PLoS ONE: Potentiale Kombinatorisk Anti-Cancer Therapy i ikke-småcellet lungekræft med traditionel kinesisk medicin Sun-Bai-Pi Extract og Cisplatin

Abstrakt

Traditionel lungekræft behandlinger indebærer kemiske eller strålebehandling efter kirurgisk tumor fjernelse; Men disse procedurer ofte dræbe normale celler samt. Nylige undersøgelser tyder på, at kemoterapi, når det kombineres med Traditionel kinesisk Medicin kan tilbyde en ny måde at behandle kræft.

In vitro Salg tests måler induktionen af ​​autofagi og /eller apoptose blev anvendt til at undersøge cytotoksiciteten af ​​SBPE, der almindeligvis anvendes til lungeinflammation på A549-cellelinje. Resultaterne indikerede, at intercellulære niveauer af P62 og Atg12 blev forøget, LC3-I blev spaltet til LC3-II, og autofagi blev induceret med SBPE kun. Efter 24 timer blev den apoptotiske mekanisme induceret. Hvis Cisplatin blev tilsat efter cellerne nåede den autophagy tilstand, vi observerede synergistiske virkninger af de to kunne opnå tilstrækkelig død lungecancerceller. Derfor kunne Cisplatindosis anvendes til at inducere apoptose halveres, og mængden af ​​tid, der kræves for at opnå den inhibitoriske koncentration på 50% var også halvdelen af ​​det oprindelige. Ud over at fremkalde autophagy inden for en kortere periode, den SBPE og kemoterapi kombineret medicinsk behandling var i stand til at nå målet om en hurtig lav dosis kræftcelle elimination. Desuden, SBPE blev påført med gemcitabin eller paclitaxel, og fandt, at kombinationsbehandlingen faktisk opnå forbedrede lungecancer celledræbende virkninger. Imidlertid kan SBPE også være mindre toksiske for normale celler

Henvisning:. Tseng C-Y, Lin C-H, Wu L-Y, Wang J-S, Chung M-C, Chang J-F, et al. (2016) Potentiel Kombinatorisk Anti-Cancer Therapy i ikke-småcellet lungekræft med traditionel kinesisk medicin Sun-Bai-Pi Extract og Cisplatin. PLoS ONE 11 (5): e0155469. doi: 10,1371 /journal.pone.0155469

Redaktør: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung University, TAIWAN

Modtaget: Februar 29, 2016 Accepteret: April 30, 2016; Udgivet: 12. maj 2016

Copyright: © 2016 Tseng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:.. Dette arbejde blev støttet af bevilling fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi (NSC-102-2320-B-033-001-MY3) i Taiwan

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

I Taiwan, opstår ca. 10.000 nye lungekræfttilfælde hvert år og 7000 mennesker dør af lunge cancer årligt [1], som er større end dem med colorectal, hals-, bryst-, prostata- og mavekræft kombineres. Disse tal fortsætter med at vokse hurtigt hvert år. Der er mange årsager til lungekræft, og tidlige symptomer er ikke altid indlysende. Lungekræftpatienter er ofte ikke klar over de tidlige symptomer og miss muligheder for tidlig diagnose og behandling [2]. Ifølge Department of Health statistikker, passiv rygning, hot tjære dampe, stråling, asbest, fabrikken røg, sod, fint suspenderede partikler, og støvstorme er de primære årsager til lungekræft [3-14]. Lungecancere klassificeres som små celle- eller ikke-småcellet carcinomer efter om de er ikke-epitel- eller epitel-afledte, henholdsvis [15]. Småcellede carcinomer er meget ondartet og kan let metastaserer, især hvis celle- størrelsen er meget lille [16]. Derfor kemisk behandling er den foretrukne behandlingsforløb for småcellet carcinom [17-19]. Lateral tilfælde kan opdeles i pladecellecarcinom, adenocarcinom (herunder bronchioloalveolar carcinom, også omtalt som alveolær karcinom), storcellet carcinom, glandulær pladecellecarcinom, carcinoid tumorer, bronkial adenocarcinom (herunder adenoid cystisk carcinom eller mucinøs epitelcarcinoma), etc [15, 20, 21]. Behandlinger for disse typer af kræft primært involverer kirurgisk excision suppleret med stråling og kemoterapi [22, 23].

Til behandling af konventionelle ikke-småcellet lungekræft efter kirurgisk excision, kemoterapi dræber normale celler sammen med kræft dem . Jo længere kemoterapi administration fortsætter, jo stærkere modstand, der er udviklet af kræftceller [24, 25]. Selv om denne behandlingsmetode kan tilvejebringe det ønskede resultat, det øger også risikoen for samtidige sygdomme [25]. Der er behov for højere doser af kemoterapi narkotika i de terminale stadier af kræft for at opnå de samme virkninger af lavere doser administreret i løbet af de tidligere sygdom stadier [20]. Bivirkningerne ved de traditionelle behandlingsmetoder gør dem vanskeligere og mindre egnet til patienter med mere avancerede stadier af kræft eller dårligere helbred [26-29]. Baseret på de bivirkninger og skader forårsaget af disse behandlinger, de seneste undersøgelser fokuseret på tumorcellerne og betalt mere opmærksom på cellulært immunterapi, genterapi, target medicinsk behandling osv [30-34]. Nogle undersøgelser har forsøgt at anvende kinesiske plantelægemidler til behandling af kræft [35-38]. Disse undersøgelser viste, at en lang række lægeurter, såsom kinesisk taks, Thalictrum formue, plumbagin eller Ganoderma lucidum [39-42], viste sig at reducere unormal inflammation [43-45] og hurtigt fremkalde tumor celle apoptose [46-48] .

Sun-Bai-Pi (SBP) er roden bark af Morus alba L. Ifølge Encyclopedia of Traditionel kinesisk medicin “Compendium of Materia Medica,” SBP er en vigtig medicin, der bruges til at fjerne vanddamp fra lungerne og behandle spytte blod, opvarmet tørst, ødem, oppustethed af maven, oppustethed, urin spor problemer, asthenic hovedpine, indre energi-mangel, hoste, betændelse, diabetes, cancer, hepatitis og hjertesygdomme [49]. Tidligere undersøgelser indikerede, at de vigtigste ingredienser i Sun-Bai Pi Extract (SBPE) inkluderet Morusin, Prenylflavonoid, og Benzofuran [50-53]. Det er antioxidanter, der kan reducere NF-KB-aktivitet i kræftceller, forårsager cytotoksicitet, og hæmmer kræft metastase, men deres virkningsmekanisme er stadig uklart, [54-57]. Derfor vil der ud på at undersøge mekanismerne i SBPE-induceret kræft celledød, vi også nødt til at etablere passende synergistisk kræftbehandling, der kombinerer kinesiske plantelægemidler og kemoterapi narkotika. I denne undersøgelse opdagede vi, at der ud over langsigtet apoptoseinduktion, SBPE inducerede også autofagi i A549 lungecancerceller. Når kemoterapi narkotika, Cisplatin, blev tilsat til autophagic A549-celler, viste resultaterne, at SBPE forbedret cancercelledrab effektiviteten af ​​kemoterapi narkotika, selv i reducerede doser.

Materialer og metoder Salg

Chemical

SBP indsamlet fra Di Lian Sheng Pharmaceuticals (DLSP, Taiwan), der blev ekstraheret ved varmt vand i 30 minutter efterfulgt af centrifugering, reserve dialyse og protein depletion. Pelleten blev kasseret, supernatanten blev opsamlet og opbevaret ved 4 ° C. Cisplatin, gemcitabin, paclitaxel blev købt fra Sigma-Aldrich.

Cell kultur

De menneskelige lungekræft alveolære A549 celler og normal lunge fibroblast WI 38VA13 Delområde 2RA celler blev opnået fra Bioresource Indsamling og Forskningscenter (BCRC, Taiwan). Celler blev dyrket i Hams F-12K-medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. Til eksperimenterne blev cellerne behandlet med SBPE for flere tidspunkter eller behandlet med SBPE i 6 timer efterfulgt af den yderligere eksponering kemoterapi narkotika for yderligere tidspunkter.

MTS cytotoksicitetsassays

Levedygtighed blev detekteres ved anvendelse af et kommercielt MTS assay indkøbt fra Promega (Madison, WI), måling mitokondrie succinatdehydrogenase aktivitet via omdannelse af MTS og phenazinemethosulfate til formazan. Efter behandling blev en blanding af 10 pi vandopløseligt kit reagens plus 190 pi frisk medium tilsat til hver brønd for en 1 times inkubation ved 37 ° C i mørke. Supernatanter (100 pi /brønd) blev opsamlet, og absorbansen af ​​den genererede formazan blev målt ved 490 nm med en microreader.

Autophagy immunfluorescens

Efter fiksering og permeabilisering, uspecifik reaktivitet blev blokeret af tilsætning af 2% normalt gedeserum med 0,02% NaN

3. A549-celler blev derefter inkuberet med primære anti-LC3 (Abcam) og anti-LAMP-1 (Abcam) monoklonale antistoffer ved en 1: 200 fortynding i 24 timer, 4 ° C. Sekundært antistof mærket med Alexa Fluor 488 (Invitrogen) eller Alexa Fluor 594 (Invitrogen) blev anvendt, og objektglas blev dækket med Prolong Gold (Invitrogen) anti-fade montering medier før brug. Alle billeder blev observeret på et Olympus IX51 mikroskop.

Måling af caspase 3-aktivitet

Caspase-aktivitet blev vurderet med anvendelse af Caspase-Glo 3/7 assay (Promega). Efter SBPE behandling blev dyrkningspladerne fjernet fra inkubatoren og fik lov at ækvilibrere til stuetemperatur i ca. 30 min, blev derefter Caspase-Glo 3/7 assayreagens (200 uL /​​brønd) anvendes i henhold til producentens anvisninger. Relative luminans Unit (RLU) udsendes af produktet blev målt under anvendelse af en microreader.

Western blot-

Proteiner (40 ug /brønd /prøve) adskilt electrophorectically på SDS-geler blev overført til nitrocellulosemembraner. Ikke-specifik reaktivitet af membranerne blev blokeret, og primær anti-P62 (Abcam), anti-ATG-12 (cellesignalering), anti-p53 (Abcam), anti-LC3 (Abcam), anti-Bcl-2 (cellesignalering) , anti-Bax (cellesignalering), anti-Bad (cellesignalering), blev anti α-tubulin (Abcam) probet med passende fortyndinger. Sekundært gede-anti-muse IgG eller anti-kanin IgG konjugeret med HRP blev anvendt, og blottene blev visualiseret ved forøget kemiluminescens (Promega ™ ECL Western Blotting Substrate) og analyseret på Odyssey Infrarød imaging system (LI-COR Biosciences) (Lincoln, NE).

Cell cyklus analyse

Efter behandlingerne blev cellerne opsamlet og fikseret i iskold 75% ethanol natten over ved -20 ° C. Cellerne blev efterfølgende centrifugeret ved 300 x g i 5 min og inkuberet med en propidiumiodid (PI) arbejdsopløsning (100 ug /ml PI og 100 ug /ml RNaseA) i 30 minutter ved 37 ° C. Cellecyklusfordeling blev analyseret under anvendelse af et FACScan flowcytometer og analyseret med anvendelse af ModFit software (Becton Dickinson, CA). Salg

Statistik

Til statistisk analyse blev hvert eksperiment udført tre gange og gentaget tre gange . Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± SD for tre uafhængige forsøg, og forskellene mellem grupperne blev analyseret ved anvendelse Student t-tests med GraphPad statistik software. *, ** Og *** angiver p 0,05, s 0,01 og p 0,001 signifikant forskel, sammenlignet med den negative kontrol. # Og ## show p 0,05 og p. 0,01, sammenlignet med prøver med eller uden SBPE-behandling

Resultater

Cell Levedygtighed

Vi brugte MTS test til påvisning af virkninger SBPE havde på levedygtigheden af ​​WI 38VA13 Delområde 2RA celler, normale lunge fibroblastceller og A549 lunge kræftceller. Som vist i figur 1a, fandt vi, at 24 timer efter administration SBPE blev vitalitet af A549-celler reduceres, da SBPE forøges dosis. Cellelevedygtigheden efter administration 5 mg /ml var 85%, IC50 blev opnået efter administration af 9 mg /ml, og cellelevedygtigheden efter indgivelse 10 mg /ml var 23%. Tværtimod viste SBPE ingen signifikant toksicitet mod normale WI38 celler ved den laveste testede dosis, men signifikant celledød forekom inden for 24 timer efter behandling med SBPE på 5 og 10 mg /ml. Hvis SBPE doser på 5 mg /ml og 10 mg /ml blev brugt på forskellige tidspunkter, fandt vi, at SBPE forårsaget betydelig celledød inden 24 timer.

(a) Udførte levedygtighed celle test ved at administrere forskellige koncentrationer af SBPE at WI38- og A549-celler. (B) Administered 5 mg /ml og 10 mg /ml SBPE til A549 og inkuberes cellerne i forskellige tidspunkter. Derefter brugte vi MTS reagens at teste deres levedygtighed.

SBPE induceret kræft Cell Autophagy Effect

For at vurdere den mekanisme, antager vi, at forud for celledød, SBPE inducerer kræftcellerne til at blive autophagic. Som vist i figur 2a og 2b, angivet fluorescensmikroskopi observationer at uanset SBPE dosering. Når de to fluorescerende farver blev overlejret og kvantificeret, de autolysosome indholdet øges gradvist over tid. Derfor er forholdet mellem autolysosome formation for celler administreret med SBPE 10 mg /ml steg betydeligt som funktion af SBPE dosis (figur 2b). Efter forholdet amplifikation den autophagosome og lysosom overlaped, hvilket indikerer, at SBPE faktisk kan simulere A549-celler til at blive autophagic (Fig 2c). Den statistiske diagrammet i fig 2d viste, at inden for 8 timer SBPE (10 mg /ml) behandling, 70% af A549-celler genereret lysosomal autophagy, og at steg til 90% i 12 timer. Western blots (Fig 2e) indikerede, at p62-proteinet signifikant forøget fire gange større end i kontrolgruppen (fig 2f) i løbet af 8 timer, og LC3-I blev spaltet til LC3-II i denne periode. Disse resultater betyder, at SBPE behandling inducerede cancercellerne at blive autophagic, der toppede inden for otte timer. Desuden med hjælp autophagy inhibitor, chloroquin (CQ) plus SBPE (10 mg /ml), vi fandt cellelevedygtigheden blev markant gendannes på 6 timer og 24 timer efter behandling (S1 Fig).

SBPE 5 mg /ml (a) og 10 mg /ml (b) blev hver tilsat cellerne og inkuberet i 2, 4, 6, 12 og 24 timer. Immunfarvning blev anvendt til at mærke autofagi protein LC3 (grøn), LAMP-1 (rød), og DAPI (blå) cancerceller. Forstørrelse var 400X. (C) Forstørret cellerne inkuberet i seks timer ved 630x at observere autofagi distribution. (D) overlejring af den grønne fluorescens (LC3) og rød fluorescens (LAMP-1), og beregnet antallet af celler med autophagic lysosomer. Den lodrette akse repræsenterer det samlede celleantal pr arealenhed divideret med antallet af celler med autophagic lysosomer. (E) Western blots blev brugt til at observere effekterne SBPE havde på reguleringen af ​​A549 celle autophagy relaterede proteiner, og fandt, at SBPE inducerede celle autophagy, som steg over tid og toppede på otte timer. Alle gelerne er gennemført under de samme forsøgsbetingelser. (F) statistiske analyser for proteiner forestillinger.

SBPE induceret apoptose

SBPE var cytotoksisk og hastigheden af ​​autophagy induktion styrket, da dosering og administration tid øges. Men det er stadig uvist, om administration af SBPE mere end 12 timer, kan fremkalde tumorceller bliver apoptotiske. Derfor blev den apoptotiske markørprotein Caspase3 /7 detekteret at afgøre, om det er genereret over tid. Figur 3a viser, at udførelsen kapacitet Caspase3 /7 inden A549 celler gjorde forstærke som SBPE administration gang forhøjet. Imidlertid amplifikationen startede ved 12 timer og nåede peak performance kapacitet på 24 timer. Baseret på afkald resultater kan SBPE faktisk initiere apoptose mekanisme efter 12 timer og kan fremme tumorcelle autofagi inden for otte timer. Western blots (Fig 3b) indikerede, at manifestationer af den pro-apoptotiske proteiner p53, Bax, og Bad steget over tid, mens det anti-apoptotiske protein Bcl-2 faldt betydeligt. Ifølge fig 3d, efter A549 lungecancerceller blev behandlet med SBPE (10 mg /ml) i forskellige tidsrum, blev et flowcytometer anvendes til at observere status cellefordeling under cellecyklussen. Resultaterne indikerede, at som eksponeringstid forøges, antallet af celler, der forbliver i G1 fase tendens til at stige, og forholdet mellem de S-fase celler steg som tiden skred frem, men faldende efter at have nået toppen ved 12 timer.

(a) Efter administration af SBPE 10 mg /ml; den Caspase3 /7 reagens blev anvendt til at påvise deres præstationer. (B) Virkningerne at SBPE har på protein kontrol faktorer relateret til A549 celle apoptose og anti-apoptose. Alle gelerne er gennemført under de samme forsøgsbetingelser. (C) Statistisk diagram for protein ydeevne. (D) FACS analyser for cellecyklus distribution og brug af ModFit LT software til at analysere cellecyklusfordeling.

Cisplatin og SBPE kombinationsbehandling kan reducere kræft Cell Levedygtighed

Ifølge fig 4, mellem 24 og 48 timer efter cisplatin blev indgivet til A549 lungecancerceller, dets cytotoksiske virkninger styrket, da cisplatinkoncentrationen forøget. Imidlertid kunne virkningerne kun nå IC50 48 timer efter 25 uM Cisplatin blev administreret, og behandlingen kan kun forårsage 33% celledød ved 24 timer mærket. Derfor har vi vedtaget kombinationsterapimetode hvorved SBPE blev administreret i seks timer og Cisplatin blev indgivet i 24 timer. Formålet var at bruge cisplatin behandling for at dræbe kræftcellerne efter celle autofagi er blevet stimuleret i håb om at denne kombination metode væsentligt kan styrke den cytotoksiske effekt samtidig med at Cisplatin dosis. Som vist i figur 4a, ved at administrere 10 uM og 25 uM af cisplatin i 48 timer efter at cellerne blev forbehandlet med SBPE (5 mg /ml) i seks timer, kan cancer cellelevedygtighed den reduceres med 52% og 37%, henholdsvis . Sammenlignet med resultaterne, fandt vi, at cellerne forbehandlet med SBPE kun behov Cisplatin 10 pM efter 48 timer for at opnå IC50, som er den samme ydelse, der kan opnås af cisplatin 25 uM alene på samme tidspunkt. Hvis cisplatin koncentrationen øges til 25 pM, er tumoren celledræbende effekter forbedret. Som vist i figur 4b, hvis SBPE 10 mg /ml blev tilsat før cisplatin behandling i 24 timer, fandt vi, at cancercellelinier levedygtighed efter 5 pM, 10 pM, og 25 uM Cisplatin behandlinger kan reduceres til 58%, 50%, og 36%, hhv. Cisplatin 25 uM alene kan kun nå IC50-koncentration på 48 timer i fravær af SBPE. De cytotoksiske virkninger af cisplatin 10 uM kan opnå IC50 efter behandling i 48 timer. Beviserne viste, at den forbehandlede SBPE faktisk væsentligt kan styrke kræftcellen cytotoksiske virkninger af cisplatin samtidig reducere Cisplatin dosis eller behandling tid.

A549 tumorceller overlevelse analyser efter 1 uM, 5 uM, 10 uM og 25 uM af cisplatin blev administreret og inkuberet i 24 og 48 timer. MTS-reagens anvendtes til påvisning overlevelsesprocenten. Forbehandling med hjælp SBPE 5 mg /ml (a) og SBPE 10 mg /ml (b) doser af cisplatin blev tilsat og inkuberet i 24 og 48 timer. MTS reagens blev anvendt til at påvise de overlevelsesrater.

apoptose induceret af cisplatin og SBPE kombinationsbehandling

Western blots blev brugt til at observere, hvordan kombinationsbehandlingen ændret regulering af apoptose proteiner (figur 5a); og resultaterne viste, at pro-apoptotiske proteiner p53 (figur 5b), Bax (fig 5d), og Bad (Fig 5e) steg som tiden skred frem inden for 24 timer. Dette var især tilfældet for p53, hvilket væsentligt forøget efter kun 12 timer. Den anti-apoptotiske protein, Bd-2, faldt betydeligt som tiden skred frem (Fig 5c) og blev reduceret med 32% efter 24 timer, som opnåede virkningerne en dag tidligere end reduktionen rate 37% opnået efter 48 timer, når kun Cisplatin var administreret.

Apopthsis induceret af SBPE og cisplatin kombinationsterapi (a) 6 timer efter behandling under anvendelse af 10 mg /ml SBPE og 25 uM af cisplatin blev tilsat og inkuberet i 24 og 48 timer. Western blots blev brugt til at observere virkninger på celle apoptose fænomen relaterede proteiner (p53, Bcl-2, Bax, og Bad). Alle gelerne er gennemført under de samme forsøgsbetingelser. Kvantificering diagram for p53 (b); BCL-2 (c); Bax (d); Bad (e).

Etablering af en optimal SBPE Koncentration til at fremkalde kræft Cell cytotoksicitet og en Optimal tid til at administrere yderligere Kemoterapi narkotika

Vores cytotoksicitet analyser viste, at som SBPE koncentrationer og behandlingstider hæves så gjorde deres cytotoksiske virkning. Derfor har vi etableret en sammenhæng mellem A549 kræftceller, SBPE koncentrationer og eksponering gange for at optimalt fremkalde A549 celle autophagy (figur 6). Ved hjælp af Matlab 2015a gennemførte vi en tredimensionel kvantificering af de eksisterende (a) levedygtighed celle værdier; (b) SBPE koncentrationer: og (c) SBPE eksponeringstider for at afsløre eventuelle relationer. Ifølge fig 2, fandt vi, at når cellelevedygtigheden lå ved 70%, blev ca. 70% af cellerne induceres til at blive autophagic. På dette tidspunkt, kunne Cisplatin derpå tilsættes for at accelerere de cytotoksiske virkninger af behandlingen. Ved en cellelevedygtighed på 70%, vi derefter plukkes ti tidspunkter på denne dosering og udledt en relationel udtryk anvendt til at estimere sammenhængen mellem tid og SBPE dosering. Den relationelle udtryk for den tid og dosering af SBPE på A549 lungekræft celle co-inkubation var som følger: Hvor

y

repræsenterer agenten koncentrationen givet til cellerne,

x

repræsenterer tiden implementering og 5,7665 er beregningen konstant.

MTS cytotoksicitet test opdagelse værdi blev indgået MATLAB matematiske analyse software via en statistisk software til at skabe et tredimensionelt koordinatsystem diagrammet på forholdet mellem koncentration, tid og levedygtighed . XYZ var variablerne. X-aksen repræsenterer SBPE koncentration X = [X, x1]; matricer X og x1 repræsenterer SBPE koncentrationer på 0 mg /ml, 1 mg /ml, 5 mg /ml, 10 mg /ml, 25 mg /ml, og 50 mg /ml; Y-aksen repræsenterer SBPE handling tid Y = [Y, y1]; matricer Y og y1 repræsenterer 24 og 48 timer; Z-aksen repræsenterer cellernes levedygtighed Z = [Z, Z1]; og matricer Z og z1 repræsenterer levedygtighed efter SBPE administration i 24 og 48 timer. De datamatricer blev tilført ved anvendelse surf kommandoer og en tredimensional overflade diagram blev afbildet. Farverne repræsenterer handlingen relationer mellem de tre.

Kontrol af optimale dosering og koncentration for SBPE at fremkalde kræft Cell Autophagy

Ifølge figur 2, fandt vi, at når cellen levedygtighed sats var på 70%, ca. 70% af cellerne blev induceret til at blive autophagic. Cisplatin kan tilsættes på dette tidspunkt for at fremskynde de cytotoksiske virkninger. Ifølge fig 6 og vist for celler at opnå en autophagic tilstand formel, skal cellerne gives SBPE for en vis periode, for at de kan nå en 70% overlevelsesrate. Vi gennemførte MTS test på SBPE 5 mg /ml (32 timer), 6,25 mg /ml (30 timer), 7,5 mg /ml (16 timer), og 10 mg /ml (6 timer) for at kontrollere, at dette tidsramme billede optimal dosering og koncentration for SBPE at fremkalde kræft celle autofagi. Resultaterne indikerede, at cellelevedygtighed kunne holdes på 70% som vist i fig 7a. Vi udførte fluorescensmikroskopi og fandt, at LC3 overlappet med LAMP-1, når SBPE blev indgivet ved disse 4 koncentrationer. Denne observation repræsenterede et overlap af autophagosome og lysosomet. Derfor administration SBPE for en bestemt periode kan faktisk stimulere A549 celle autophagy (figur 7b).

(a) Koncentration og tid verifikation mod levedygtighed blev udført i overensstemmelse med de matematiske analyseværdier genereret af statistisk software MATLAB som vist i figur 6. SBPE koncentrationer på 5 mg /ml, 6,25 mg /ml, 7,5 mg /ml, og 10 mg /ml; tidsrammer var 32, 30, 16 og 6 timer; og MTS-reagens blev anvendt til at påvise deres aktiviteter. (B) Immunfarvning blev anvendt til at mærke autophagy protein, LC3; lysosomale markør, LAMP-1; og nuklear markør, DAPI. Cellerne blev inkuberet i otte timer og blev forstørret ved 630x at observere autofagi distribution. Pile angiver autophagosomes (overlappede med grøn og rød).

Effekter at kombinere SBPE til kemoterapi narkotika Gemcitabin og paclitaxel har på kræft Cell Levedygtighed Rate

Ifølge figur 8, den cytotoksiske virkninger af gemcitabin og paclitaxel indenfor 72 timer kan blive forbedret, da SBPE koncentrationen forøges. Imidlertid Gemcitabin påkrævet administration af 100 pM i op til 72 timer og Paclitaxel påkrævet administration af 100 uM i op til 48 timer for at opnå IC50. Svarende til Cisplatin, vi pre-behandlede celler med SBPE i seks timer og derefter tilsat den Gemcitabin eller Paclitaxel forening for at observere, om SBPE signifikant kan forøge de cytotoksiske virkninger af gemcitabin eller paclitaxel samtidig reducere deres dosering. Resultaterne viste, at efter behandling ved anvendelse af 50 uM af gemcitabin og paclitaxel i 48 timer blev overlevelsesrater effektivt reduceret fra 78% til 44% og 65% til 45%, hhv. Sammenlignet med ikke-behandlede resultater (figur 8a og 8e), de SBPE forbehandlet celler kun kræves halvt så meget Gemcitabin eller paclitaxel i 48 timer for at opnå IC50.

(a) A549 tumor cellelevedygtighed analyse efter administration af gemcitabin. Efter 1 pM, 5 pM, 10 pM, 50 pM og 100 pM af gemcitabin blev administreret i 24 og 48 timer, MTS-reagens blev anvendt til at påvise deres aktiviteter. For det andet efter 6 timers behandling med 10 mg /ml SBPE; Gemcitabin blev tilsat i 24 timer (b), 48 timer (C) og 72 timer (D). (E) A549 tumor cellelevedygtighed-analyse efter behandling med 1 pM, 5 pM, 10 pM, 50 pM og 100 pM paclitaxel og inkuberet i 24 og 48 timer. MTS-reagens blev anvendt til at påvise deres aktiviteter. For det andet efter 6 timers behandling med 10 mg /ml SBPE; Paclitaxel behandling blev sat i 24 timer (f), 48 timer (g) og 72 timer (h).

Diskussion

Der er mange bivirkninger forbundet med de eksisterende traditionelle kemoterapi narkotika [26-29]. For eksempel, Cisplatin, en kemoterapi stof almindeligt anvendt til behandling af lungekræft har en lang svartid, er tilbøjelig til medikamentresistens, og langtidsanvendelse kan inhibere apoptose eller frembringe ubehagelige bivirkninger for patienterne [58]. En anden kemoterapi stof, Gemcitabin kan forårsage ubehagelige symptomer, såsom svimmelhed, opkastning, leukopeni, trombocytopeni, og nyretoksicitet [59]. Traditionelle kinesiske plantelægemidler er begyndt at dukke op som anti-cancer medicin [35-38]. På nuværende tidspunkt er cirka to tredjedele af kræftpatienter er på midten til slutningen-fase af deres diagnose på grund af diagnostiske teknik restriktioner og reducerede kirurgiske muligheder [2, 15-23]. Patienter i disse fremskredne stadier er for fysisk svage til at modstå de traumer af kirurgi og de toksiske bivirkninger af kemoterapi. Konventionel cancer kirurgi, stråling, og kemoterapi behandlingsmetoder alle har begrænsninger, såsom omfanget af patienternes patologi, behandlingstid, alder, fysisk tilstand, eksistensen af ​​komplikationer, og lægemiddelallergier. Nogle patienter kan være tilbageholdende med at acceptere disse behandlingsmetoder eller ville stoppe behandlingen på grund af bivirkninger [2, 15-23]. Lægeurter mangler disse restriktioner og kan bruges i overensstemmelse hermed [60, 61]. Fordelene ved kinesiske plantelægemidler er mere end blot de cytotoksiske virkninger mod kræftceller, de også forbedre fordelene ved fysisk kondition, fremkalde immune cytokiner, og styrke cellulær immunitet; derved, at yde beskyttelse mod kræft. Men der er ingen store kliniske forsøg med traditionel kinesisk medicin, der gentagne gange viser deres “evidensbaseret medicinsk” effekt. Derfor er lægeurter stadig klassificeres som sekundære og alternativ medicin til kræftbehandling.

I denne undersøgelse har vi undersøgt, om den traditionelle urtemedicin, SBPE, kan fremkalde tumor celle autofagi. Vi yderligere administreres cisplatin at observere, om SBPE kan dræbe lunge kræftceller samtidig reducere Cisplatin doser. Endelig har vi sammenlignet de virkninger af andre kemoterapi lægemidler i håb at etablere en kinesisk-vestlig kombinationsbehandling behandling. Vores resultater viste, at SBPE ikke ville fremkalde signifikant cytotoksicitet til normale lungeepitelceller men ville medføre lungekræft celledød under de samme koncentrationer. Vi fandt også, lungecancerceller ville nå deres IC50 efter behandling med 10 mg /ml SBPE i 24 timer. Selvom den mekanisme af SBPE nederste cytotoksicitet mod normale celler forbliver ukendt, disse resultater betyder, at SBPE effektivt kan dræbe lunge kræftceller uden at skade normale celler.

Når autophagy opstår, LC3-mærkede autophagosomes danner autophagic lysosomer med LAMP-1 -mærkede lysosomer. Vi fandt, at SBPE kunne fremkalde autofagi af A549 celler, og dette blev mere indlysende som tiden skred frem. De autophagic lysosomer i de behandlede celler nåede et maksimum volumen otte timer efter administration af lægemidlet. Ekspression af det mærkede, lysosomale protein, P62, og det mærkede, autophagosomal protein, Atg12, bekræftet vores fluorescerende data. Otte timer efter administration af lægemidlet, LC3-I spaltede den maksimale LC3-II. Efter 12 timer lungecancerceller begyndte at apoptose, vist ved forøget protein ekspression af den apoptotiske og pro-apoptotiske markører og den reducerede ekspression af det anti-apoptotiske markør. Baseret på resultaterne beskrevet ovenfor kan SBPE fremkalde lungekræft celle apoptose efter autofagi. Men selv om antallet af celler i G1-fasen havde tendens til at stige efter 24 timer under cellecyklussen analyse, at antallet af celler i G2 /M-fase ændredes ikke, og der var ingen tegn viser, at SBPE kan forårsage cellecyklusstandsning for kræftceller . Interessant, at antallet af celler i S-fase steg fra 31% til 38% som SPBE behandling tiden skred frem, men faldt tilbage til 30% efter 24 timer. Årsagen til denne virkning er ukendt, men det anslås, at de fleste af cellerne bevæget sig i retning apoptose og en lille del af cellerne bevæges mod G1 fasen efter 24 timer.

Ifølge figur 4, det tog 48 timer at nå IC50 efter behandling af A549-celler med kemoterapi stof, Cisplatin. Yderligere forskning fandt, at forbehandling af lungecancerceller med 10 mg /ml SBPE i seks timer forårsagede 30% af de behandlede celler til at dø og induceret autophagy i 50% af disse celler. Cancercelle overlevelsesrate tendens til at falde i celler forbehandlet med SBPE sammenlignet med grupper, der ikke var forbehandlet. Endvidere blev cisplatin koncentration og behandling tid, der kræves for at nå IC50 væsentligt reduceret. Tendensen diagrammet i figur 6 viste, at jo større SBPE koncentration og behandlingstid, jo stærkere de cytotoksiske virkninger inden for 24 timer. Ifølge vores Matlab analyse diagram, fandt vi, at når koncentrationsniveauer nået den blå region i diagrammet, cytotoksicitet var næsten 80%. Behandling med 5 mg /mL SBPE i 24 timer reducerede cellelevedygtighed med op til 80%.