PLoS ONE: Fænotypisk skævvridning af makrofager in vitro ved udskilte faktorer fra kolorektal cancer Cells

Abstrakt

Makrofager er celler med mange vigtige funktioner i både medfødte og adaptive immunrespons og har vist sig at spille en kompleks rolle i tumorprogression idet de huser både tumor forebyggelse (M1 makrofager) og tumorfremmende (M2 makrofager) aktiviteter. I mange humane cancere, har infiltrerende makrofager blevet forbundet med en dårlig patient prognose, og foreslog derfor at være overvejende af en M2-fænotype. Imidlertid har vi og andre tidligere vist, at øget makrofag densitet i kolorektal cancer (CRC) i stedet er korreleret med en forbedret prognose. Det er et interessant spørgsmål, hvis de forskellige roller af makrofager spilles i forskellige kræftformer kunne forklares med variationer i balancen mellem M1 og M2 makrofag attributter, drevet af tumor- eller organspecifikke faktorer i tumormikromiljøet enkelte kræftformer. Her har vi udnyttet en

in vitro

cellekultur system makrofag differentiering at sammenligne forskelle og ligheder i fænotypen (morfologi, antigen-præsentation, migration, endocytose, og udtryk af cytokin og kemokin gener) mellem M1 /​​M2 og tumor aktiverede makrofager (TAMs), der kunne forklare den positive rolle, makrofager i CRC. Vi fandt, at udskilte faktorer fra CRC-celler inducerede TAMer af en “blandet” M1 /​​M2 fænotype, hvilket kan bidrage til en “god inflammatorisk respons”. Dette antyder, at re-uddannelse af makrofager kan give mulighed for vigtige terapeutiske fremskridt i behandlingen af ​​kræft hos mennesker

Henvisning:. Edin S, Wikberg ML, Rutegård J, Oldenborg PA, Palmqvist R (2013) Fænotypisk skævvridning af makrofager

In vitro

af udskilte faktorer fra Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 8 (9): e74982. doi: 10,1371 /journal.pone.0074982

Redaktør: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italien

Modtaget: Marts 12, 2013; Accepteret: August 13, 2013; Udgivet: 18 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Edin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra den svenske Cancer Society (www.cancerfonden.se) (Grant ingen CAN 2011/839, Palmqvist.); Svensk Forskningsråd (Grant nr B03488901, Palmqvist.) (Www.vr.se); Banebrydende forskning Grant fra County Council of Västerbotten, Sverige (Grant nr VLL-132.981, Palmqvist.); Cancer Research Foundation i Nordsverige (Grant nr AMP 10-655, Edin.) (Www.cancerforskningsfonden.se); og Tore Nilssons Fond (Edin) (www.torenilssonsstiftelse.nu). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tumoren mikromiljø spiller flere komplekse og vigtige roller i tumor progression [1]. I det seneste årti har en hovedfokus i kræftforskning været på betydningen af ​​den inflammatoriske tumor mikromiljø, som efterfølgende har ført til inddragelse af tumor-fremmende inflammation og immun unddragelse som nye kendetegnende for kræft [2]. En øget forståelse af immunsystemet contexture – dvs. placeringen, tæthed og funktionel orientering af immunceller, og hvordan dette påvirker tumorprogression kan give vigtige redskaber til forudsigelse af patientens prognose samt udviklingen af ​​nye behandlingsstrategier [3]

arbejdet med inflammation i human cancer har resulteret i identifikation af komponenter i immunsystemet, som kan være både gavnlige og skadelige for patienten prognose. Én sådan komponent er makrofagerne i det medfødte immunsystem. Makrofager har vist sig at være meget plastik celler, der kan vise både tumor forhindrer (M1 makrofager) og tumor fremme funktioner (M2 makrofager) anmeldt i [4], [5]. Kort fortalt er klassisk aktiverede M1 makrofager understøtter adaptive immunrespons og målrette smitstoffer og beskadigede eller ændrede celler. De er karakteriseret ved en forøget ekspression af antigenpræsenterende molekyler (f.eks MHC klasse II), co-stimulerende receptorer for lymfocytter (fx CD86 og CD40), såvel som en række pro-inflammatoriske cytokiner (f.eks IL6, IL12, IL23 og TNF), og er rapporteret at have mikrobicid og tumordræbende aktivitet. Alternativt aktiverede M2 ​​makrofager er engageret i sårheling og i vedligehold af vævshomeostase og hovedrengøring og udtrykker høje niveauer af mønster anerkendelse receptorer (f.eks Mannose receptor (MR) og scavenger receptorer (f.eks CD163). Men mange af funktionerne i M2 makrofager kan faktisk være pro-tumorigen, da de stimulerer celleproliferation, vævsombygning, angiogenese og udviklingen af ​​en immunsuppressiv miljø ved sekretion af immun-undertrykkende cytokiner (f.eks IL10 og TGFp), som kan anvendes ved en voksende tumor til at invadere omgivende væv og spredes til fjerne organer [6]. M1 og M2 makrofager har distinkte kemokin profiler, der fører til den selektive rekruttering af immunceller, f.eks forskellige undergrupper af T-lymfocytter. Mens M1 makrofager hovedsageligt udtrykke CXCL9 og CXCL10 som rekrutterer lymfocytter af T hjælper type 1 (Th1) og cytotoksiske (TC) delmængder, M2 makrofager i stedet primært rekruttere lymfocytter af en regulerende fænotype (treg) og T-hjælper type (Th2) delmængder ved udskillelse af kemokiner CCL17, CCL22 og CCL24 [4], [5 ], [7]. Makrofager kan også differentieres i forskellige M2-lignende funktionelle tilstande, som er blevet dokumenteret både

in vitro

og

in vivo

, anmeldt i [4]. I virkeligheden, variationerne af makrofager med forskellige M1 eller M2 karakteristika synes at være uendelig. M1 og M2 makrofag fænotyper bør derfor ses som ekstreme funktionelle tilstande i et spektrum af makrofag phentoypes [8]. Imidlertid kan M1 og M2 klassifikation stadig anvendes til at identificere den vigtigste fænotype og funktion forskellige makrofag populationer. Makrofag fænotype styres af begivenheder i tumormikromiljøet, hvori det er fundet. Eksempler på makrofag polariserende begivenheder er sekretion af tumorafledte mediatorer, hypoksisk eller nekrotiske faktorer og vævsskader [9]. Makrofag fænotype er også påvirket af andre immunceller og stromale komponenter.

I humane cancere, har makrofaginfiltration ofte blevet korreleret til en dårligere prognose og derfor tumorassocierede makrofager er blevet foreslået at være hovedsageligt af en M2-fænotype [10] – [12]. Dette er imidlertid ikke tilfældet i alle cancerformer. I kolorektal cancer (CRC), har vi og andre vist, at et stort antal tumorassocierede makrofager er korreleret til en forbedret prognose [13] – [17]. Vi har yderligere studeret fordelingen af ​​M1 og M2 makrofag fænotyper i CRC. Vi fandt, at antallet af M1 og M2 makrofager blev stærkt korreleret. Patienter, der har et stort antal infiltrerende M1 makrofager, havde også høje antal infiltrerende M2 ​​makrofager, og en signifikant bedre prognose [18]. Betragtning af den høje plasticitet af makrofager, kan en mulig forklaring på den blandede population af M1 og M2 makrofager set i CRC være enten at tumor secernerede faktorer i CRC har potentiale til at udløse eller opretholde M1 makrofag funktioner, eller at de ikke kører M2 makrofag differentiering i samme omfang som i andre cancere, hvor makrofaginfiltration er klart skadeligt for patienten prognose.

Her har vi brugt en

in vitro

cellekultursystem at sammenligne fænotype (og funktioner) af tumor aktiverede makrofager (Tams) i CRC til at af de etablerede M1 og M2 makrofag fænotyper at få en bedre forståelse af, hvordan makrofag fænotype påvirkes af tumor udskilles faktorer og hvordan dette kan påvirke patientens udfald. Vi fandt, at udskilte faktorer fra CRC-celler ikke inducerede et komplet M1 eller M2 makrofagreaktion, men i stedet TAMer af en “blandet” M1 /​​M2 fænotype. Og selv om M1 og M2 makrofager fandtes at være let re-edjucated i den modsatte retning, secernerede faktorer fra CRC-celler var ude af stand til at skråtstille allerede er til stede M1 makrofager dybt M2 makrofager, men i stedet syntes at styrke M1 fænotype. Sammen kan dette bidrage til at skabe en “god inflammatorisk respons”, hvor tumor-undertrykkende funktioner makrofager dominerer.

Materialer og metoder

Etik Statement

Humane monocytter var fås fra buffy coats af anonyme raske bloddonorer, der havde givet deres informerede samtykke skriftligt (i henhold til lokale retningslinjer på Blood center, Umeå Universitetshospital). Ifølge den lokale videnskabsetisk komité (Regional Etisk Review Board i Umeå, Sverige) er etik godkendelse ikke forpligtet til at studere leukocytter isoleret fra buffy coats opnået fra anonyme bloddonorer (DNR 2012-327-31M).

Cell kultur

CRC cellelinier RKO, SW480 og Caco2 (ATCC) blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) i 37 ° C med 5% carbondioxid. Konditionerede medier fra CRC-cellelinier blev fremstillet ved at vaske cellerne i phosphatbufret saltvand (PBS), hvorefter cellerne blev dyrket til ca. 90% sammenflydning i RPMI suppleret med 10% FBS og antibiotika i 48 timer. Konditioneret medium blev opsamlet, centrifugeret ved 3000 rpm i 30 minutter og opbevaret i -80 ° C fryser indtil brug. Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) blev oprenset fra blod donor fibrinlag ved dextransedimentation og Fiqoll-Paque gradient-centrifugering. Monocytter blev yderligere oprenset fra PBMC’er enten med 1,5 timers vedhæftning efterfulgt af 2 vaske i varm PBS suppleret med 5% FBS, eller ved magnetisk cellesortering (MACS) ifølge producentens instruktioner (Miltenyi Biotec), hvilket resulterer i en population af monocytter på ca. 95% renhed. Oprensede monocytter blev dyrket i RPMI med 10% FBS og antibiotika suppleret med 20 ng /ml M-CSF, med mediet udskiftet hver anden dag. På dag 6 blev monocytter yderligere stimuleret i 40 timer ved tilsætning af 100 ng /ml LPS og 20 ng /ml IFNy (for M1 makrofager), eller 20 ng /ml IL4 eller IL10 (for M2 makrofager). For tumor aktiveret makrofag delmængder, monocytter var på dag 6 inkuberet i tumor konditionerede medier suppleret med 20 ng /ml M-CSF i 40 timer. Celler blev høstet og udsat for yderligere analyser. De differentierede makrofag fænotyper blev evalueret for hver buffy coat af flowcytometrisk analyser af ekspressionen af ​​M1 og M2 typiske markører. Celledød (apoptose /nekrose) blev reguleret med flowcytometri under anvendelse Annexin V /PI-farvning (Abcam) som anbefalet af producenten. EtOH blev tilsat ved en koncentration på 5% i 30 minutter som en positiv kontrol for celledød.

I morfologisk undersøgelse 8 × 10

6 oprensede mononukleære celler per brønd blev podet i 6-brønds dyrkningsplader, yderligere oprenset ved adhæsion, og differentieres til forskellige makrofag populationer, som beskrevet ovenfor. Levende fotografering blev taget med et DeltaPix Invenio 3S monteret på et Leitz Diavert mikroskop.

flowcytometrisk analyse

overflademarkør ekspression blev analyseret ved flowcytometri (BD FACS Calibur flowcytometer) under anvendelse R-phycoerythrin (R-PE) -konjugeret monoklonalt antistof mod CD14 (klon M5E2, BD Pharmingen) og CD1a (klon HI149, Immunotools); Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret monoklonalt antistof mod CD86 (klon FUN-1, BD Pharmingen), HLA-DR (klon MEM12, Abcam), og CD40 (klon 5C3, BD Pharmingen); Allophycocyanin (APC) -konjugeret monoklonalt antistof mod Mannose receptor (MR) (klon 15-2, Biolegend) og CD163 (klon 215.927, R Kemokiner PCR Array (PAH’er-150A, SABiosciences) i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Kort beskrevet blev totalt RNA isoleret fra forskellige cellepopulationer ved anvendelse af de NucleoSpin® RNA II kit (Macherey-Nagel). 1 ug totalt RNA blev behandlet med DNase og cDNA blev fremstillet under anvendelse af RT

2 First Strand kit. For hver analyse blev cDNA prøver blandet med RT

2 qPCR Master mix og fordelt over PCR-array med 96 brønde og cyklede med real-time PCR (ABI 7900HT, Applied Biosystems). Amplification data (fold-ændringer i C

t-værdier for alle gener) blev analyseret med SABiosciences software.

Statistik

Statistisk signifikans af forskelle blev vurderet ved brug 2-tailed studerende s

t

test. En

s

værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Tallene viser et gennemsnit på 3 uafhængige forsøg, medmindre andet er angivet. Fejl søjler indikerer standardafvigelse (SD).

Resultater

For at få en bedre forståelse for, hvordan tumoren som sådan påvirker fænotypen og funktion af makrofager i CRC, har vi brugt en

In vitro celle

dyrkningsmodel at studere interaktioner af differentierede perifert blod makrofager og CRC-cellelinier. I en

in vitro

indstilling kan klassisk aktiveret M1 makrofag fænotype opnås ved udsættelse for TLR ligander, såsom LPS og Th1 typiske cytokin IFNy. Alternativt aktiverede M2 ​​makrofager differentierer i mikromiljøer rige på Th2 typiske cytokiner (fx IL4 og IL13) og er undertiden benævnt sår helbredende makrofager. Som reaktion på immun-undertrykkende cytokiner (f.eks IL10) makrofager vedtage en M2-lignende immun-regulerende fænotype [4], [8].

Verifikation af M1 og M2 Makrofager populationer

Rensede monocytter blev differentieret til adhærente makrofager ved stimulering med cytokinet M-CSF i 1 uge og yderligere differentieret ved tilsætning af LPS og IFNy (for M1), og IL4 eller IL10 (for M2 makrofager). Som vist i figur 1A, M1 makrofager generelt vist en mere rund morfologi mens M2 makrofager var mere aflang. Makrofager drevet i nærværelse af M-CSF alene viste også en aflang morfologi mere ligner M2 fænotype, selvom mindre udtalt, at der for de forskellige populationer af M2 makrofager. Ser mere i detaljer på morfologi, IL4 stimuleret M2 makrofager viste den mest udtalte forlængelse, med særligt lange fremspring (figur 1A). IL10 stimulerede makrofager var mere ligner M-CSF stimulerede makrofager, med undtagelse af at være lidt mere vedhæftende. For at udelukke, at de morfologiske forskelle ses mellem M1 og M2 makrofager ikke var på grund af øget apoptose eller nekrose, vi analyserede bindingen af ​​Annexin V til celle overflade phosphatidylserin og samt propidium jod (PI) optagelse henholdsvis. Som vist i figur 1B, de forskellige makrofag fænotyper indeholdt rimelige lave niveauer af apoptotiske og nekrotiske celler. Når man ser på ekspressionen af ​​M1 eller M2 typiske markører ved flowcytometri blev M1 makrofager vist at udtrykke høje celleoverflade niveauer af MHC klasse II-receptor HLA-DR, samt T-celle co-stimulerende receptorer, CD86 og CD40, men lavere niveauer af de typiske M2 markører, CD163 og MR (figur 1C). M2 makrofager i stedet udtrykte høje niveauer af CD163 og MR, mens den viser lav ekspression af M1 markører (figur 1C). De to M2 populationer kunne yderligere skelnes ved, at IL4 stimulerede makrofager viste højere ekspression af MR, mens IL10 stimulerede makrofager udtrykte højere niveauer af CD163 (figur 1C). Endvidere blev alle makrofag undertyper fundet at typisk udtrykke monocyt /makrofag markør CD14 (figur 1C). CD1a, markøren for de dendritiske celler af monocytisk oprindelse, blev ikke udtrykt af en af ​​de makrofag populationer (data ikke vist).

(A) Morfologisk vurdering af makrofag fænotyper. (B) Apoptose og nekrose af makrofag populationer blev evalueret ved farvning med Annexin V og PI henholdsvis efterfulgt af flowcytometri. Vist er procent nekrotiske /apoptotiske celler (middel ± SD) fra tre uafhængige forsøg. (C) Ekspression af ekstracellulære markører for makrofag populationer som evalueret ved immunfarvning og flowcytometri. Relativ middelværdi flourescense intensitet (MFI) ± SD af tre eller flere uafhængige eksperimenter er vist, hvor hver prøve blev normaliseret mod dens respektive isotypekontrol. Relevante statistisk signifikante forskelle er angivet med * (p 0,05), ** (p 0,01), eller *** (p 0,001), ikke-signifikant

s Salg værdier er angivet med ns

Migration af M1 og M2 makrofager

for at undersøge, om tumor udskilles faktorer i en eller anden måde fortrinsvis rekruttere makrofager af en vis fænotype, vi kiggede på vandrende evne M1 og M2 makrofager i en

in vitro

cellemigrationsassay. Vi fandt, at M1 makrofager havde meget lav migreringsevnen dybt RPMI kontrolmedium, mens M-CSF stimulerede og M2 makrofager migrerede i retning medium alene (figur 2). Når så de forskellige subpopulationer af makrofager til at migrere mod konditioneret medier fra RKO eller SW480 CRC cellelinjer, fandt vi, at fortrinsvis IL4 stimulerede M2 ​​makrofager viste øget migration mod tumor konditionerede medier, hvilket antyder, at tumor udskilles faktorer helst rekruttere makrofager af en sårhelende fænotype (figur 2).

Migration af makrofag fænotyper blev evalueret ved Boyden kammer eksperimenter, hvor makrofager fik lov til at migrere til konditionerede medier fra RKO eller SW480 CRC cellelinjer, eller dyrkningsmedium kontrol (RPMI + 10% FBS) . Mean antal migrerende celler (n) ± SD er vist. Relevante statistisk signifikante forskelle er angivet med * (p 0,05), ikke-signifikant

s

værdier er angivet med ns

fænotype Tumor aktiverede makrofager (TAM’er)

morfologien og celleoverfladefænotype af TAM’er differentierede i nærvær af konditioneret medium fra RKO, SW480 eller Caco2 CRC cellelinjer blev analyseret i figur 3A og B, hhv. TAMs blev forlænget, således morfologien mere lignede M2 ​​makrofag populationer (Sammenlign figur 3A og 1A). Når man ser på ekspressionen af ​​M1 og M2 specifikke celleoverflademarkører, blev også fundet TAM’er at dele flere ligheder med M2 makrofager (figur 3B). Imidlertid TAM fænotypen var ikke så udtalt som for M2 makrofager, da den høje ekspression af enten MR (som i IL4 stimuleret M2 makrofager) eller CD163 (som i IL10 stimuleret M2 makrofager) ikke blev generelt set. Undtagelsen var makrofager aktiveret af konditionerede medier fra SW480-celler, som udviste en høj ekspression af MR svarende til den i IL4 stimulerede M2 ​​makrofager (figur 3B). Disse data tyder derfor på, at SW480 celler kan forvrænge makrofager i retning af en udtalt M2 fænotype, mens RKO eller Caco2 celler ikke inducerer større ændringer af M-CSF stimulerede makrofager, i hvert fald ikke ændringer, der blev opdaget her.

( A) Morfologisk vurdering af makrofager stimuleret med konditioneret medium (CM) fra RKO, SW480 eller Caco2 cellelinier. (B) Ekspression af ekstracellulære markører blev evalueret ved immunfarvning og flowcytometri i makrofager af M1 og M2 subtype eller i makrofager stimuleret med konditioneret medium (CM) fra CRC cellelinier. Relativ middelværdi flourescense intensitet (MFI) ± SD af tre eller flere uafhængige forsøg er vist, hvor hver prøve blev normaliseret mod dens respektive isotypekontrol og med M-CSF stimulerede kontrolprøve indstillet som 1.

endocytose Kapacitet M1 /​​M2 makrofager Befolkninger og TAMer

endocytiske funktionen af ​​de forskellige delmængder af M1 og M2 makrofager samt TAMs, blev også undersøgt i vores

in vitro

cellekultursystem . Celler blev differentieret i de forskellige makrofag fænotyper, og overvåges for deres evne til endocytose fluorescensmærket dextran. M1 makrofager viste sig at have en lavere endocytiske evne sammenlignet med M2 makrofager, ca. 20% for M1 sammenlignet med 50-100% for M2 makrofager, med IL10 stimulerede M2 ​​makrofager udviser den højeste endocytiske evne (figur 4). For at undersøge hvordan tumor secernerede faktorer påvirker makrofag endocytose, sammenlignet vi den for M1, M2 og TAM’er (figur 4). Denne analyse viste, at endocytose af FITC-dextran af TAMs mere lignede M2 ​​makrofager.

Endocytose af M1 og M2 makrofager, eller makrofager stimuleret med konditioneret medium (CM) fra RKO, SW480 eller Caco2 CRC cellelinier blev vurderet ved måling internalisering af FITC-dextran ved flowcytometri. Vist er procent relativ endocytose (middelværdi ± SD) med endocytose af IL10 stimuleret M2 makrofager sat til 100%. Statistisk signifikante forskelle er betegnet med * (p 0,05) eller ** (p 0,01). Alle andre forskelle blev testet, men fundet ikke-signifikant (ikke angivet i figuren).

makrofag Plasticitet

Makrofager vides at være plastik celler, der indfører forskellige former, afhængigt af faktorer i miljø, hvor de er fundet. Ved analyse plasticitet i vores

in vitro

cellekultursystem blev M1 og M2 makrofager faktisk vist sig at være meget plastik i naturen, da differentierede M1 makrofager kunne blive drevet i retning af en M2 fænotype, og vice versa, som evalueres ved morfologisk undersøgelse og udtryk for M1- og M2-typiske makrofagmarkører (Figur 5). Morfologien af ​​M1 makrofager, der modtog M2 stimuli blev vist at skifte til en mere aflang M2 udseende (figur 5A), selvom ikke fuldstændigt. På den anden side syntes M2 makrofager til hurtigere at indføre runde morfologi M1 makrofager, når de underkastes de modstående stimuli (figur 5A). Ved analyse ekspression af M1 og M2 markører, et skift mellem fænotyper var også tydelig, eftersom M1 typiske markører fandtes at være nedreguleret af M2-stimuli og omvendt (figur 5B). Det foreslås i litteraturen, at TAM’er er skæv af tumor udskilles faktorer i retning af en M2 fænotype [10] – [12]. Men det var ikke klart afspejlet i vores

in vitro

cellekultursystem, da en særskilt M2 befolkning ikke var generelt fremkaldt af udskilte faktorer fra CRC celler. På grund af den plast adfærd vises af makrofag befolkninger, søgte vi at undersøge, om differentierede M1 makrofager kunne blive påvirket af tumor udskilles faktorer. Men konditionerede medier fra CRC celler var ikke i stand til at skævt allerede differentierede M1 makrofager mod en M2 fænotype. I stedet konditionerede medier fra CRC-celler forøgede ekspressionen af ​​M1 markør CD86 og samtidig reducere den for M2 markør CD163, og derved syntes at styrke M1 fænotype (figur 5C). IL4 eller IL10 stimulerede M2 ​​makrofager blev ikke påvirket af udskilte faktorer fra CRC-celler (data ikke vist). Dette antyder, at tumor secernerede faktorer alene ikke er i stand til at flytte en etableret M1 makrofag fænotype mod en M2 fænotype i CRC.

Morfologien og ekspressionen af ​​ekstracellulære markører blev evalueret i makrofager af særskilte M1 eller M2 undertyper før og efter stimulering mod den modsatte fænotype eller stimulering med konditionerede medier (CM) fra RKO, SW480 eller Caco2 CRC cellelinier. (A) Morfologisk vurdering af makrofag fænotyper. (B) Ekspression af ekstracellulære markører for makrofag populationer som evalueret ved immunfarvning og flowcytometri. (C) Differentiering af M1 makrofager ved stimulering med konditionerede medier (CM) fra CRC cellelinier. Relativ middelværdi flourescense intensitet (MFI) ± SD af tre uafhængige forsøg er vist, hvor hver prøve blev normaliseret mod dens respektive isotypekontrol og med M1 eller M2 (IL10) stimulerede makrofag prøve sættes til 100%. Relevante statistisk signifikante forskelle er angivet med * (p 0,05), ikke-signifikant

s

værdier er angivet med ns

Cytokine Expression af M1 og M2 makrofager og TAM populationer

det er tydeligt, at den forenklede særskilte definition af M1 og M2 makrofager ikke gælder for alle makrofager i en

in vivo

indstilling. Men for at analysere forskelle, som skyldes tumor udskilte faktorer alene, vi igen udnyttet vores

in vitro

cellekultursystem at se på potentielle forskelle og ligheder mellem cytokin- og chemokin ekspressionsmønstre for M1 og M2 makrofager, eller TAM populationer. Til dette brugte vi en PCR-baseret cytokin og kemokin-genekspression array (resultater vist i detaljer i tabel S1). Udvalgte gener af interesse er vist i figur 6. Som forventet blev M1 makrofager fundet at udtrykke højere niveauer af de pro-inflammatoriske cytokiner, IL1, IL6, IL12, IL23 og TNF, som ikke blev udtrykt af M2 makrofager (figur 6A) . De immune regulatoriske cytokiner IL10 og TGFp var hovedsageligt udtrykt af M2 makrofager, især IL10-afledte M2-lignende immun-regulerende makrofager (figur 6A). Når man ser på den cytokin og chemokinekspression mønster i TAM’er var det klart, at hver CRC cellelinie inducerede et individuelt udtryk mønster. Ved sammenligning genekspressionsprofilen af ​​M1 og M2 makrofager, til den anden TAM’er blev TAM’er sig at udtrykke højere niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner end M2 makrofager, selv om det i de fleste tilfælde var meget lavere end for M1 makrofager. En undtagelse var TNF, som viste sig at blive udtrykt af TAM’er til samme niveau som for M1 makrofager. Den immun-regulerende kemokiner IL10 og TGFβ2 blev også udtrykt af forskellige TAMs, i nogle tilfælde i endnu højere grad end M2 makrofager. Vi søgte at undersøge forskellene i det kemotaktiske respons induceret af M1 eller M2 makrofager og TAM’er at forstå, hvordan tumoren i CRC påvirker makrofag inducerede rekruttering af andre immunceller (figur 6B). Når man ser på faktorer, der fortrinsvis rekrutterer lymfocytter af Th1-typen (f.eks CXCL9 og CXCL10), TAM’er stimuleret af konditioneret medium fra RKO eller Caco2 celler viste sig at udtrykke højere niveauer end M2 makrofager, men stadig meget lave mængder i sammenligning med ekspressionen af disse faktorer ved M1 makrofager. Den kemotaktiske faktor for neutrofiler CXCL2 [19] blev udskilt af TAM’er stimuleret med konditioneret medium fra SW480 celler. Dette tyder på, at selv om virkningerne var beskedne, nogle funktioner i M1 makrofager kan også findes i TAMer. Når man ser på faktorer, der rekrutterer lymfocytter af Treg og Th2 type (f.eks CCL17, CCL18, CCL22 og CCL24), som er udtrykt primært af M2 befolkning, blev disse fundet at ikke udtrykkes ved TAM’er, med undtagelse af CCL24 i TAM’er stimuleret af konditioneret medium fra SW480 celler. Dette antyder, at ikke alle M2 funktioner findes i TAM’er. Endelig har vi set på gener, der var mere højt udtrykt i TAM’er generelt, sammenlignet med i M1 eller M2 makrofager. Monocyt tiltrækker kemotaktisk faktor CCL2 viste sig at være højt udtrykt i alle TAM populationer. Også supplere protein C5 viste sig at være højt udtrykt i TAM’er i særdeleshed. Sammen dette tyder på, at tumor udskilles faktorer inducerer TAM’er af en “blandet” fænotype, med nogle funktioner, der er TAM specifikke og visse funktioner, der kan være lignende eller anderledes end i M1 eller M2 makrofager.

Gen-ekspression var undersøgt i M1 og M2 makrofager, eller makrofager stimuleret med konditioneret medium (CM) fra RKO, SW480 eller Caco2 CRC cellelinjer under anvendelse af en Cytokine Chemokine PCR Array. (A) Ekspression af pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske cytokiner. (B) Ekspression af kemotaktiske faktorer. Vist er fold genekspression, med IL4 stimulerede M2 ​​makrofager indstillet som 1.

Diskussion

I en tidligere undersøgelse, hvor vi analyserede M1 og M2 makrofag distribution i en patient kohorte af CRC fandt vi, at en forøget infiltration af makrofager af en M1 fænotype kunne korreleres til en forbedret overlevelse i CRC patienter [18]. Imidlertid blev fundet infiltration af M1 makrofager også være ledsaget af infiltration af M2 makrofager. Tumorceller vides at producere faktorer, der påvirker makrofag fænotype og dermed også makrofagreaktion mod tumoren, foreslog at favorisere tumorinvasion og metastase [12], [20]. Mulige forklaringer på den positive rolle, makrofager ses på prognose i CRC, kunne være enten at CRC eller anden måde opretholder en løbende M1 makrofag svar, eller mindre effektivt forvrænge makrofag respons mod en M2 respons end andre kræftformer, hvor infiltration af makrofager er en dårlig prognostisk markør