PLoS ONE: naturlige forbindelser Aktivitet mod Kræft Stem-Ligesom eller Fast-Cycling Melanom Cells

Abstrakt

Baggrund

Akkumulerende beviser understøtter konceptet, at modermærkekræft er meget heterogen og påført en lille delpopulation af melanom stamceller-lignende celler. De celler betragtes som ansvarlige for tumor resistens over for terapier. Desuden er melanomceller kendetegnet ved deres høje fænotypisk plasticitet. Derfor skal både melanom stamceller-lignende celler og deres mere differentieret afkom udryddes for at opnå varig helbredelse. Ved at revurdere forbindelser i heterogene melanom befolkninger, kan det være muligt at vælge forbindelser med ikke kun mod aktivitet hurtigt cykling celler, men også mod kræft stamceller-lignende celler. Naturlige forbindelser var i fokus i denne undersøgelse.

Metoder

Vi analyserede 120 forbindelser fra The Natural Products Set II til at identificere forbindelser aktive mod melanom bestande, der dyrkes i en ankerplads-uafhængig måde og beriget med celler udøve selvfornyende kapacitet. Cellernes levedygtighed, cellecyklusstop, apoptose, genekspression, klonogene overlevelse og etiket-retention blev analyseret.

Findings

Flere forbindelser effektivt udryddet celler med klonogene kapacitet og nanaomycin A, streptonigrin og toyocamycin var effektiv 0.1 uM. Andre anti-klonogene men ikke meget cytotoksiske forbindelser såsom bryostatin 1, siomycin A, illudin M, michellamine B og pentoxifyllin markant reduceret hyppigheden af ​​ABCB5 (ATP-bindende kassette, sub-familie B, medlem 5) -positive celler. Tværtimod behandling med maytansin og colchicin udvalgt til celler, der udtrykker denne transporter. Maytansin, streptonigrin, toyocamycin og colchicin, selv om meget cytotoksisk, efterlod en lille delpopulation af langsomme-delende celler upåvirket. Forbindelser valgt i den foreliggende undersøgelse differentielt ændret ekspression af melanocyt /melanom specifik microphthalmia-associeret transkriptionsfaktor (MITF) og proto-onkogen c-MYC.

Konklusion

Udvalgte anti-klonogene forbindelser måske undersøges nærmere som potentielle adjuvanser rettet mod melanom stamceller-lignende celler i den kombinerede anti-melanom terapi, mens udvalgte cytotoksiske men ikke anti-klonogene forbindelser, som steg frekvensen af ​​ABCB5-positive celler og forblev langsom cykling celler upåvirket, kan betragtes som et redskab til at berige kulturer med celler udviser melanom stamceller egenskaber

Henvisning:. Sztiller-Sikorska M, Koprowska K, Majchrzak K, Hartman M, Czyż M (2014) Natural Forbindelser ‘Aktivitet mod Kræft Stem-Like eller Fast-Cykling melanomceller. PLoS ONE 9 (3): e90783. doi: 10,1371 /journal.pone.0090783

Redaktør: Christopher Heeschen, spansk National Cancer Center (CNIO), Spanien

Modtaget: 9. december 2013; Accepteret: 4 Februar, 2014; Udgivet: 3 marts 2014

Copyright: © 2014 Sztiller-Sikorska et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering: Dette arbejde blev støttet af en bevilling 2011/01 /B /NZ4 /04921 fra National Science Centre. Den Natural Products Set II blev leveret uden omkostninger af US National Cancer Institute (NCI, https://www.dtp.nci.nih.gov. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller udarbejdelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

intratumorale fænotypiske heterogenitet resultater fra den genetiske variation, men også. fra plasticitet af tumorceller, der observeres som respons på microenvironmental stimuli. Blandt forskellige funktionelle fænotyper inden for en tumor, en subpopulation af cancer stamceller-lignende celler (CSCS) i stand til selvfornyelse og hovedparten af ​​en tumor, der består af fast-cykling celler og mere differentierede celler kunne skelnes [1] – [3] som den fænotypiske heterogenitet viste sig at være meget dynamiske i mange tumorer, herunder melanom [4] -. [7], og den terapeutiske udryddelse af CSC subpopulation kan efterfølges af dens regenerering fra ikke-CSCS begge CSCS og bulkpopulation bør overvejes i udviklingen af ​​anticancerterapi [8] – [14]. Derfor kan det være nødvendigt et lægemiddel kombination forårsager en fuldstændig udryddelse af alle former for celler i en tumor for at opnå holdbare helbredelsesmetoder. I udvælgelsesprocessen af ​​højpotente lægemiddelkandidater, der er et væsentligt problem i at skabe eksperimentelle

in vitro Salg modeller, pålidelige skøn lægemiddelaktivitet i patienter. I den foreliggende undersøgelse opnåede melanomceller direkte fra patologisk distinkte prøver, nodulær melanom og overfladisk spredning melanom, blev dyrket i en forankringsuafhængig måde i stamcellemedium og blev beriget med celler udøver selvfornyende kapacitet i forhold til serum-drevne monolag [15]. Denne

in vitro

tredimensionel model har også vist sig at bevare heterogenitet af den oprindelige tumor mere præcist end to-dimensionelle monolagskulturer [16] – [18] og var et vigtigt element af en nyskabelse på det nuværende

in vitro

screening af naturlige sammensatte biblioteket

naturlige forbindelser er meget udbredt i anticancer terapi og kan udøve en betydelig biologisk aktivitet [19] -. [21]. Selvom deres virkningsmekanismer er ofte ikke veldefinerede, de fleste af terapeutiske midler, der stammer fra naturlige produkter er primært effektiv til at eliminere cancerceller med en høj spredning sats. Forbindelser, der påvirker celledelingen kan mislykkes imidlertid at udrydde subpopulationen af ​​slow-cycling cancer stamceller-lignende celler, hvilket fører til sidst til tumor tilbagefald. I den foreliggende undersøgelse, selv om flere tilgange har været anvendt i udvælgelsesprocessen, blev prioriteret de forbindelser, der var i stand til at reducere antallet af klonogene celler. En reduktion i clonogenicity blev fortolket som en direkte effekt på selvfornyende potentiale cancer stamceller-lignende celler. Hertil kommer, apoptose, label-fastholdelse, hyppigheden af ​​ABCB5-positive celler og ekspression af Wnt /β-catenin signalering målgener,

MITF

og

c-myc

, blev vurderet i melanom populationer behandlet med forbindelser valgt som enten er meget anti-klonogene eller meget cytotoksisk. Vi undersøgte indflydelsen af ​​udvalgte forbindelser på stemness-associerede molekyler og veje. Slow-cykling celler betragtes som cancer stamceller-lignende celler (CSCS) kan markeres som label-fastholde celler [12]. I den foreliggende undersøgelse, brugte vi et fluorescerende farvestof CFSE at identificere forbindelser, som forlod etiketten-fastholde melanomaceller upåvirket. ABCB5 transportør protein, en mediator af kemoresistens i melanom, er også anerkendt som en potentiel markør for melanom stamceller-lignende celler [2], [22]. Melanomceller, der udtrykker ABCB5 protein kunne selektivt overleve, når de udsættes for dacarbazin, vemurafenib og andre lægemidler [22]. Det blev påvist, at anti-ABCB5 antistof eller siRNA gendæmpning vendt melanom resistens over lægemidler mod cancer [23], [24]. Vi undersøgte, om andelen af ​​celler, der bærer dette transportør blev ændret ved behandlingen med udvalgte naturlige forbindelser. Wnt signalering spiller en afgørende rolle i at bevare pluripotens af embryonale stamceller og kræft udvikling [25]. Seneste rapport foreslog en rolle for Wnt /β-catenin signalvejen i at opretholde levedygtigheden og /eller opretholde selv-fornyelse af brystkræft tumorfremkaldende celler

in vitro

[26]. I melanom, β-catenin signalering stiger under tumorprogression og det fremmer kemoresistens [27]. Vores seneste undersøgelse afslørede, at Wnt /β-catenin-signalvejen undertrykkes i melanom populationer med lav frekvens af klonogene celler (Hartman et al., Indsendt). Indflydelsen af ​​udvalgte naturlige forbindelser på to Wnt /β-catenin målgener,

MITF

og

c-myc

blev undersøgt. Transkriptionsfaktor MITF virker som en rheostat bestemmer fænotypiske identitet blandt forskellige subpopulationer af melanomceller [28]. Selv om kun amplificeret i ca. 20% af melanomer har MITF blevet foreslået som en slægt afhængighed onkogen bidrager til melanom kemoresistens [29], [30]. Proto-onkogen c-MYC spiller en afgørende rolle i udviklingen af ​​et stort antal humane tumorer [31]. Senest er det blevet vist, at over-ekspression af c-myc i tumoren kan målrettes med specifikke T-celler [32]. Forbindelser induktion af apoptose og /eller hæmme proliferation i en c-myc-specifik måde virker på forskellige cellulære mål [33], [34]. c-myc hæmning i melanom celler resulterer i reduceret proliferation gennem mekanismer, der involverer flere enzymer af nukleotid biosyntese [35].

Så vidt vi ved, er der ingen tidligere studier udforsker så mange faktorer parallelt i den indledende udvælgelsesproces for aktive forbindelser fra The Natural Products Set II (NCI). Baseret på de oprettede aktivitetsprofiler, kan hver af de udvalgte forbindelser undersøges yderligere for dets potentielle anvendelighed som en del af anticancerterapi eller som et redskab i laboratoriearbejde. De naturlige produkter er udvalgt som aktive forbindelser mod melanom celler kan også give romanen fører til omdannelse til klinisk nyttige midler.

Materialer og metoder

Forbindelser

Natural Products Set II blev opnået fra det amerikanske National Cancer Institute (NCI, https://www.dtp.nci.nih.gov). Forbindelserne blev i 96-brønds plader med 60 forbindelser pr plade. Plader blev opbevaret tørt ved -20 ° C. Hver brønd indeholdt 0,02 pmol af forbindelse i 1 pi glycerol. 10 mM opløsning (20 pi) af hver forbindelse blev fremstillet ved tilsætning af 19 pi DMSO til hver brønd. Umiddelbart efter solubilisering narkotika opløsninger blev aliqouted i flere test plader for at undgå mulig udfældning af forbindelsen. Alle forsøg blev udført ved hjælp af forbindelser, som NCI.

tumorvæv og etiske retningslinjer

DMBC celler blev opnået i Molekylærbiologisk Institut of Cancer fra kirurgiske prøver af modermærkekræft i fremskredne stadier. Patient karakteristika melanom prøver blev tidligere publiceret [15], [36], [37]. Undersøgelsen blev godkendt af Etisk Kommissionen det medicinske universitet i Lodz og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

cellekulturer

Celler blev opretholdt i stamceller medium (SCM) i en forankringsuafhængig måde som beskrevet tidligere [36].

Måling af levedygtige celler

melanomceller blev talt efter farvning med Trypan blå (Sigma-Aldrich) og udpladet med en tæthed på 4 x 10

3 levedygtige celler per brønd i 96-brønds plader. Celler blev dyrket i 45 timer med bil (0,05% DMSO) eller forbindelser fra The Natural Products Set II ved 5 uM. En sur phosphataseaktivitet (APA) assay blev anvendt til måling levedygtige celler. Kort fortalt blev pladerne centrifugeret blev mediet kasseret og erstattet med 100 pi assaybuffer indeholdende 0,1 M natriumacetat (pH = 5), 0,1% Triton X-100 og 5 mM p-nitrophenylphosphat, pNPP (Sigma-Aldrich) og inkuberet i yderligere 2 timer ved 37 ° C. Reaktionen blev standset med 10 pi /brønd af 1 M NaOH, og absorbansen blev målt ved en bølgelængde på 405 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Infinite M200Pro, Tecan, Østrig). Melanom celler reagerede ikke på 0,05% DMSO med reduceret levedygtighed.

Levedygtighed Assay

Drug-inducerede ændringer i cellelevedygtighed efter 45 h behandling blev også vurderet ved flowcytometri efter propidiumiodid (PI) farvning eller ved anvendelse af en automatiseret cellelevedygtighed analysator ifølge standardprocedurer. I begge assays blev celler analyseret ved anvendelse af en FACSVerse flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, Californien, USA), og resultaterne blev bearbejdet ved anvendelse FACSuite software (Becton Dickinson).

Cell Cycle Analysis

melanomceller blev behandlet med køretøjet eller forbindelserne i de angivne koncentrationer i 30 timer eller 45 timer, derefter opsamlet og fikseret med 70% (w /v) ethanol ved -20 ° C. Celler blev vasket to gange med PBS og resuspenderet i PI Staining Buffer indeholdende RNAse (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Efter inkubering i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke, blev cellerne analyseret under anvendelse af et FACSVerse flowcytometer (Becton Dickinson). ModFit LT 3.0 software (Bekræft Software, Topsham, MN, USA) blev anvendt til at beregne procentdele af celler i hver celle cyklus fase, og FACSuit software (Becton Dickinson) blev anvendt til at beregne procentdele af døde celler i subG

1 .

klongenicitetsassayet

melanomceller blev først inkuberet med forbindelser ved angivne koncentrationer i 4 timer. Derefter levedygtighed blev bestemt ved trypanblåt-farvning og 1000 enkelt- og levedygtige melanomceller blev overført til 700 pi top agarmedium blanding (SCM, 0,35% (w /v) agar), og de opnåede cellesuspensioner blev lagt oven på 12-brønds dyrkningsplader overtrukket med 700 pi størknede bottom agar blanding (SCM, 0,5% (w /v) agar). Pladerne blev derefter inkuberet ved 37 ° C i en fugtig inkubator i 2 uger, og i nogle tilfælde også i 3 uger. Celler blev farvet med 500 pi 0,005% krystalviolet i 2 timer, og kolonier mindst 50 um i diameter, blev talt under mikroskop. Indflydelsen af ​​forbindelserne på clonogenicity blev udtrykt som procent af kontrol ifølge formlen: antal kolonier dannet efter behandling med forbindelserne /antal kolonier i kontrol med køretøjet × 100.

flowcytometrisk analyse af apoptose

Påvisning af celledød blev udført af dobbelt farvning med Annexin V-FITC og PI (Roche Diagnostics, Manheim, Tyskland). Melanomceller blev podet i 12-brønds plader og behandlet i 45 timer med forbindelserne ved angivne koncentrationer. Efter behandling blev cellerne opsamlet, centrifugeret ved 400 x g i 5 minutter og farvet med Annexin V-FITC og PI i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. 15.000 hændelser blev analyseret for hver prøve ved flowcytometer FACSVerse (Becton Dickinson), og resultaterne blev bearbejdet ved anvendelse FACSuite software (Becton Dickinson).

Vurdering af ABCB5-positive celler

Hyppigheden af celler, der udtrykker ABCB5 blev vurderet ved flowcytometri. Ukonjugeret anti-ABCB5 primært antistof fra Sigma-Aldrich og FITC-konjugeret gede-anti-kanin sekundært antistof (BD Pharmingen) blev anvendt i denne undersøgelse. Typisk blev 30.000 celler analyseret per prøve. Isotypekontroller blev inkluderet i hvert forsøg. At udelukke døde celler fra analysen, 7-aminoactinomycin D farvning (7-AAD, eBiosciences) blev anvendt. Flowcytometrisk erhvervelse blev udført under anvendelse af en FACSVerse flowcytometer (Becton Dickinson) og analyseret under anvendelse FACSuite software. Ændringer i frekvensen af ​​ABCB5-positive celler efter lægemiddelbehandling i 45 h blev udtrykt i procent af kontrol med køretøjet.

CFSE Farvning

For CFSE analyse, melanom celler blev farvet med 1,5 uM CFSE (prodruget carboxyfluorescein diacetat succinimidylester) i 30 min ved 37 ° C, vasket to gange, podedes i tolv-brønds plader med 1,25 × 10

5 /brønd, og udsat for forbindelserne i 5 dage ved angivne koncentrationer. Derefter blev mediet udskiftet, og cellerne blev inkuberet i medikamentfrit medium i yderligere 6 dage, og vurderet ved flowcytometri. Grøn fluorescens-emission blev målt ved anvendelse af en FACSVerse flowcytometer (Becton Dickinson) og analyseret under anvendelse FACSuite software.

RNA Isolation, cDNA-syntese og Real-Time PCR

RNA blev isoleret og oprenset ved anvendelse af Total RNA Isolation kit med mini kolonne-system (A A Bioteknologi, Gdynia, Polen). RNA koncentration og renhed, blev målt med et Tecan NanoQuant pladelæser (Tecan, Østrig). cDNA blev syntetiseret ved anvendelse af 300 ng af tilfældige primere og SuperScript II revers transkriptase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Rotor-Gene 3000 Real-Time DNA-analysesystem (Corbett Research, Morklake, Australien) blev anvendt til at evaluere genekspression ved kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR). Forstærkningen blev udført ved hjælp af KAPA SYBR FAST qPCR Kit Universal 2X qPCR Master Mix (Kapa Biosystems, Cape Town, Sydafrika), 200 nM af hver primer og 25 ng cDNA skabelon per reaktion. De anvendte primere til Real-Time PCR var som følger: MITF: 5′-ACC GTC TCT CAC TGG ATT GG-3 ‘og 5′-TAC TTG GTG GGG TTT TCG AG-3′; C-MYC: 5’-AAT GAA AAG GCC CCC AAG GTA GTT ATC C-3 ‘og 5′-GTC GTT TCC GCA ACA AGT CCT CTT C-3′; SOX2: 5’-GCT AGT CTC CAA GCG ACG-3 ‘og 5′-GCA AGA AGC CTC TCC TTG-3’. Annealingstemperaturen for alle gener var 56 ° C. Den relative ekspression af målgener blev beregnet versus en reference gen RPS17 (med primere: 5′-AAT CTC CTG ATC CAA GGC TG-3 ‘og 5′-CAA GAT AGC AGG TTA TGT CAC G-3’), og en matematisk model herunder en effektivitet korrektion for Real-Time PCR blev anvendt.

Statistisk analyse

data repræsenterer middelværdier ± SD fra tre separate forsøg, medmindre andet er angivet. Betydningen af ​​en tilsyneladende forskel i middelværdierne for enhver testet parameter valideret af en Students parret t-test. P 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Valg Strategy af naturlige forbindelser i Melanom celler dyrket i en Anchorage-uafhængig måde

Natural Products Set II, som består af 120. forbindelser (tabel S1 i File SI) afledt af DTP Open Repository samling af 140.000 forbindelser, blev screenet for at identificere forbindelser er effektive mod melanom celler. I den præ-skærmen af ​​forbindelser blev to cellelinier afledt af fremskreden melanom anvendes, en fra nodulær melanom (DMBC12) [15] og en fra overfladisk spredning melanom (DMBC11) [37]. Begge populationer blev dyrket i SCM i en ankerplads-uafhængig måde som flercellede 3-dimensionelle sphæroider. I den primære screening blev melanomceller fra dissocierede sfæroider eksponeret for hver forbindelse ved en enkelt koncentration på 5 uM. Begge blev ikke-klonogene og klonogene assays anvendes parallelt (fig. 1).

Først blev forbindelser fra The Natural Products Set II testet i to melanom cellelinjer skabt på grundlag patologisk forskellige prøver, DMBC11 og DMBC12, ved en enkelt koncentration af 5 uM. Ændringer i levedygtighed (APA assay, volumetrisk assay, PI farvning og subG

1 assay) blev målt som kortsigtede virkninger og ændringer i klonogene potentiale som langsigtede virkninger af de testede forbindelser. Alle test levedygtighed blev sammenlignet for potentielle uoverensstemmelser. To kriterier blev anvendt til at vælge forbindelser til yderligere analyse: sammensatte bør reducere cellernes levedygtighed (PI-farvning) til ≤ 50% af kontrol og clonogenicity til ≤ 20% af kontrol. Derefter blev de udvalgte forbindelser anvendes ved lavere koncentrationer for dosisresponskurver. De mest potente forbindelser blev derefter undersøgt for deres evne til at inducere apoptose, at påvirke frekvensen af ​​ABCB5-positive celler og label-fastholde slow-cykling celler, og til at ændre genekspression.

Short-Term cytotoksiske og cytostatiske effekter af naturlige forbindelser på melanom celler

Fire ikke-klonogene metoder blev valgt til den indledende screening. Ændringer i antallet af levedygtige celler blev bestemt baseret på kvantificering af cytosolisk sur phosphataseaktivitet (APA-assay) (fig. S1A i File SI) og ved flowcytometri under anvendelse af et automatiseret cellelevedygtighed analysator (volumetrisk analyse) (Fig. S1B i File SI ). Cytotoksicitet af forbindelserne blev målt ved flowcytometri efter PI-farvning, enten som frekvensen af ​​PI-positive celler (fig. 2 og fig. S2 i File SI) eller som procentdelen af ​​celler i subG

1 fraktion. Histogrammer for de forbindelser, der akkumulerede mere end 40% af melanomceller i subG

1 fraktion er inkluderet i fig. 3 og fig. S3A i File SI. Alle disse analyser blev anvendt til at vurdere narkotika aktivitet efter kort inkubation, enten efter 45 h til kvantificering af fraktioner af levedygtige og PI-positive celler, eller efter 30 h for procentdele af celler i subG

1 fraktioner. Sideløbende hermed blev naturlige forbindelser ved 5 uM vurderet i lægemiddel-resistente, p53-deficient leukæmisk cellelinie K562 (fig. 2, fig. S1-S2 i File SI). Sammenligningen af ​​cytotoksicitet af naturlige produkter mod melanom og leukæmi celler (fig. 2) viste, at adskillige forbindelser er aktive mod melanomceller ikke var aktive i K562-celler. For eksempel, streptonigrin (32), crassin (68) og geldanamycin analog (72) reducerede levedygtigheden af ​​melanomceller til mindre end 3% af kontrollen, men reduktionen af ​​levedygtighed K562-celler nåede ikke 50% af kontrollen. Melanomceller var også langt mere følsomme over for fastigilin B (63), bactobolin (84), didemnin B (104), siomycin A (107), toyocamycin (108), geldanamycin (110) og tubulosine (119) blandt andre (fig. 2). K562-celler, til gengæld var meget mere følsomme over for lapachon (20) end melanomceller.

Levedygtighed blev målt efter 45% af vehikel (0,05% DMSO) -behandlede kontrol. Til sammenligning blev den leukæmi K562 anvendes. Hvert felt repræsenterer responset af melanomceller eller leukæmiceller til en ud af 120 forbindelser. Farver angiver niveauet af celle respons. For klarhedens skyld tallene er udpeget i nærværende undersøgelse til de testede forbindelser (Tabel S1 i File SI) er sat i den første rå og den første kolonne. Se figur S2 i File SI for kvantitative data.

Repræsentative histogrammer for DMBC11 celler behandlet med naturlige forbindelser i 30

1 ikke overstige 40%, blev histogrammer analyseret ved hjælp ModFit software til at beregne procenter af celler i hver celle cyklus fase. Histogrammer viser cellecyklus arrest i G

0 /G

1 fase blev markeret med grøn ramme, i S-fasen med blå ramme og G

2 /M i rød ramme, og de procentdele af melanomaceller arresteret i disse faser, er anført. Når ophobning af melanom celler i subG

1 oversteg 40%, blev FACSuit software, der bruges, og de procentdele af døde celler er angivet. Resultaterne opnået for DMBC12 celler er vist i fig S3A i File SI. Virkninger af lavere koncentrationer til de mest cytotoksiske forbindelser eller længere eksponering for forbindelser ineffektive ved 30 h indgår i figur S3B i File SI.

I celle cyklus analyse, flere forbindelser på koncentrationen af ​​5 uM akkumulerede melanom celler enten i forskellige cellecyklus faser eller genererede beskadigede celler indsamlet i subG

1 (fig. 3 for DMBC11 celler og fig. S3A i File SI for DMBC12 celler). Colchicin (1), rotenon (19), vincristin (39), maytansin (60) og rhizoxin (86) er standset størstedelen af ​​melanomceller i G

2 /M-fasen. Resorufin (12), michellamine B (101) og fumagillin (120), blandt andre anholdt celler i S-fasen, mens brefeldin A (47), og camptothecin (48) akkumulerede celler i G

0 /G

1 eller subG

1 afhængig af narkotika og cellelinje. Adskillige forbindelser, som ved 5 uM forårsagede ingen virkning på cellecyklussen efter behandling i 30 timer blev anvendt i den efterfølgende eksperiment i 45 timer, mens forbindelser, der forårsager ophobning af celler i subG

1 blev testet ved 1 uM, og i tilfælde af de mest potente forbindelser ved 0,1 pM (fig. S3B i File SI). Streptonigrin (32) genererer en stor population af celler i subG

1 ved 5 uM, akkumulerede DMBC12 celler i S-fasen, når de anvendes på 0,1 uM.

Pre-skærm af Klonogen Kapacitet som en langtidseffekt af naturlige forbindelser på melanomaceller

En klonogene assay blev anvendt til at undersøge virkningerne af naturlige forbindelser på selvfornyende kapacitet melanom celler. Celler blev inkuberet med forbindelserne kun i 4 timer, og langsigtede virkninger af denne inkubation blev vurderet som evnen til at danne kugler i blød agar efter 2 uger. Fyrre otte og fyrre seks forbindelser ved 5 uM reducerede antallet af kloner dannet i agar til ≤1% af kontrol i DMBC11 og DMBC12 populationer, henholdsvis (fig. 4 og fig. S4 i File SI). Som klonogene celler kan dele sig langsommere, og kolonien måske ikke nå passende størrelse inden for 2 uger, for adskillige forbindelser kolonien optælling blev udført en uge senere. Der var ingen væsentlige forskelle mellem antallet af kloner opnået efter to og tre uger (data ikke vist). Salg

Celler blev inkuberet i forbindelse medium i 4 timer og derefter de blev dyrket på blød agar i 14 dage i nærvær af lægemiddel-frit medium. Cellekolonier blev farvet med krystalviolet og talt. Forbindelser blev grupperet baseret på deres anti-klonogene aktivitet udtrykt som procent af kontrol behandlet med vehikel (0,05% DMSO). Mindst to uafhængige forsøg blev udført in duplo. Se figur S4 i File SI for kvantitative data.

Sammenligning af Kort- og langtidsvirkninger af Active naturlige forbindelser på melanom celler

Efter den indledende screening udføres på 5 uM, hver forbindelse fra The Natural Products Set II kunne henføres til en af ​​fem kategorier (Fig. 5). Fyrre seks forbindelser på 5 pM var ikke aktiv i nogen af ​​beskæftigede analyser i begge testede populationer. De blev udelukket fra yderligere analyser. Nogle af disse ikke-aktive forbindelser, såsom curcumine (27) eller rapamycin (69) er godt karakteriseret for deres anticanceraktivitet men tilsyneladende ved 5 uM de var ikke aktive mod forankringsuafhængige melanomceller. Adskillige forbindelser var i stand til at inducere celledød inden for de første to dage, og derudover de effektivt udryddet celler med klonogene potentiale. Disse forbindelser blev betragtet som meget potent, og deres aktiviteter, både ikke-klonogene og klonogene, blev målt ved lavere koncentrationer i de følgende eksperimenter. To lægemidler, actinomycin D (105) og cyclophosphamid (117), blev udelukket fra yderligere analyse, da de er meget godt karakteriseret for deres

in vitro

in vivo

anticancer aktivitet. Desuden blev parthenolide (61) også udelukket, da vores detaljerede rapport, der beskriver dens virkninger på forankringsuafhængige melanomaceller blev offentliggjort for nylig [36]. Som prioritet blev givet til forbindelser, der reducerede antallet af melanom celler viser selvfornyende kapacitet, blev også analyseret yderligere udvalgte forbindelser fra gruppen af ​​anti-klonogene men ikke meget cytotoksisk.

Efter indledende screening, forbindelser blev grupperet baseret på deres aktiviteter. En forbindelse blev defineret som anti-klonogene når det reducerede procentdelen af ​​kloner dannet i blød agar til mindre end 20% af kontrol behandlet med vehikel (0,05% DMSO). En forbindelse blev navngivet cytostatisk da det reducerede antallet af levedygtige celler til mindre end 50% af kontrol ved hjælp bæredygtigt antal celletælling, og cytotoksiske hjælp af flowcytometri efter PI-farvning. Numre, der svarer til forbindelser, akkumulerede melanomceller i subG

1 er understreget. Forbindelser, der forårsagede cellecyklusstop er markeret med grønt for G

0 /G

1 fase, blå for S-fasen og rød for G

2 /M-fasen. Adskillige forbindelser (46) var ikke aktiv i nogen assay. Kun få forbindelser var cytotoksiske men ikke markant påvirket antallet af kolonier dannet i agar. Få andre forbindelser udøvet deres virkninger kun på klonogene celler eller reduceret clonogenicity under 20% af kontrol, forårsagede cytostatisk /cytostatiske virkning uden at fremkalde væsentlig celledød. Adskillige forbindelser blev cytostatisk og cytotoksiske og derudover de effektivt udryddet celler med klonogene potentiale. De var i fokus for den videre undersøgelse. Se tabel S1 i File SI for navnene på de forbindelser, der svarer til numrene i figur.

Først blev de cytotoksiske virkninger af potente naturlige forbindelser bekræftet i seks patient-afledte cellelinjer, herunder fire yderligere cellelinjer afledt kirurgiske eksemplarer af nodulær melanom, DMBC2, DMBC8, DMBC10 [15] og DMBC9 [36]. Koncentrationer af forbindelserne blev sænket til 1 pM og 0,1 pM, og i nogle tilfælde til 0,01 pM eller endda 0,001 uM, indtil IC

50 virkning blev opnået (tabel S2 i File SI). I almindelighed kun små forskelle mellem responser af melanomceller fra forskellige DMBC populationer var synlige på lægemiddelkoncentrationer af 1 uM og 0,1 uM. DMBC8 celler syntes at være mindre følsomme over for flere forbindelser end andre befolkningsgrupper.

Dernæst dosisresponskurver blev fremstillet i 45 forbindelser udøver kraftige anti-klonogene og /eller cytotoksiske potentialer (fig. 6 og fig. S5 i File SI). Baseret på dosis-respons kurver blev den prioriterede liste over de mest potente forbindelser fra Natural Products Set II (Tabel 1). Anti-klonogene aktivitet blev rangeret over cytotoksisk aktivitet. IC

50 værdier på syv forbindelser var under 0,1 uM når lægemidlet indflydelse på kapaciteten til at danne kloner i blød agar blev evalueret. Blandt disse forbindelser, maytansin (60) udøvede en stærkere samlet cytotoksisk effekt end anti-klonogene effekt, streptonigrin (32), toyocamycin (108), colchicin (1) og echinomycin A (102) havde lignende styrke i begge aktiviteter, mens nanaomycin A (74) og illudin M (114) var mere potent i udryddelsen celler med klonogene potentiale end reducere levedygtighed inden den kortsigtede inkubation. Lignende fænomener blev observeret for adskillige forbindelser, der var effektiv ved højere koncentrationer. For eksempel IC

50 værdier for anti-klonogene forbindelser, bryostatin 1 (112), siomycin A (107), fumitremorgin C (118), fumagallin (120) michellamine B (101) og pentoxifyllin (100) var i området 0,1 – 1 uM i klongenicitetsassayet men i området 1 -. 5 uM i levedygtighedsassayet

Dosisresponskurver blev fremstillet for forbindelser udviser høje anti-klonogene og /eller cytotoksiske potentiale. Blå kurver, anti-klonogene aktivitet; sorte kurver, cytotoksisk aktivitet. Graferne sammenfattet resultaterne af mindst 3 uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer hjælp DMBC11 (fyldt firkant) og DMBC12 (åben firkant) cellelinjer. Kemiske formler for testede forbindelser er inkluderet. Dosis-respons kurver for mindre potente forbindelser er vist i figur S5 i File SI.

induktion af apoptose i melanomaceller Udsat for udvalgte forbindelser

Flowcytometrisk analyse af Annexin V /PI-farvede celler afslørede, at stærkt cytotoksiske forbindelser inducerede apoptose i melanomceller, hvorimod forbindelser hovedsagelig udrydde celler med evnen til at danne kloner (tabel 1) ikke udløser apoptose i koncentrationer effektive til deres anti-klonogene aktivitet (fig. 7) . For eksempel, maytansin (60) inducerede apoptose i de fleste celler ved koncentration så lav som 0,01 uM. Tværtimod har nanaomycin A (74), som 0.1 pM næsten fuldstændig udryddet celler med klonogene potentiale ikke inducere apoptose i denne koncentration.

Induktion af apoptose blev bestemt ved flowcytometri efter Annexin V /propidiumiodidfarvning . Typiske kontur plots af melanom celler behandlet med forbindelser ved angivne koncentrationer er vist. Tabel S2. Tabel S3.