt miRNA-302a i PC-3 og DU145 celler, hvilket er bekræftet ved kvantitativ revers-transkriptase (QRT) -PCR (Fig 1D).

CCK-8, EDU og kolonidannende analyser blev udført for at undersøge, om miRNA-302a overekspression påvirket PCa celledeling in vitro. Som vist i figur 2, var der en signifikant lavere (

P

0,05) vækstrate i PC-3-302a og DU145-302a celler sammenlignet med kontrollerne. Flowcytometrisk analyser viste, at de procentdele af Edu-positive celler i både PC-3-302a og DU145-302a celler var lavere end i kontrollerne. Desuden sammenlignes med kontrollerne, både PC-3-302a og DU145-302a celler udviklet færre kolonier på det 20. og 15. dage. Derfor In vitro forsøg viser, at miRNA-302a udøvede en suppressiv rolle i PCa celleproliferation.

A CCK-8 assay blev udført for at måle proliferation i (A) PC-3 og (B) DU145 celler. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± standardafvigelse af den optiske densitet (OD) værdi detekteret ved 450 nm fra tre uafhængige forsøg. Celleproliferation blev påvist i (C) PC-3 og (D) DU145 celler under anvendelse edu assay analyseres ved flowcytometri. (E, F) kolonidannelse analyser angivet færre kolonier i miRNA-302a overekspression PCA celler. (*

P

0,05).

For yderligere at validere vores observationer i vivo, PC-3-Scr celler og PC-3-302a celler blev injiceret i venstre og højre bageste flanke af fem nøgne mus hhv. Tumorvolumener blev målt ved anvendelse skydelære på forskellige tidspunkter efter inokulering, og tumorvægte blev målt efter aflivning. Både volumen og masse var især lavere i PC-3-302a tumorer end i PC-3-Scr tumorer (

P

0,05, Fig 3). Taget sammen var indlysende celleproliferation inhibering observeret efter overekspression af miRNA-302a i PCA-celler.

PC-3-GFP-celler og PC-3-302a celler blev injiceret i venstre og højre bageste flanke af BALB /c nøgne mus, henholdsvis (A, B). Tumoren volumen (C) og masse (D) i PC-3-302a gruppe var især lavere end i PC-3-GFP-gruppe. (*

P

0,05).

Overekspression af miRNA-302a inducerer cellecyklusstop i PCA celler

Nu hvor væksthæmning blev observeret i PCA celler udførte vi cellecyklus analyse for at undersøge, om overekspression af miRNA-302a resulterede i cellecyklus ændringer. Som vist i figur 4, er andelen af ​​celler i G1-fasen steg markant i PC-3-302a celler, mens andelen af ​​celler i S-fase var betydelig mindre end i kontrolgruppen. Analoge resultater blev observeret i DU145-302a celler, hvilket tyder på, at miRNA-302a effektivt inducerer G1 /S cellecyklusstop i PCA celler.

Andelen af ​​celler i G1-fasen steg betydeligt i PC-3-302a celler (A, C) og DU145-302a celler (B, D) sammenlignet med kontroller, mens andelen af ​​celler i S-fase var betydelig mindre end kontrollerne. (* P 0,05).

miRNA-302a undertrykker

AKT

udtryk ved direkte målrette sin 3UTR

For at opdage de molekylære mekanismer, som miRNA- 302a udøver sine posttranskriptionel regulerende funktioner, vi brugte bioinformatik algoritmer (https://www.targetscan.org) for at søge mulige målgener, og fandt, at 3UTR af

AKT

mRNA huser en bevaret bindingssted for miRNA-302a. Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​

AKT dele på mRNA og protein niveau i PC-3-302a og DU145-302a celler og kontrol. Som vist i figur 5A og 6, sammenlignet med kontroller,

AKT

udtryk faldt betydeligt i PC-3-302a og DU145-302a celler, på både mRNA og protein niveau. Desuden

AKT

udtryk i PC-3-302a tumorer var signifikant lavere end i PC-3-Scr tumorer, som bestemt ved real-time PCR og IHC-farvning (Fig 5B og 5C). Disse resultater tyder på, at

AKT

udtryk nedreguleres af miRNA-302a i PSA.

AKT

mRNA ekspression blev bemærkelsesværdigt undertrykt i (A) PC-3-302a og DU145 -302a celler og (B) PC-3-302a tumorer (fem uafhængige tumorer blev opdaget). (C) Immunhistokemi farvning indikeret lavere udtryk for

AKT

i PC-3-302a tumorer. (D) Relativ luciferaseaktivitet blev især undertrykt i vildtype

AKT

-3 utranslaterede område (UTR) transfekterede celler. (E) Skematisk afbildning af luciferase reporter, der har transporteret vildtype eller mutant

AKT

3 ‘UTR. (* P 0,05).

Western blot-analyser viste nedreguleret AKT, phosphoryleret AKT (Pakt) og cyklin D1 niveauer, og opreguleret GSK3p, pGSK3β og p27

Kip1 niveauer i miRNA-302a overudtrykkende PCA celler. PI3K niveauer blev ikke påvirket.

For at teste, om miRNA-302a regulerer

AKT

ved direkte binding til dets 3UTR, en luciferase reporter vektor indeholdende det humane

AKT

3UTR som bar vildtype-miRNA-302a bindende sekvens blev subklonet. En luciferase vektor, der bærer det muterede 7-bp region komplementær til 5 frø region af miRNA-302a blev genereret som kontrol reporter (Fig 5E). Sammenlignet med den kontrol, blev den relative luciferaseaktivitet undertrykt med 36% (

P

0,05) i vildtype

AKT

3UTR transfekterede celler (Fig 5D). Derfor miRNA-302a hæmmer PCA celler via direkte rettet mod

AKT

.

miRNA-302a induceret cellecyklus ændringer i PCA celler ved at hæmme

AKT-GSK3p-cyclin D1

og

AKT-p27

Kip1

veje

for yderligere at vurdere effekten af ​​miRNA-302a på

AKT

signalvejen, opdaget vi udtryk for opstrøms (

PI3K

) og nedstrøms (

GSK3p

,

cyklin D1

p27

Kip1

)

AKT

effektorer ved western blot. Desuden blev niveauet af phosphoryleret AKT (Pakt) og pGSK3β også undersøgt. Sammenlignet med de tilsvarende kontrol celler, både GSK3p og pGSK3

β

niveauer, samt p27

Kip1 niveauer, var især forhøjet, mens Pakt og cyklin D1 især blev reduceret i miRNA-302a transficeret PC-3 og DU145 celler. Men udtryk for

PI3K

var ikke påvirket af miRNA-302a transfektion (Fig 6). For yderligere at bekræfte disse resultater, vi restaureret

AKT

udtryk ved forbigående transfektion af en

AKT

ekspressionsvektor bærer

AKT

CDS i PC-3-302a og DU145-302a celler (opkaldt PC-3-AKT-CDS og DU145-AKT-CDS henholdsvis). Som angivet i figur 7, efter restaurering af AKT-ekspression, både GSK3p og p27

Kip1 niveauer blev reduceret, mens cyclin D1-ekspression ikke blev reddet i både PC-3-Akt-CDS og DU145-Akt-CDS-celler. I betragtning af de kritiske roller

AKT-GSK3p-cyclin D1 og AKT-p27

Kip1

signalveje i cellecyklus overgang, vores resultater tyder på, at miRNA-302a kan fremkalde G1 /S cellecyklusstop i PCA celler ved samtidig hæmme

AKT-GSK3p-cyclin D1

og

AKT-p27

Kip1

vej, og dermed undertrykke PCa celle spredning.

Western blot analyser viste reddet udtryk for AKT, og hæmmet udtryk for GSK3p og p27

Kip1 niveauer ved AKT restaurering. Imidlertid blev cyclin D1 niveauet ikke reddet.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi observeret, at miRNA-302a blev nedreguleret i PCA væv. Yderligere analyser viste lavere udtryk i PCA væv med GS ≥8 end dem med GS 8. Overekspression af miRNA-302a induceret G1 /S anholdelse i PCA celler, og bemærkelsesværdigt undertrykt PCa celledeling in vitro og in vivo. Desuden

AKT

blev afsløret som en direkte og funktionel målgen af ​​miRNA-302a.

Gennem det seneste årti, de fleste forskning med miRNA-302 har fokuseret på sin rolle i hESCs, som er karakteriseret ved selv-fornyelse og pluripotens. Undersøgelser analysere miRNA-302 funktion i carcinogenese er begrænsede og usammenhængende. Lin et al. fandt, at miRNA-302 kunne inhibere tumorigenicitet og inducere apoptose i human brystcancer MCF7-celler, embryonal teratocarcinomaceller Tera-2-celler, og hepatocellulær carcinoma HepG2-celler [13]. Tilsvarende blev celleproliferation undertrykt i cervikal cancer Hela og SiHa-celler, samt hepatocellulært carcinom SMMC-7721 celler, via cellecyklusregulering [10,14]. Men Zhu et al. observeret en omvendt fænomen i colon cancerceller: overekspression af miRNA-302b førte til forøget kolonidannende evne in vitro [11]. Den augmented kolonidannelse evne blev ligeledes valideret i cancer stamceller fra hoved og hals pladecellekræft [15]. For første gang, afslørede vi undertrykt miRNA-302a udtryk i PCA væv sammenlignet med normale prostata væv, og lavere udtryk i PCA væv med højere GS. Derfor spekulerer vi, at miRNA-302a kan spille en vigtig rolle i PCa udvikling og progression.

I vores undersøgelse, blev der observeret en inhiberende virkning af miRNA-302a på celleproliferation i PCA PC-3 og DU145 celler, gennem hindrer G1 til S faseovergang, som anses som en vigtig hændelse under celleproliferation. Efter aftale med tidligere undersøgelser [8,10,14], fandt vi også bemærkelsesværdig nedregulering af

cyklin D1

i miRNA-302a overekspression PCA celler. Interessant er miRNA-302 forudsagt til at målrette mange cellecyklus regulatorer. For eksempel, Lin et al. viste, at miRNA-302 samtidigt undertrykt både

cyklin E-CDK2

cyklin D-CDK4 /6

signalveje [13], og dette mål blokering blev reguleret af flere transkriptionelle faktorer, såsom

Oct4

Sox2

[8]. Men Card et al. rapporterede, at miRNA-302a fremmet en stigning i S-fase og et fald i G1-fasen i hESCs, skønt

cyclin D1

blev også undertrykt [8]. Det er klart, yderligere forskning belyse de nøjagtige mekanismer af miRNA-302 funktion er nødvendig.

Vores observationer at overekspression af miRNA-302a i PCA-celler induceret cellevækstinhiberingen in vitro og in vivo tyder på, at miRNA-302a kan post- transkriptionelt regulere en drejelig gen, som er involveret i celleproliferation. Som en vigtig onkogen,

AKT

påvirker en lang række fysiologiske funktioner, herunder metabolisme, proliferation, overlevelse, angiogenese, migration og invasion [16]. Ligeledes

AKT

blev bevist at køre PCa dannelse in vivo [17]. Vores resultater viser, at miRNA-302a undertrykte spredning og tumorgenicitet af PCA celler gennem

AKT-GSK3p-cyclin D1

og

AKT-p27

Kip1

vej, og ved direkte at binde 3UTR af

AKT

. Desuden udtryk for

PI3K

, som er principal opstrøms effektor af

AKT

har også vist vigtige i PCa udvikling, blev ikke påvirket af miRNA-302. Den regulatoriske rolle af miRNA-302 i

AKT

blev også demonstreret af Cai et al: efter miRNA-302S transfektion i livmoderhalskræft celler, de observerede forhøjede udtryk for cyclinafhængige kinase hæmmere

p27

Kip1

og

p21

Cip1

, sammen med nedreguleret

AKT

niveauer. Desuden har de også vist, at

cyclin D1

er et andet mål gen af ​​miRNA-302S, som tegnede sig for vores observation, at cyclin D1 udtryk ikke blev reddet efter AKT restaurering [10]. Derfor som et mål af miRNA-302,

AKT

blev især undertrykt og fremkaldte ændringer i mange nedstrøms signalveje.

Vores resultater også give visse fingerpeg med hensyn til miRNA-målrettede kræftbehandling. Tidligere undersøgelser har vist, at nogle specifikke miRNA ofte blev overudtrykt i tumorer, mens de fleste miRNA blev nedreguleret [18,19]. Global miRNA undertrykkelse blev fundet at øge carcinogenese i både in vitro og in vivo modeller [20], der fremhæver de protumorigenic virkninger efter miRNA tab af funktion. Liang et al. observeret et sensibiliserende rolle af miRNA-302 substitutionsterapi i brystkræftceller for ioniserende stråling [21]. En anden nylig undersøgelse rapporteret, at viral levering af lad-7 miRNA kunne inhibere tumorvækst i en mus lungeadenocarcinom model [22]. Ligeledes vores resultater valideret hæmmende effekt af miRNA-302a udskiftning i PCA celler. Tilsammen disse undersøgelser tyder på, at overekspression af selv en enkelt miRNA i cancerceller kan give betydelige terapeutiske fordele.

Sammenfattende vores undersøgelse viser, at miRNA-302a er afgørende for PCa cellevækst ved at regulere G1-S-fasen overgang. MiRNA-302a udtryk undertrykkes i PCA væv, og er endnu lavere i PCA væv med højere GS. Derudover gennem direkte binding til sine 3UTR, miRNA-302a inhiberer

AKT

udtryk, hvilket resulterer i efterfølgende ændringer i

AKT-GSK3p-cyclin D1

AKT-p27

Kip1

veje. Selv om det er klart, at miRNA-302a deltager i PCa, er yderligere undersøgelser nødvendige for at forklare de præcise mekanismer bag sin rolle i PCa progression, og dermed bestemme dens potentielle værdi som biomarkør og /eller mål for terapeutisk intervention.

Støtte oplysninger

S1 Table. Demografiske og klinisk-patologiske karakteristika 44 patienter med prostatakræft (PCA)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0124410.s001

(DOCX)

anerkendelser

Forfatterne takker vores institutionelle medlemmer, især Dr. Sheng-Lin Huang til teknisk bistand.