PLoS ONE: miR-135b Fremmer Cancer Progression ved Målretning Transforming Growth Factor Beta receptor II (TGFBR2) i kolorektal cancer

Abstrakt

transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) signalvejen er en tumor-suppressor vej, der er almindeligt inaktiveret i kolorektal cancer (CRC). Inaktivering af TGFBR2 er den mest almindelige genetiske begivenhed, der påvirker TGF-β-signalvejen. Men den mekanisme, ved hvilken cancerceller nedregulerer TGFBR2 er uklar. I denne undersøgelse fandt vi, at de TGFBR2 protein niveauer konsekvent blev opreguleret i CRC væv, mens dens mRNA-niveauer varierede i disse væv, hvilket tyder på, at en post-transkriptionel mekanisme er involveret i reguleringen af ​​TGFBR2. Fordi microRNA (miRNA) er stærke post-transkriptionelle regulatorer af genekspression, vi udførte bioinformatik analyser for at søge efter miRNA, der potentielt er målrettet TGFBR2. Vi identificerede den specifikke målretning site af MIR-135b i 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af TGFBR2. Vi yderligere identificeret en omvendt korrelation mellem niveauerne af MIR-135b og TGFBR2 protein, men ikke mRNA, i CRC vævsprøver. Ved overekspression eller silencing MIR-135b i CRC-celler, vi eksperimentelt valideret, at MIR-135b direkte binder til 3′-UTR af TGFBR2 transkriptet og regulerer TGFBR2 ekspression. Desuden blev de biologiske konsekvenser af målretningen af ​​TGFBR2 af MIR-135b undersøgt under anvendelse af in vitro celleproliferation og apoptose-assays. Vi viste, at miR-135b udøvede en tumor-fremmende effekt ved at inducere spredning og hæmme apoptose af CRC celler via den negative regulering af TGFBR2 udtryk. Tilsammen vores resultater giver det første beviser til støtte rolle miR-135b som et onkogen i CRC via hæmning af TGFBR2 oversættelse

Henvisning:. Li J, Liang H, Bai M, Ning T, Wang C , Fan Q, et al. (2015) miR-135b Fremmer Cancer Progression ved Målretning transformerende vækstfaktor Beta receptor II (TGFBR2) i kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (6): e0130194. doi: 10,1371 /journal.pone.0130194

Academic Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: 9. februar 2015; Accepteret: 16 maj 2015; Udgivet: 10 juni 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (nr 81.201.946, 81.372.394, 81.250.044, 81.401.257), Undervisningsministeriet forskningsfonden for ph.d. program (nr 2012202120013), Science Foundation of Medical University of Tianjin (No.2011KY15), National Research platform for Klinisk Evaluering teknologi til nye anticancer narkotika (nr 2013ZX09303001). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er i dag den tredje mest almindelige malignitet og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Ophobningen af ​​genetiske og epigenetiske ændringer medierer CRC dannelse og progression ved at deregulere centrale signalveje i cancerceller [2,3]. I CRC, en af ​​de mest almindeligt inaktiveret signalveje er transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) signalvejen, som er blevet forbundet med etablering og progression af intestinale neoplasmer [4].

TGF β-signalvejen spiller en vigtig rolle i mange cellulære processer, herunder cellecyklusregulering, cellemigrering, apoptose, og immunmodulation via to beslægtede transmembrane serin /threoninkinase-receptorer, type i og type II serin /threoninkinase-receptorer [5]. TGF-β-signalering initieres, når liganden binder til type II-receptoren, som efterfølges af dimeriseringen af ​​type II-receptoren med type I receptoren. Inden for denne heteromerkompleks, type II receptor phosphorylerer og aktiverer type I receptoren kinase, der udbredes signalet ved at målrette nedstrøms komponenter af denne vej [6]. TGF-β-signalvejen virker som et tumor-suppressor i den tidlige fase af CRC, som ofte inaktiveres via nedregulering af TGFBR2 [7]. En reduktion af TGFBR2 ekspressionsniveauer har været forbundet med forøget tumorigenicitet i en række humane tumorer, herunder CRC [8]. Inaktivering af TGBR2 skyldes genetisk ændring eller promotor-methylering er blevet rapporteret i esophageal, gastriske og prostatacancer [9-11]. Inaktivering af TGFBR2 skyldes genetisk mutation eller methylering blev rapporteret til primært forekomme i mikrosatellit-ustabilt CRC grund af DNA mismatch reparation defekter [12-14]. Dog tumorer udviser mikrosatellit ustabilitet kun udgør 10-15% af alle CRC sager [15]. Mekanismen underliggende ikke-mismatch repair-mangelfuld CRC er stadig uklar. Disse observationer antyder, at andre molekylære mekanismer kan være involveret i nedregulering af TGFBR2; denne hypotese kræver yderligere undersøgelser.

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små ikke-kodning, enkeltstrengede RNA, som spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​genekspression ved post-transkriptionelle niveau [16-18 ]. Nylig dokumentation har vist, at miRNA kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorer ved at undertrykke cancerrelaterede gener [19]. Ændringer af miRNA udtryk er blevet observeret i en række humane tumorer, herunder CRC [20,21]. Nogle af disse miRNA har tiltrukket særlig opmærksomhed på grund af deres involvering i indledningen, progression, og metastase af menneskelige kræftformer [22,23]. For eksempel er MIR-143 og MIR-145 (MIR-143/145) nedreguleret i mange typer af cancer, herunder CRC [24,25]. Endvidere blev det rapporteret, at MIR-143/145 virker som tumorsuppressorer via inhibering af KRAS oversættelse i human CRC [26-28]. Disse resultater understreger behovet for en dybtgående søgen efter miRNA, der er afvigende udtryk under kolorektal carcinogenese og behovet for en intensiv undersøgelse af deres rolle i tumor biologi.

Selv om deregulering af TGFBR2 og miRNA er forbundet med tumorigenese i human CRC, lidt om hvilke miRNA handle på TGFBR2. I denne undersøgelse, vi hypotese, at TGFBR2 er et mål for miR-135b. Efter måling ekspressionsniveauerne af miR-135b og TGFBR2 i CRC væv og parret noncancerous væv, vi har registreret en omvendt korrelation mellem miR-135b og TGFBR2 udtryk i CRC. Endvidere i denne undersøgelse, vi eksperimentelt bekræftede direkte regulering af TGFBR2 af MIR-135b og den biologiske rolle MIR-135b-medieret regulering af TGFBR2 ekspression i human CRC.

Materialer og Metoder

Menneskelig væv

CRC væv og parrede tilstødende noncancerous væv blev opnået fra patienter, der gennemgår kirurgiske indgreb på Tilknyttede Gulou Hospital i Nanjing Universitet (Nanjing, Kina). Både tumoren og noncancerous væv blev udsat for histologisk analyse til diagnostisk bekræftelse. Den patologiske type af hver kræft blev identificeret som adenocarcinom. Skriftligt samtykke blev leveret af alle de patienter eller deres værger, og den etiske komité i The First Affiliated Hospital i Anhui Medical University godkendt alle aspekter af denne undersøgelse. Vævsfragmenter blev straks nedfrosset i flydende nitrogen ved tidspunktet for kirurgi og blev opbevaret ved -80 ° C. De kliniske karakteristika for de patienter er anført i S1 tabel.

Cell kultur

De humane CRC cellelinjer HT-29 og SW-480 blev købt fra Shanghai Institute of Cell Biology af den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). HT-29 og SW-480-celler blev dyrket i RPMI-1640-medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gibco) i en fugtig inkubator ved 37 ° C i 5% CO

2.

RNA-isolering og kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra de dyrkede celler og væv under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Assays at kvantificere modne miRNA blev udført under anvendelse TaqMan miRNA prober (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt, 1 ug totalt RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af AMV-revers transkriptase (Takara, Dalian, Kina) og en hårnåle-RT-primer (Applied Biosystems). Reaktionsbetingelserne var som følger: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 minutter og 85 ° C i 5 minutter. Real-time PCR blev udført under anvendelse af et TaqMan PCR kit og en Applied Biosystems 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Reaktionerne blev inkuberet i en 96-brønds optisk plade ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Alle reaktionerne blev udført tre gange. Efter reaktionerne var fuldstændige, blev tærsklen cyklus (C

T) data indsamlet ved hjælp af faste tærskel indstillinger, og den gennemsnitlige C

T blev bestemt fra tredobbelte PCR. En sammenlignende metode C

T blev brugt til at sammenligne hver udskrift til kontrollerne. U6 snRNA blev anvendt som en intern kontrol, og den relative mængde af miRNA normaliseret til U6 snRNA niveauer blev beregnet ved hjælp af formlen 2

-ΔΔCT, hvor ΔΔC

T = (C

T miRNA – C

T U6)

target – (C

T miRNA – C

T U6)

kontrol

for at kvantificere de TGFBR2 og GAPDH mRNA niveauer, 1 ug total. RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af oligo d (T) 18-primere (Takara) og Thermoscript revers transkriptase (Invitrogen). Reaktionsbetingelserne var som følger: 42 ° C i 60 min og 70 ° C i 10 minutter. Real-time PCR blev dernæst udført på RT produkt, SYBR Green farvestof (Invitrogen) og specifikke primere til TGFBR2 eller GAPDH. Sekvenserne for primerne var som følger: TGFBR2 sense: 5′-GTAGCTCTGATGAGTGCAATGAC-3 ‘; TGFBR2 antisense: 5’-CAGATATGGCAACTCCCAGTG-3 ‘; GAPDH sense: 5’-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 ‘; og GAPDH antisense: 5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 ‘. Reaktionerne blev inkuberet ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 1 min. Efter reaktionerne blev afsluttet, C

T-værdier blev bestemt ifølge en fast tærskelværdi. Den relative mængde af TGFBR2 mRNA blev normaliseret til GAPDH mRNA-niveau.

miRNA overekspression

miRNA overekspression blev opnået ved transfektion af celler med en miRNA mimic, som er et syntetisk RNA oligonukleotidduplex efterligner miRNA precursor-sekvens. Syntetiske RNA-molekyler, herunder pre-miR-135b og en kodet negativ kontrol-RNA (præ-miR-kontrol), blev købt fra GenePharma (Shanghai, Kina). HT-29 og SW-480-celler blev podet på plader med 6 brønde og transficeret ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) den følgende dag, når cellerne var ca. 70% sammenflydende. For miRNA overekspression eksperimenter blev 100 pmol af præ-MIR-135b anvendes. Efter 6 timer blev mediet af HT-29 og SW-480-celler ændret til RPMI-1640-medium suppleret med 2% føtalt bovint serum. Cellerne blev høstet ved 24 timer eller 48 timer efter transfektion til isolering af total RNA eller protein.

Plasmidkonstruktion og siRNA effektivitet assay

En mammal ekspressionsplasmid (preceiver-M98 -TGFBR2) designet til specifikt at udtrykke den åbne læseramme i fuld længde (ORF) af humant TGFBR2 uden mIR-135b-responsive 3′-UTR blev indkøbt fra FulenGen (Guangzhou, Kina). En tom plasmid tjente som en negativ kontrol. Den siRNA sekvens (5′-GATTCAAGAGTATTCTCACTT-3 ‘) rettet mod human TGFBR2 blev designet og syntetiseret af Ribobio (Guangzhou, Kina). En scrambled siRNA (Ribobio) blev anvendt som en negativ kontrol. Overekspressionen plasmid eller siRNA blev transficeret i HT-29 under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Totalt RNA eller protein blev isoleret 24 timer eller 48 timer efter transfektion. De TGFBR2 mRNA og protein ekspressionsniveauer blev vurderet via kvantitativ RT-PCR og Western blot, henholdsvis.

Luciferase reporter assay

Hele 3′-UTR af human TGFBR2 blev amplificeret via PCR under anvendelse af human genomisk DNA som en template. PCR-produkterne blev derefter indsat i pMIR-RAPPORT plasmid (Ambion, Austin, TX, USA). Den vellykkede indføring af denne sekvens blev bekræftet via DNA-sekventering. Til bedømmelse bindingsspecificitet blev sekvenserne, der interagerer med frøet regionen MIR-135b muterede (fra AGCUAUG til UCGAUAC for MIR-135b-bindingssted), og mutanten TGFBR2 3′-UTR blev indsat i et tilsvarende luciferasereporterplasmid. For luciferase reporter assays, blev HT-29 og SW-480-celler podet på 24-brønds plader og co-transficeret med 0,8 pg af ildflue-luciferase reporter plasmid, 0,8 pg af β-galactosidase (β-gal) ekspressionsplasmidet (Ambion ), og lige store mængder (20 pmol) af mIR-135b mimic eller en kodet negativ kontrol-RNA under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen). Den β-gal-plasmid blev anvendt som en transfektionseffektivitet kontrol. Cellerne blev høstet 24 timer efter transfektion og blev underkastet luciferaseaktiviteten assay under anvendelse af et luciferase-assay kit (Promega, Madison, WI, USA).

Protein isolation og Western blot

Celler eller væv blev lyseret i RIPA-lysepuffer (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,25% natriumdeoxycholat og 1 mM EDTA, pH 8,0) indeholdende frisk tilsatte protease inhibitor cocktail (Roche) for 30 min på is og blev derefter centrifugeret ved 16.000 x g ved 4 ° C i 10 minutter. Supernatanten blev opsamlet, og proteinkoncentrationen blev beregnet under anvendelse af et BCA proteinassaykit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Proteinerne blev separeret via SDS-PAGE (Bio-Rad). Efter elektroforese blev proteinerne elektrooverført til PVDF-membraner (Bio-Rad) og derefter blokeret med 5% skummetmælk i 1 time. Membranerne blev derefter inkuberet i primære antistoffer ved 4 ° C i 12 timer. Efter tre vaske i TBST blev membranerne inkuberet i en peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Efter tre vaske blev membranerne inkuberet i SuperSignal West Pico kemiluminescens-substrat (Pierce). Den samme membran blev probet med en GAPDH antistof for at tjene som en loading kontrol. Antistofferne mod TGFBR2 og GAPDH blev erhvervet fra Santa Cruz Biotechnology (sc-400 og sc-365.062, fig Santa Cruz, CA, USA). Salg

Celleproliferationsassay

HT-29-celler blev podet med 5 x 10

4 celler per brønd på plader med 96 brønde og derefter inkuberet natten over i RPMI-1640 suppleret med 10% FBS. Cellerne blev opsamlet ved 12, 24, 36, 48 eller 60 timer efter transfektion. Efter transfektion blev 10 pi Cell Counting Kit-8-opløsning (CK04-500, Dojindo) tilsat til de tilsvarende testede brønde og inkuberet i 1 time. Absorbansen blev målt ved en bølgelængde på 450 nm. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

apoptoseassays

apoptose af HT-29-celler blev vurderet ved anvendelse af et Annexin V-FITC /propidiumiodid (PI) farvning assay. HT-29-celler blev dyrket i plader med 12 brønde og transficeret med præ-MIR-135b, anti-MIR-135b, TGFBR2 siRNA, eller TGFBR2 overekspression plasmid til at fremkalde apoptose. Pre-MIR-kontrol, anti-MIR-kontrol, kontrol siRNA, og en kontrolgruppe plasmid tjente som negative kontroller. Cellerne blev dyrket i 24 timer i serum-depleteret medium; derefter den vedlagte og flydende celler blev høstet. Flowcytometrisk analyse af de apoptotiske celler blev udført under anvendelse af et Annexin V-FITC /PI-farvning kit (BD Biosciences, CA, USA). Efter vask med kold PBS blev cellerne resuspenderet i bindingspuffer (100 mM HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, og 25 mM CaCl

2), efterfulgt af farvning med Annexin V-FITC /PI ved stuetemperatur i mørke i 15 minutter. De apoptotiske celler blev derefter evalueret ved slusning af PI-og Annexin V-positive celler under anvendelse af en fluorescens-aktiveret celle-sortering (FACS) flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

Desuden blev kerner farvet med DAPI for at evaluere morfologiske ændringer i apoptotiske celler. Kort fortalt, efter transfektion og kultur i 24 timer i serum-udtømte medium, blev HT-29-celler farvet med DAPI i 15 minutter ved 37 ° C under 5% (v /v) CO2. Efter vask med kold PBS og fiksering i 4% (v /v) formalin, celler blev undersøgt under anvendelse af et Olympus IX81 mikroskop (200 x) udstyret med X-CITE belysning fluorescens (Serie 120Q; blå fluorescens). Omfanget af apoptose blev kvantificeret ved at beregne forholdet mellem kondenseret til total kerner. Resultater blev vist fra data fra tre uafhængige forsøg med 3 tilfældige mikroskopiske felter fra hver prøve. Condensed kerner i den mikroskopiske område blev talt.

Statistisk analyse

Alle de Western blot og spredning assay billeder er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. De kvantitative RT-PCR og luciferase reporter assays blev udført tre gange, og hver enkelt forsøg blev gentaget flere gange. Resultaterne er præsenteret som middelværdier ± SE af mindst tre uafhængige forsøg. De observerede forskelle blev anset for at være signifikant ved p 0.05 baseret på t-test.

Resultater

opregulering af TGFBR2 protein, men ikke mRNA, i CRC væv

Vi først bestemmes udtrykket mønstre af TGFBR2 i human CRC væv. Efter måling af proteinniveauer i TGFBR2 i fem parrede CRC og normale tilstødende væv, fandt vi, at de TGFBR2 proteinniveauer drastisk blev reduceret i CRC væv sammenlignet med de normale tilstødende væv (Fig 1A og 1B). Selv om TGFBR2 proteinet blev konsekvent nedreguleret i CRC væv, de TGFBR2 mRNA-niveauer var ikke signifikant forskellig mellem de cancerøse og noncancerous væv (Fig 1C). Denne forskel mellem proteinet og mRNA ekspressionen af ​​TGFBR2 i CRC tyder stærkt på, at en post-transkriptionel mekanisme er involveret i reguleringen af ​​TGFBR2.

(A og B) Western blot analyse af TGFBR2 protein niveauer i fem parret CRC og normale tilstødende væv (NAT) prøver. A: repræsentativt billede; B: kvantitativ analyse. (C) Kvantitativ RT-PCR-analyse af de TGFBR2 mRNA-niveauer i fem parrede CRC og NAT vævsprøver. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

Identifikation af bevarede miR-135b target sites inden for 3′-UTR af TGFBR2

Tre beregningsmæssige algoritmer, Targetscan [29], Miranda [30] og PicTar [31 ], blev anvendt i kombination til at identificere potentielle miRNA, der er målrettet TGFBR2. Alle tre algoritmer forudsagde miR-135b som en regulator af TGFBR2. De forudsagte interaktioner mellem miR-135b og målområderne i 3′-UTR af TGFBR2 er illustreret i fig 2A. Et forudsagt hybridisering blev observeret mellem MIR-135b og 3′-UTR af TGFBR2. Der var perfekt komplementaritet mellem frøet region (kernesekvensen, der omfatter de første 2-8 baser af det modne miRNA) og den formodede målsekvens. Den mindste frie energi værdien af ​​hybridisering mellem miR-135b og TGFBR2 var -20,7 kcal /mol, hvilket er godt inden for området af ægte miRNA målgruppen par. Endvidere blev miR-135b bindende sekvenser i TGFBR2 3′-UTR højt konserveret på tværs af arter. Således blev miR-135b udvalgt til yderligere eksperimentel verifikation af dets binding til TGFBR2.

(A) Skematisk af de hypotetiske dobbelthuse dannet af samspillet mellem de bindingssteder i TGFBR2 3′-UTR (øverst) og mIR-135b (nederst). Den forudsagte frie energi værdien af ​​denne interaktion er angivet. De steder frø anerkendelse betegnes, og alle nukleotider i disse regioner er stærkt konserverede over adskillige arter, herunder menneske, mus og rotte. (B) Kvantitativ RT-PCR-analyse på MIR-135B niveauer i fem parrede CRC og NAT vævsprøver. (C) Pearsons korrelation scatter plot af folden skift af miR-135b og TGFBR2 protein i humane CRC væv. (D) Pearsons korrelation scatter plot af folden skift af miR-135b og TGFBR2 mRNA i humane CRC væv. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

Identifikation af en omvendt korrelation mellem miR-135b niveauer og de TGFBR2 protein niveauer i CRC væv

miRNA er generelt menes at vise ekspressionsmønstre, der er modsat de deres mål [16-18]. Interessen for forholdet mellem miR-135b og TGFBR2 blev også støttet af den nylige identifikation af denne miRNA som kandidat onkogen og TGFBR2 som en tumor suppressor i CRC [2,32]. Derefter undersøgte vi, om MIR-135B-niveauer omvendt korreleret med TGFBR2 protein ekspressionsniveauer i CRC væv. Efter bestemmelse af miR-135b i fem parrede CRC og normale tilstødende væv, fandt vi, at udtrykket niveau af miR-135b blev øget betydeligt i CRC væv (Fig 2B). Den inverse korrelation mellem miR-135b og TGFBR2 protein niveauer (Fig 2C) og forskellen mellem miR-135b og TGFBR2 mRNA-niveauer (Fig 2D) blev yderligere illustreret ved hjælp af Pearsons korrelation scatter plots. Disse resultater indikerede, at MIR-135b ekspressionsniveau omvendt korrelerer med TGFBR2 protein ekspressionsniveau i humane CRC væv. Således blev TGFBR2 bestemt til at være en miR-135b mål baseret på både beregningsmæssige forudsigelser og den inverse korrelation mellem niveauerne af miR-135b og TGFBR2 protein, men ikke mRNA, i CRC.

Validering af TGFBR2 som en direkte mål for miR-135b

sammenhængen mellem miR-135b og TGFBR2 udtryk blev undersøgt yderligere ved at evaluere TGFBR2 udtryk i humane CRC cellelinjer HT-29 og SW-480 efter overekspression og knockdown af miR-135b . I disse eksperimenter blev MIR-135b overekspression opnået ved transfektion HT-29 og SW-480-celler med præ-MIR-135b, som er et syntetisk RNA-oligonukleotidet, der efterligner MIR-135b forstadium; henviser MIR-135b knockdown blev opnået ved transfektion af celler med anti-MIR-135b (kemisk modificerede antisense-oligonukleotider designet til specifikt at målrette modne MIR-135b). Den effektive overekspression eller knockdown af miR-135b demonstreres i fig 3A. Det er klart, blev cellulære MIR-135B niveauer signifikant forøget, når HT29 og SW480-celler blev transficeret med præ-MIR-135b og faldt dramatisk, når HT29 og SW480-celler blev behandlet med anti-MIR-135b. Ekspressionen af ​​TGFBR2 protein blev signifikant inhiberet af indførelsen af ​​præ-MIR-135b i HT29 (Fig 3B) og SW480 (fig 3C) celler, mens anti-MIR-135b forøgede signifikant TGFBR2 proteinniveauet i HT29 (Fig 3B) og SW480-celler (fig 3C). For at bestemme det niveau, hvor miR-135b regulerer TGFBR2 udtryk, vi gentog ovennævnte eksperimenter og undersøgt ekspressionen af ​​TGFBR2 mRNA efter transfektion. Den overekspression eller knockdown af miR-135b påvirkede ikke mRNA stabilitet TGFBR2 (Fig 3D). Disse resultater viste, at MIR-135b regulerer specifikt TGFBR2 ekspression på post-transkriptionel niveau, som er den mest almindelige mekanisme af animalsk miRNA handling.

(A) Kvantitativ RT-PCR-analyse på MIR-135B niveauer i HT-29 og SW-480 celler behandlet med røræg pre-miR-kontrol, præ-miR-135b, anti-miR-kontrol eller anti-miR-135b. (B og C) Western blot-analyse af TGFBR2 proteinniveauer i HT-29 og SW-480-celler behandlet med præ-MIR-kontrol, præ-MIR-135b, anti-MIR-kontrol eller anti-MIR-135b. B: repræsentativt billede; C: kvantitativ analyse. (D) Kvantitativ RT-PCR-analyse af de TGFBR2 mRNA-niveauer i HT-29 og SW-480-celler behandlet med præ-MIR-kontrol, præ-MIR-135b, anti-MIR-kontrol eller anti-MIR-135b. (E) Direkte binding af TGFBR2 3′-UTR til miR-135b. HT-29 og SW-480-celler blev co-transficeret med et ildflueluciferase reporter indeholdende enten vildtype (WT) eller mutant (Mut) MIR-135b bindingssteder i TGFBR2 3′-UTR og enten før MIR-kontrol eller præ-mIR-135b. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne vurderes under anvendelse af et luciferase-assay kit. Resultaterne vises som forholdet mellem ildflue-luciferase-aktivitet i de MIR-135B-transficerede celler til at i kontrolcellerne. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001.

For at afgøre, om de negative regulatoriske virkninger af miR-135b på TGFBR2 udtryk blev medieret af binding af miR-135b til de forudsagte mål sites i 3′-UTR af TGFBR2 mRNA, fuldlængde 3′-UTR af TGFBR2 indeholdende den forudsagte mIR-135b-bindingssted blev indsat nedstrøms for ildflue-luciferase-genet i et reporterplasmid. Det resulterende plasmid blev cotransficeret ind i HT-29 og SW-480-celler med en transfektionskontrol plasmid (β-gal) og enten før MIR-135b eller en kodet negativ kontrol-RNA. Som forventet blev luciferaseaktiviteten markant reduceret i cellerne transficeret med præ-MIR-135b. Endvidere har vi introduceret punktmutationer i de tilsvarende komplementære sites i 3′-UTR af TGFBR2 at forstyrre de forudsagte MIR-135B bindingssteder. Denne muterede luciferase reporter var upåvirket af overekspression af miR-135b (fig 3E). Dette fund antydede, at den formodede miRNA bindende steder af TGFBR2 stærkt bidrage til denne miRNA-mRNA-interaktion, der formidler den post-transkriptionel repression af TGFBR2 udtryk. Afslutningsvis vores resultater viste, at MIR-135b direkte binder til 3′-UTR af TGFBR2 mRNA-transkript at undertrykke TGFBR2 ekspression i CRC-celler.

MIR-135b fremmer proliferation og inhiberer apoptose af CRC-celler ved at målrette TGFBR2

Vi analyserede næste de biologiske konsekvenser af miR-135b-drevet undertrykkelse af TGFBR2 udtryk i CRC celler. Vi først undersøgt, om overekspression eller nedregulering af TGFBR2 påvirker HT-29-celleproliferation og apoptose. At vælte TGFBR2 udtryk, blev siRNA sekvens rettet mod forskellige steder af humant TGFBR2 cDNA designet og transficeret ind HT-29 celler. At overudtrykke TGFBR2 blev et plasmid, der udtrykker den TGFBR2 ORF transficeret til HT-29-celler. Den effektive overekspression af TGFBR2 demonstreres i fig 4A og 4B. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at TGFBR2 hæmmer celledeling [3], HT-29 celler, hvor TGFBR2 udtryk blev slået ned ved hjælp siRNA tilvækst på et betydeligt højere sats, mens cellerne transfekteret med TGFBR2 overekspression plasmid udstillet væsentligt reduceret proliferation (Fig 4C og 4D). Tilsvarende HT-29 celler, i hvilke TGFBR2 ekspression blev slået ned med siRNA udviste signifikant øget apoptose, hvorimod de transficeret med TGFBR2 overekspression plasmid udviste reduceret apoptose (fig 4E).

(A og B) Western blot-analyse de TGFBR2 proteinniveauer i HT-29-celler behandlet med scrambled kontrol siRNA, TGFBR2 siRNA, kontrol vektor eller TGFBR2 vektor. A: repræsentativt billede; B: kvantitativ analyse. (C) CCK8 celle levedygtighed analyser udførtes 12, 24, 36, 48 og 60 timer efter transfektion af HT-29-celler med enten scrambled kontrol siRNA eller TGFBR2 siRNA. (D) spiredygtighed CCK8 celle analyser udførtes 12, 24, 36, 48 og 60 timer efter transfektion af HT-29-celler med enten kontrol vektor eller TGFBR2 vektor. (E) Apoptosis assays blev udført efter transfektion af HT-29-celler med scrambled kontrol siRNA, TGFBR2 siRNA, kontrol vektor eller TGFBR2 vektor. Venstre panel: repræsentativt billede; højre panel: kvantitativ analyse. * P 0,05; ** P 0.01.

Vi analyserede næste de biologiske konsekvenser af miR-135b-medieret undertrykkelse af TGFBR2 udtryk i CRC celler. Til støtte for den opfattelse, at miR-135b fungerer som en nøgle proto-onkogen miRNA [32], HT-29 celler transficeret med præ-miR-135b udstillet øget spredning; i modsætning hertil knockdown af MIR-135b havde den modsatte virkning på celleproliferation (Fig 5A). Endvidere sammenlignet med celler transficeret med præ-MIR-135b, cellerne co-transficeret med præ-MIR-135b og TGFBR2 overekspression plasmid udviste en signifikant reduceret proliferationshastighed (fig 5F), hvilket antyder, at MIR-135b-resistent TGFBR2 ekspression reddet undertrykkelse af TGFBR2 ekspression ved mIR-135b og svækkede pro-proliferative effekt af mIR-135b.

(A) CCK-8 cellelevedygtighedsassays udførtes 12, 24, 36, 48 og 60 timer efter transfektion af HT-29 celler med præ-miR-kontrol, præ-miR-135b, anti-miR-kontrol eller anti-miR-135b. (B-E) Apoptosis assays blev udført 24 timer efter transfektion af HT-29-celler med præ-MIR-kontrol, præ-MIR-135b, anti-MIR-kontrol eller anti-MIR-135b. B: repræsentativ procentdel af apoptotiske HT-29 celler under anvendelse af flow cytometrisk analyse; C: repræsentativ procentdel af apoptotiske HT-29 celler under anvendelse af DAPI-farvning; D: repræsentativ billede ved hjælp flowcytometrianalyse; C: repræsentativt billede af apoptotiske HT-29 celler under anvendelse af DAPI-farvning. * P 0,05; ** P 0,01. (F) CCK-8 cellelevedygtighedsassays udførtes 12, 24, 36, 48 og 60 timer efter transfektion af HT-29-celler med scrambled kontrol miRNA og kontrolvektoren, den krypterede kontrol miRNA og TGFBR2 vektoren, præ- mIR-135b og kontrolvektoren, eller præ-mIR-135b og TGFBR2 vektoren. (GJ) Apoptosis assays blev udført 24 timer efter transfektion af HT-29-celler med scrambled kontrol miRNA og kontrolvektoren, den krypterede kontrol miRNA og TGFBR2 vektoren, præ-MIR-135b og kontrolvektoren, eller præ-miR -135b og TGFBR2 vektoren. G: repræsentativ procentdel af apoptotiske HT-29 celler under anvendelse af flow cytometrisk analyse; H: repræsentativ procentdel af apoptotiske HT-29 celler under anvendelse af DAPI-farvning; I: repræsentativ billede ved hjælp flowcytometrianalyse; J: repræsentativt billede af apoptotiske HT-29 celler under anvendelse af DAPI-farvning. * P 0,05; ** P 0.01.

Vi undersøgte effekten af ​​miR-135b på CRC-celle apoptose via flowcytometrisk analyse og DAPI farvning. Resultaterne viste, at procentdelen af ​​apoptotiske celler var signifikant lavere blandt de HT-29 celler transficeret med præ-MIR-135b, men var højere blandt HT-29-celler transficeret med anti-MIR-135b (fig 5B, 5C, 5D og 5E ). Endvidere, når HT-29-celler blev samtidig transficeret med præ-MIR-135b og TGFBR2 overekspression plasmid, anti-apoptotiske virkning af MIR-135b blev dramatisk svækket (fig 5G, 5H, 5I og 5J). Disse resultater indikerede, at MIR-135b kan modulere celle apoptose ved at nedregulere TGFBR2 i CRC-celler.

Discussion

TGF-β-signalvejen spiller en kompleks rolle i ondartet udvikling af tumorer, og dens virkninger, såsom vækstinhibering, apoptose, differentiering og andre TGF-p-regulerede processer, synes at være kontekstafhængig [33]. TGFBR2 ekspression er nødvendig for TGF-β signalering at regulere specificiteten af ​​dens signalvej aktivering og dens biologiske virkninger [34].