PLoS ONE: Next-Generation Sequencing af RNA og DNA isoleret fra parret Fresh-Frosne og formalin-paraffinindlejret Prøver af kræft hos mennesker og Normal Tissue

Abstrakt

formalin-fikseret, paraffin-indstøbt (FFPE ) væv er en uvurderlig ressource for klinisk forskning. Men nukleinsyrer ekstraheret fra FFPE væv er fragmenteret og kemisk modificeret gør dem udfordrende at bruge i molekylære studier. Vi analyserede 23 frisk frosset (FF), 35 FFPE og 38 parrede FF /FFPE prøver, der repræsenterer seks forskellige typer menneskelige væv (blære, prostata og tyktarm karcinom, lever og tyktarm normal væv; reaktiv tonsil) for at undersøge den potentielle anvendelse af FFPE prøver i næste generation sekventering (NGS) baseret retrospektive og prospektive kliniske studier. To fremgangsmåder til DNA og tre fremgangsmåder til RNA-ekstraktion fra FFPE væv blev sammenlignet, og fandtes at påvirke nukleinsyre kvantitet og kvalitet. DNA og RNA fra udvalgte FFPE og parrede FF /FFPE prøver blev anvendt til exome og transkriptom analyse. Præparater af DNA Exome-Seq biblioteker var mere udfordrende (29,5% succes) end for RNA-Seq biblioteker, formentlig på grund af ændringer FFPE vævsafledt DNA. Biblioteker kan stadig fremstilles fra RNA isoleret fra to-årti gamle FFPE væv. Data blev analyseret ved anvendelse af CLC Bio Genomics Workbench og afslørede systematiske forskelle mellem FF og FFPE vævsafledte nukleinsyrebiblioteker. På trods af dette, parvis analyse af DNA Exome-Seq data viste konkordans til 70-80% af varianter i FF og FFPE prøver opbevaret i mindre end tre år. RNA-Seq data viste høj korrelation af ekspressionsprofiler i FF /FFPE par (Pearson Korrelationer af 0,90 +/- 0,05), uanset opbevaringstid (op til 244 måneder) og vævstype. Et fælles sæt af 1.494 gener blev identificeret med udtryk profiler, der var signifikant forskellig mellem parrede FF og FFPE prøver uanset vævstype. Vores resultater er lovende og tyder på, at NGS kan bruges til at studere FFPE prøver i både prospektive og retrospektive arkiv-baserede undersøgelser, hvor FF prøver ikke er tilgængelige

Henvisning:. Hedegaard J, Thorsen K, Lund MK, Hein A-MK, Hamilton-Dutoit SJ, Vang S, et al. (2014) Next-Generation Sequencing af RNA og DNA isoleret fra parret Fresh-Frosne og formalin-paraffinindlejret Prøver af kræft hos mennesker og Normal Tissue. PLoS ONE 9 (5): e98187. doi: 10,1371 /journal.pone.0098187

Redaktør: Zhuang Zuo, UT MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: 14. marts 2014 Accepteret: April 10, 2014; Udgivet: 30. maj 2014

Copyright: © 2014 Hedegaard et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Adgang til sekvensdata, der indeholder person, identificerende information, behov underskrift på en kontrolleret adgang form og kan tilgås på Det europæiske Genome-phenome Archive [25] ved hjælp af undersøgelsen ID EGAS00001000737 efter anmodning til MOMA Data Access Udvalg. Expression matricer er tilgængelige uden restriktioner gennem ArrayExpress [REF: www.ebi.ac.uk/arrayexpress] under optagelse:. E-mtab-2523

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Den Danske Højteknologifondens Foundation (https://hoejteknologifonden.dk/), John og Birthe Meyers Fond og Det danske Kræftens Bekæmpelse (https://www.cancer.dk/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Anne-Mette K. Hein og Bjarne Knudsen er ansat af CLC bio, der er et QIAGEN selskab. Mette Katrine Lund og Mogens Kruhøffer er ansat af AROS Applied Biotechnology. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

formalin-fikseret, paraffinindlejrede (FFPE) vævsprøver opbevaret i diagnostiske patologi arkiver repræsenterer en uvurderlig biobank for retrospektiv klinisk forskning. Derudover kan FFPE prøver være nyttige i prospektive undersøgelser udelade indsamling af frisk-frosne (FF) prøver. Desværre, nukleinsyrer er vanskeligere at udvinde fra FFPE væv på grund af behovet for at fjerne paraffinen og modvirke kovalente protein-DNA interaktioner, der skyldes fikseringen processen. Derudover fiksering forsinkelse (dvs. perioperativ iskæmisk tid), fiksering proces, vævspræparatet, paraffinindlejring og arkivering bidrage til fragmenteringen, tværbinding og kemisk modifikation af FFPE vævsafledte nukleinsyrer. Disse ændringer interferere med mange klassiske molekylære analyser kræver høj kvalitet nukleinsyrer. Fremskridt i næste generation sekventering (NGS) teknologier tillader undersøgelse af genomer, epigenomes og transcriptomes bruger begrænset prøvemateriale. Desuden kan denne analyse foretages på en relativt beskedne omkostninger, i betragtning af den massive stigning i mængden af ​​oplysninger, der kan opnås. Den effekt af NGS at analysere i dybden stort antal korte sekvenser potentielt gør dette til en ideel teknologi til at gælde for de normalt fragmenterede nukleinsyrer, der kan udvindes fra FFPE prøver. Udviklingen af ​​pålidelige NGS-baserede metoder til brug med lav kvalitet FFPE væv-afledte nukleinsyrer ville åbne de diagnostiske patologi arkiver til high-throughput profilering, lette omfattende retrospektive kliniske studier. Tilsvarende vil evnen til at bruge FFPE prøver til molekylær analyse i prospektive studier være til stor gavn, ved potentielt at reducere eller helt fjerne behovet for den kedelige indsamling og opbevaring af kryopræserverede kliniske prøver.

Mens nukleinsyrer isoleret fra FFPE væv har tidligere hovedsageligt blevet undersøgt ved hjælp af PCR- og microarray-baserede metoder, der nu rapporter om anvendelsen af ​​NGS til FFPE materiale. En af de første kom fra Schweiger

et al.

Som rapporterede NGS-baseret analyse af DNA (DNA-Seq) isoleret fra FFPE prøver [1]. Forfatterne fandt en god korrelation mellem matchede FF og FFPE brystkræft prøver fra en enkelt patient ved analyse genom-dækkende kopital ændringer og variant frekvenser baseret på lav-dækning hel-genom-sekventering [1]. Efterfølgende Wood

et al.

Kombineret pooling af prøver og reduktion i mængden af ​​input DNA for at studere genom-dækkende kopi nummer ændringer i FFPE prøver [2]. En yderligere papir fra Schweiger gruppe viste, at studier af genomiske variationer baseret på sekventering af DNA fra FFPE væv nydt godt af øget dækning opnået ved hjælp af målrettet resekventering, mindske virkningerne af fikseringen-induceret støj [3]. For nylig Tuononen

et al.

Anvendt målrettet DNA resekventering at screene FFPE ikke-småcellet karcinom for klinisk vigtige

EGFR

,

KRAS

BRAF

mutationer og fandt en signifikant sammenhæng med resultaterne af real-time PCR baserede analyser udført parallelt [4]. Spencer

et al.

Anvendes målrettet resekventering af 27 cancerrelaterede gener til 16 FF /FFPE parrede lunge adenocarcinomer og fandt, at på trods af påviselige virkninger af optagelsen proces, identiske single-nucleotid-varianter kan detekteres pålideligt [ ,,,0],5]. Fanelli

et al.

Har rapporteret en høj-throughput sekventering fremgangsmåde til epigenetisk profilering baseret på chip-seq, FFPE prøver fra en mus leukæmi model og fra en begrænset række humane cancere (en seminom og seks brystcarcinomer) , der tillader analyse af histon ændringer og transskription faktor bindende for en genom-plan [6], [7]. Gu

et al.

[8], [9] viste, at lavt input beløber FFPE vævsafledt DNA kunne anvendes sammen med reduceret repræsentation bisulfit sekventering (RRBS) for at tillade studier af genom-dækkende DNA methylering profiler på arkivering kliniske prøver.

Weng

et al.

var en af ​​de første til at beskrive NGS-baseret analyse af RNA (RNA-Seq) isoleret fra FFPE prøver [10]. Disse forfattere rapporterede sammenlignelige udtryk resultater fra dyb sekventering af miRNA, der stammer fra parret FF og FFPE renal celle carcinomer. Endvidere fandt de en høj korrelation sammenligne resultaterne af NGS med dem opnået parallelt hjælp microarray og RT-PCR metoder. For nylig, Meng

et al.

Rapporterede vellykket anvendelse af ligation-baserede miRNA sekventering til kræft prøver lagret op til 9 år [11]. Mens det er kendt fra studier under anvendelse af traditionelle molekylære teknikker, at mindre RNA-molekyler, såsom miRNA er bedre i stand til at modstå formalinfiksering [12], der er en generel forventning om, at længere RNA-molekyler vil sandsynligvis være mere modtagelige for fragmentering og modifikationer, hvorved dem dårlige skabeloner til RNA-Seq. En NGS-baserede undersøgelse af længere RNA-molekyler er blevet rapporteret af Sinicropi

et al.

Der fandt, at RNA-Seq data fra FFPE primær brystkræft var af tilstrækkelig kvalitet til at gøre det muligt for biomarkør opdagelse [13]. Adiconis

et al.

Rapporterede en sammenlignende analyse af fem fremgangsmåder til RNA-Seq påføres lav kvalitet RNA (såsom det isoleret fra FFPE væv) og lav mængde RNA [14]. For nylig, Norton

et al.

Anvendt RNA-Seq til ni sæt FF og FFPE bryst tumor prøver opbevaret i op til fire år og fundet god korrelation mellem de parrede FF og FFPE udtryk profiler [15].

Vi udvider på disse studier med hensyn til antallet og mangfoldigheden af ​​de undersøgte humane prøver og rapporter en systematisk analyse af den potentielle anvendelse af NGS-baserede profilering af humane FFPE prøver i retrospektive og prospektive kliniske studier. Vores undersøgelse omfatter (1) evaluering af forskellige isolation strategier for nukleinsyrer fra humane FFPE prøver og matchende FF og FFPE prøver; (2) udarbejdelse af målrettede genom (DNA Exome-Seq) og hele transkriptom (RNA-Seq) sekventering biblioteker; og (3) en grundig analyse af NGS data opnået. De primære mål var at identificere og karakterisere systematiske virkninger af fiksering processen på de opnåede resultater samt kritiske parametre i workflowet fra kirurgi til analyserede NGS data. Tilgængelige ekstraktionsmidler kits blev evalueret med hensyn til oprensning af RNA og DNA fra udvalgte FFPE humane prøver (normal lever, lever carcinom, reaktiv tonsil, lungecarcinom, brystcarcinom, normal hud fra bryst og blære carcinom, med matchende FF prøver fra leveren og tonsil prøver). Dette blev efterfulgt af evaluering af ekstraktion af RNA og DNA fra FFPE humane prøver (colorektalt carcinom, normal lever, blære carcinom og tonsil) med forskellige rutinemæssige arkivering opbevaringstider (op til 244 måneder). Endelig DNA og RNA blev ekstraheret fra matchende FF og FFPE humane prøver (blære, prostata og coloncarcinomer samt fra normal colon væv). Ekstraherede DNA og RNA blev anvendt til fremstilling af målrettede genom (DNA Exome-Seq) og hele transkriptom (RNA-Seq) sekventering biblioteker og NGS data opnået, blev analyseret med fokus på opdagelsen af ​​systematiske effekter af fiksering processen.

Metoder og materialer

Etik udsagn

Alle eksperimenter i denne undersøgelse blev gennemført på prøver af human oprindelse udvalgt fra de frosne væv biobanker på Aarhus Universitetshospital, Danmark og fra den diagnostiske FFPE blok arkiv af Patologisk Institut, Århus Universitetshospital, Danmark. Vævene blev fjernet i løbet af rutinemæssige kirurgiske procedurer og var overskud til diagnostiske krav. Prøver blev anonymiseret før anvendelse i denne undersøgelse. Undersøgelsen blev godkendt af Udvalget for Health Research Ethics for den centrale Danmark Region og den danske Datatilsynet.

Kliniske prøver og vigtige mål

Undersøgelse arbejdsgange fra kirurgi til den endelige analyse af NGS data er illustreret i fig S1 sammen med de nøgleparametre undersøgte. Prøverne blev udvalgt til at maksimere intervallet variabler (eksempelvis opbevaring gang siden indsamling og vævstype) med en forventet effekt på resultaterne. De prøvesæt er beskrevet i dette afsnit, i tabel 1 og tabel S1. Undersøgelsen omfattede i alt 23 FF, 35 FFPE og 38 parrede FF /FFPE prøver, der repræsenterer seks forskellige typer menneskelige væv (blære, prostata og tyktarm karcinom, lever og tyktarm normal væv; reaktiv tonsil). I alt 16 FF og FFPE prøver fra forskellige væv blev udvalgt til første afprøvning af DNA og RNA oprensning (

den test, der

). For at undersøge virkningen af ​​vævstypen og opbevaring tid efter fiksering blev FFPE blokke fra fire væv (kolorektal og blære karcinom, og normal lever og tonsil) valgt, hver med fire opbevaringstiden (2-3, 13-15, 60-62 og 241-244 måneder). Dette eksperiment betegnes

opbevaringstiden FFPE indstillet

. Den største eksperiment,

den parrede FF /FFPE colon sæt

, omfattede 19 parrede FF /FFPE kolorektal tumor prøver (både benigne og maligne) og 13 FF prøver af matchende normalt colon væv, der var blevet indsamlet 2 – 13 år tidligere. For at teste påvisning af specifikke enkelt nukleotid varianter, et sæt af 11 kolon prøver blev udvalgt med kendte varianter i

KRAS

BRAF

(

kolon KRAS /BRAF varianter påvisning sæt

). Desuden syv parrede FF /FFPE prostata karcinom prøver samlet 2 – 11 år tidligere (

den parrede FF /FFPE prostata sæt

), otte parrede FF /FFPE blære karcinom prøver samlet 5 – 9 år tidligere (

den parrede FF /FFPE blære sæt

) og 10 FF blære karcinom prøver (

FF blære bevaring signatur sæt

) blev udvalgt til undersøgelsen. DNA og RNA blev isoleret fra hver prøve og anvendes til at generere biblioteker for exome sekventering og total-RNA-sekventering. Det primære formål med de DNA Exome-seq eksperimenter var at sammenligne påvisning af genomisk variation i matchede FF og FFPE prøver, herunder såvel specifikke varianter af klinisk relevans samt globale variationer. blev udført RNA-Seq eksperimenter for at tillade sammenligninger af transkriptionel oplysninger fra matchede FF og FFPE prøver, herunder (1) global information om transkriptionel aktivitet; (2) specifikke ekspressionsniveauer i forhold til biologiske tilstand (dvs. kontrasterende godartede og ondartede prøver i

den parrede FF /FFPE kolon sæt

); og (3) beskrivelse af et udtryk signatur for blære tumor progression (i

FF blære signatur bevaring sæt

den parrede FF /FFPE blære sæt

).

Oprensning af DNA og RNA fra FF og FFPE væv

for at identificere ekstraktionsmetoder resulterer i optimal nukleinsyre kvalitet og udbytte, blev RNA og DNA oprenses fra FFPE blokke af

test, der er

(tabel 1 og tabel S1) ved anvendelse af kommercielt tilgængelige kits, som beskrevet nedenfor. Op til seks 10 um snit blev skåret fra hver tumor blok og anbragt i sterile 1,5 ml centrifugeglas klar til ekstraktion. Rør indeholdende cut FFPE sektioner for RNA oprensning blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. DNA- og RNA-oprensninger fra matching FF lever og tonsil prøver blev udført under anvendelse af en QiaSymphony robot i kombination med QIAsymphony DSP DNA Mini Kit og QIAsymphony RNA Mini Kit (begge fra QIAGEN). DNA blev oprenset fra FFPE prøver ved hjælp af QIAamp DNA FFPE Tissue (QIAGEN) og Nucleospin FFPE DNA (Machery-Nagel) kits; RNA blev oprenset fra FFPE prøver ved hjælp miRNeasy FFPE (QIAGEN), Nucleospin FFPE RNA (Machery-Nagel) og ExpressArt FFPE RNAready (Amp Tec) kits. For at teste parallelle oprensning af RNA og DNA fra de samme FFPE sektioner blev den Nucleospin FFPE RNA /DNA-kit (Machery-Nagel) og RECOVERALL Total Nucleic Acid Isolation Kit til FFPE (Ambion) medfølger. Endelig, for at teste automatiserede oprensningsprocedurer, DNA og RNA blev oprenset på en QiaSymphony robot ved hjælp specialiserede FFPE programmer og QIAsymphony DSP DNA Mini Kit og QIAsymphony RNA Mini Kit (Qiagen), hhv. Alle ekstraktioner blev udført tredobbelt, hver på tre FFPE sektioner. På grund af en begrænsende mængde materiale med ekstraktion fra bryst prøver Recover Alt blev gjort på kun dubletter. Oprensninger blev udført efter fabrikanternes protokoller med følgende ændring: Deparaffinisation før DNA og RNA-ekstraktion ved hjælp af QIAamp FFPE DNA og ExpressArt FFPE RNAready kit henholdsvis blev gjort ved hjælp QIAGEN s Deparaffinisation løsning i stedet for xylen inkluderet i kits. Alle DNA-prøver blev RNase behandlede og alle RNA prøver blev DNase behandlet under oprensningen. Efter oprensning blev alle prøver vasket på UF filterplader og elueret i Qiagens Elution Buffer (EB, [10 mM Tris-HCI, pH 8,5]). Opsplitningen profiler af det oprensede RNA og DNA blev estimeret ved on-chip elektroforese af en stikprøve 1 pi på en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Da kun dobbeltstrenget (ds) DNA er aktiv i TruSeq bibliotek formation, både den samlede absorbans ved 260 nM (NanoDropND-1000 spektrofotometer) samt en dsDNA specifikt assay (qubit’en dsDNA BR Assay Kit /qubit’en 2,0 Fluorometer, Invitrogen) blev anvendes til at kvantificere DNA-koncentrationen. RNA-koncentrationen blev bestemt ved anvendelse kun den samlede absorbans ved 260 nm.

Denne indledende oprensning blev fulgt af DNA og RNA-ekstraktion fra FFPE væv, der var blevet rutinemæssigt lagret i patologien arkivet for varierende tidsrum efter fiksering. Denne opbevaringstid undersøgelse omfattede fire væv: tonsil (normal reaktiv), lever (normal ikke-neoplastiske), blære (carcinoma) og kolon (carcinom). Hver væv var repræsenteret med fire FFPE blokke gemt til 2-3, 13-15, 60-61 og 241-244 måneder (tabel 1 og tabel S1). Kun de to mest lovende udvinding kits blev anvendt: DNA Oprensninger blev udført ved hjælp af QIAamp DNA FFPE Tissue og Ambion RECOVERALL kits. RNA Oprensninger blev udført ved hjælp miRNeasy FFPE og AmpTec ExpressArt kits. Alle ekstraktioner blev udført dobbelt anvendelse af tre vævssnit.

opbevaringstid undersøgelse blev efterfulgt af oprensning af DNA og RNA fra parrede FF /FFPE prøver af colon (19 prøver), blære (8 prøver) og prostata ( 7 prøver) karcinomer (tabel 1 og tabel S1). Desuden blev 12 FFPE tyktarmscarcinomceller prøver med kendte mutationer i KRAS og BRAF inkluderet (

colon KRAS /BRAF varianter påvisning indstillet

, tabel 1 og tabel S1). Alle ekstraktioner fra FF materiale blev udført under anvendelse af QiaSymphony som beskrevet ovenfor. RNA blev ekstraheret manuelt fra FFPE blokke ved hjælp af AmpTec ExpressArt kits og DNA blev ekstraheret semi-automatisk fra FFPE blokke på QiaSymphony. RNA blev ekstraheret i to parallelle reaktioner; én behandlet med DNase I, og den anden blev desuden behandlet med Exonulcease jeg som katalyserer fjernelsen af ​​nukleotider fra enkeltstrenget (ss) DNA.

Forberedelse og sekventering af DNA Exome-Seq biblioteker

genomiske DNA-biblioteker blev fremstillet fra FF- og FFPE-afledt DNA under anvendelse TruSeq DNA-bibliotek forberedelsesmateriale (Illumina efter gel-fri protokol) efterfulgt af exome berigelse under anvendelse TruSeq exome kits (Illumina). gDNA bibliotek forberedelse blev udført i overensstemmelse med producentens manual med følgende modifikationer. (1) For at undgå pufferbetingelser-effekter, 1,2 ug dsDNA blev behandlet på en QIAGEN UF filterplade, vasket to gange i puffer EB ([10 mM Tris-CI, pH 8,5], QIAGEN) og resuspenderet i 50 pi Buffer EB før det anvendes som input til TruSeq gDNA biblioteket forberedelse. (2) Antallet af PCR-cyklusser anvendes til amplifikation af FFPE-afledte biblioteker blev øget fra 10 til 11. (3) Efter den sidste perle-oprensningstrin af de amplificerede gDNA bibliotekerne blev 10 pi Buffer EB hvormed bibliotekerne, hvilket bringer det endelige volumen op til 40 uL. Størrelsesfordelingen af ​​de gDNA bibliotekerne blev estimeret ved on-chip elektroforese (DNA 1000 DNA-chip) af en prøve 1 pi på en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). DNA-koncentrationen af ​​bibliotekerne blev estimeret ved anvendelse af KAPA Library Kvantificering Kit (Kapa Biosystems). Kort fortalt kvantificering blev udført ved hjælp af 10 ul reaktion bind med 6 uL KAPA reagens /primer mix og 4 uL fortyndet prøve 1.000.000 gange efter den anbefalede procedure og de medfølgende standarder. Kvantificering blev udført på tre uafhængige fortyndinger af hver prøve. Exome targeting blev udført på pools af op til seks gDNA biblioteker ved anvendelse af 500 ng af hver gDNA Bibliotek ifølge producentens anbefalinger. gDNA biblioteker fremstillet fra FF og FFPE prøver ikke blev samlet. Efter den sidste perle-oprensning trin af exome fanget og forstærkes gDNA biblioteker, blev 30 pi Buffer EB hvormed bibliotekerne, så den endelige rumfang på 60 pi. De størrelse fordelinger af tilfangetagne biblioteker blev estimeret ved on-chip elektroforese (Høj følsomhed DNA-chip) af en prøve en pi på en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). DNA-koncentrationen af ​​bibliotekerne blev estimeret ved anvendelse af KAPA Bibliotek Kvantificering Kit, som beskrevet ovenfor. Den exome erobrede gDNA biblioteker blev samlet i 2 nm samles bestande, denatureret og fortyndet til 10:00 med pre-kølet hybridiseringsbuffer og indlæses i TruSeq PE v3 flowceller på en Illumina CBOT efterfulgt af indekseret parret ende sekventering (101 + 7 + 101 bp ) på en Illumina HiSeq 2000 ved hjælp TruSeq SBS Kit v3 kemi (Illumina).

mutationsstatus i BRAF og KRAS

KRAS

BRAF

mutation analyse af de 11 prøver i

colon KRAS /BRAF varianter påvisning sæt

blev udført som beskrevet [16]. Kort fortalt

KRAS

codon 12, 13 og 61 og

BRAF

V600E og codon 442-474 blev undersøgt ved hjælp af Lightscanner (Idaho Technology). Prøver med divergerende smeltekurver blev yderligere valideret af Sanger sekventering på 3130x Genetic Analyzer (Applied Biosystems)

Forberedelse og sekventering af RNA-Seq biblioteker

For at aktivere en grundig analyse af RNA-Seq data, der kræves vi den anvendte metode til fremstilling af RNA-Seq biblioteker til at levere streng-specifikke (retningsbestemt) og parret ende oplysninger samt lette multiplex sekventering. På grund af den forventede nedbrydning af RNA fra FFPE væv, bør biblioteket fremstillingsmetoden ikke baseres på udvælgelse af poly (A) + da dette ville forringe bibliotek præparat eller i det mindste resultere i en 3’bias. Indhentning total-RNA-Seq data vil desuden fremme en mere komplet billede af transkriptomet. Når undersøgelsen blev indledt i 2011, er den eneste kommercialiseret kit opfylder alle krav var Ribo-Zero teknologi (Epicentre, en Illumina selskab) til udtømning af rRNA efterfulgt af biblioteket forberedelse hjælp af ScriptSeq teknologi (Epicentre, en Illumina selskab). Cytoplasmatisk og mitokondriel rRNA blev fjernet fra totalt RNA under anvendelse af Ribo-nul magnetisk Gold Kit (Human /mus /rotte, Epicentre, en Illumina selskab) ved at følge producentens instruktioner. Kort fortalt rRNA Fjernelse Solution blev tilsat til 500 ng af total RNA og inkuberet i 10 minutter ved 68 ° C, derefter 15 minutter ved stuetemperatur. Sonder med hybridiseret rRNA blev fjernet ved tilsætning af RNA-probe blandingen til vaskede magnetiske perler efterfulgt af inkubation i 5 minutter ved stuetemperatur, blanding ved hvirvelblanding, inkubation i 5 minutter ved 50 ° C, magnetisering og overførsel af supernatanten til en RNase- fri rør. RRNA depleteret RNA blev oprenset under anvendelse Agencourt RNAClean XP Kit (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, US). Kort fortalt blev en 1,8 x volumen af ​​AMPure RNAClean XP Beads tilsat til rRNA forarmet RNA efterfulgt af inkubation i 15 minutter ved stuetemperatur, to 80% ethanol vaske og eluering i 30 pi RNase-frit vand. Kvaliteten af ​​rRNA depleteret RNA blev estimeret ved on-chip elektroforese (Picochip) af en prøve 1 pi på en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Savant Speed-vac (Thermo Fischer Scientific) blev anvendt til at reducere den resterende prøvevolumen til 9,5 pi efterfulgt af syntese af retningsbestemt, parret-end og indekserede RNA-Seq biblioteker under anvendelse af ScriptSeq v2 kit (Epicentre, en Illumina selskab) efter den anbefalede procedure. Kort fortalt rRNA udtømt RNA var kemisk fragmenteret (medmindre alvorligt forringet RNA fra FFPE væv blev anvendt i hvilket tilfælde yderligere fragmentering blev udeladt), følge proceduren beskrevet i tillægget i ScriptSeq manualen og cDNA blev syntetiseret fra et kodet tilfældig hexamer. CDNA’et blev terminale tagget ved anvendelse af en 3′-ende blokeres og mærkede oligo efterfulgt af MiniElute (QIAGEN) oprensning. Di-mærkede cDNA blev derefter anvendt som template for PCR (10 cyklusser for FF prøver, 13 cykler for FFPE prøver) ved hjælp af FailSafe PCR Enzyme (Epicentre, en Illumina selskab), en fremadrettet primer og en indekseret /barcoded reverse primer. De amplificerede biblioteker blev oprenset ved anvendelse Agencourt XP Kit (Beckman Coulter). Kort fortalt blev en 1,0x volumen AMPure XP Beads (Beckman Coulter) tilsat til hver PCR-reaktion efterfulgt af inkubation i 15 minutter ved stuetemperatur, to 80% ethanol vaske og eluering i 20 pi RNase-frit vand. De kvaliteter af RNA-Seq biblioteker blev estimeret ved on-chip elektroforese (Høj følsomhed DNA-chip) af en prøve en pi på en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Den DNA-koncentration på bibliotekerne blev anslået ved hjælp af KAPA Bibliotek Kvantificering Kit (Kapa Biosystems) efter den anbefalede procedure og de medfølgende standarder. RNA-Seq biblioteker blev kombineret i 2 nm poolede bestande, denatureret og fortyndet til 10 PM med forkølet hybridiseringspuffer og indlæses i TruSeq PE v3 flowceller på en Illumina CBOT efterfulgt af indekseret parret-ende sekventering (101 + 7 + 101 bp ) på en Illumina HiSeq 2000 ved hjælp TruSeq SBS Kit v3 kemi (Illumina).

Sekvensanalyse

Den analytiske arbejdsproces er beskrevet i dette afsnit og grafisk i figur S2. Forbundne de-multiplex fastq filer blev genereret ved hjælp casava software (Illumina) og indledende kvalitetskontrol blev udført ved hjælp FastQC [17] eller casava.

Forbundne de-multiplex fastq filer fra DNA-exome biblioteker blev importeret til CLC Genomics Workbench (CLC Bio, udgave 6.0.1), der kører på CLC Genomics Server (CLC Bio, versionen 5.0.1). Adaptor sekvenser og baser med lav kvalitet blev trimmet og læser blev kortlagt til HG19.

fjerne dublerede kortlagt læser

værktøj blev brugt til at fjerne parret læser, der har de samme start og slut koordinater og er således sandsynligvis PCR dubletter. Varianter blev påvist i de exome data med CLC Bio Probabilistic Variant Caller hjælp af følgende parametre: Minimum dækning = 10; Variant sandsynlighed = 90,0; Maksimale forventede varianter = 4; Krav om læser i begge retninger understøtter opkaldet.

Forbundne de-multiplex fastq filer fra RNA-Seq biblioteker blev trimmet for strækninger af adapter-sekvenser, indtrådt i en enkelt læser om muligt efterfulgt af kvalitet trimning ved hjælp af kommandoer fra CLC Assembly Cell (CLC Bio, udgave 4.012.84829). Dette resulterede i tre forskellige fastq filer: parret-end data, single-end data efter sammenføjning af parret læser, og single-end data efter fjernelse af en af ​​de parrede læser skyldes f.eks lav kvalitet. Alle tre typer af fastq filer blev derefter importeret batchvis i CLC Genomics Workbench (CLC Bio, udgave 6.0.1), der kører på en CLC Genomics Server (CLC Bio, udgave 5.0.1) ved hjælp af CLC Server kommandolinjeværktøjer (CLC Bio, udgave 1.7.1). Den importerede høj kvalitet læser blev kortlagt mod gen-regioner og udskrifter kommenterede fra Human NCBI REFSEQ 30 oktober 2012 i to kørsler af RNA-Seq Analyse værktøj CLC Genomics Workbench. RNA-seq værktøj blev kørt med

Brug reference med anmærkninger

mulighed. Med denne mulighed, lyder kortlægges mod sekvenser svarende til den kommenterede gen og transcript sekvenser. I det første løb, matcher kun til den forreste streng af generne blev accepteret (ved hjælp af streng-specifikke-forward option); i det andet løb, den læser, der ikke blev kortlagt i den første kørsel blev kortlagt kun tillader matcher til den omvendte streng af generne (ved hjælp af streng-specifikke-baglæns option). For at estimere forurening med rRNA, lyder der ikke kortlægge den menneskelige transkriptom som defineret af RefSeq blev kortlagt streng specifik frem mod human rRNA (HSU13369, HSU13369, HSU13369 og NC_012920) og un-kortlagt læser blev derefter kortlagt streng specifik bagud mod menneskelig rRNA.

Kortlægning Reports

og

detaljeret kortlægning Rapporter

blev genereret fra hver RNA-Seq analyse for hver prøve, der udføres fra CLC Genomics Workbench i Microsoft Excel-format, der er gemt som individuelle tabulatorseparerede tekstfiler, og specifikke data blev efterfølgende ekstraheret og undersøgt. For hvert forsøg, gen-wise kortlægning matricer af både fremad og bagud RNA-Seq analyser mod den menneskelige transkriptom blev eksporteret fra CLC Genomics Workbench som tabulatorseparerede tekstfiler til efterforskning og statistisk analyse i R computing miljø (udgave 3.0.1 til Windows [18]). Disse gen-wise kortlægning matricer sammenfatter kortlægning resultater i kolonner af RPKM værdier og tæller i læser kortlægning til forskellige regioner, såsom gen, exon, exon-exon og exon-intron. Matricer af “total exon læser” tæller blev udvalgt fra de gen-wise kortlægning matricer og analyseret i R-pakken

Empirisk analyse af Digital genekspression data i R

(kantskærer, version 3.2.3 [19] – [ ,,,0],23]) ved hjælp af multidimensional skalering (MDS) værktøj til eksplorativ analyse og de forskellige tilgængelige statistiske værktøjer til identifikation af forskelligt berørte gener. R pakke Hexbin blev brugt til plotte RNA-Seq baserede udtryk profiler (base på RPKM værdier) ved sekskantede skraldespande. Streng specificitet blev estimeret som fraktionen af ​​samlet gen læser kortlægning i fremadgående retning i forhold til det samlede antal læser kortlægning i begge retninger. Gener med færre end 10 læser kortlægning i fremadgående retning blev udeladt. For at estimere den del af duplikerede sekvenser i RNA-Seq data indlæg mapping (fremad), blev BAM-filer eksporteret fra CLC Genomics Workbench og analyseret ved hjælp af MarkDuplicates redskab i Picard værktøjer (Picard-værktøjer-1,47, [24]).

tiltrædelse af data

Alle data ligger til grund for resultaterne, der er beskrevet i manuskriptet er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Adgang til sekvensdata, der indeholder person, identificerende information, behov underskrift på en kontrolleret adgang form og kan tilgås på Det europæiske Genome-phenome Archive [25] ved hjælp af undersøgelsen ID EGAS00001000737 efter anmodning til MOMA Data Access Udvalg. Expression matricer er tilgængelige uden restriktioner gennem ArrayExpress [26] under tiltrædelsen E-mtab-2523.

Resultater

Vi studerede den potentielle anvendelse af FFPE prøver i NGS-baserede retrospektive og prospektive kliniske studier, fokuseret på påvisning af systematiske effekter af fiksering processen om variant opkald i DNA-Seq og på udtrykket profiler i RNA-Seq.