PLoS ONE: Støtte en rolle for GTPase Rab7 i Prostata Cancer Progression

abstrakt

Invasion og efterfølgende metastase er den største dødsårsag fra de fleste kræftformer herunder prostatacancer. Heri vi rapportere om de potentielle tumor undertrykkende egenskaber Rab7, en GTPase, der regulerer handel med lysosomer. Bevægelsen af ​​lysosomer til celleoverfladen som respons på miljømæssige signaler øger udskillelsen af ​​proteinaser og celleinvasion. Vi bestemt, at Troglitazon og andre medlemmer af thiazolidindion familie hæmme celle-overflade rettet lysosomer menneskehandel og cathepsin B sekretion gennem en Rab7-afhængig mekanisme. Desuden blev Rab7 shRNA udtrykkende celler sig at være mere invasive

in vitro

in vivo

. Øget invasionsevne blev ledsaget af forhøjet ekspression af c-Met receptor og langvarig nedstrøms signalering og dermed støtte en rolle for Rab7 som en mediator af signalering nedregulering. Tilsammen disse resultater antydede, at Rab7 fungerer som en negativ regulator af prostata tumorvækst og invasion, hvilket giver yderligere bevis for dens potentiale som en tumor suppressor

Henvisning:. Steffan JJ, Dykes SS, Coleman DT, Adams LK , Rogers D, Carroll JL, et al. (2014) Støtte en rolle for GTPase Rab7 i Prostata Cancer Progression. PLoS ONE 9 (2): e87882. doi: 10,1371 /journal.pone.0087882

Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australien

Modtaget: August 18, 2013; Accepteret: 5 januar 2014; Publiceret: 5 feb 2014

Copyright: © 2014 Steffan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret af National Institutes of Health give NIH R01 CA104242. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende konflikter: BJW øjeblikket ansat af Astellas Pharma USA, Inc . et selskab med interesser i onkologiske lægemidler; men denne beskæftigelse sted efter manuskriptet færdiggørelse og virksomhedens område af interesse ikke udgør en direkte konkurrerende interesse. Alle andre forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om deling af data og materialer.

Introduktion

Dannelse af metastatiske foci fra en invasiv primær tumor er den afgørende begivenhed i processen førende til cancer-associerede dødsfald. Dødeligheden for sen-fase prostatacancer (metastatisk sygdom) er ikke væsentligt forbedret i det seneste årti; Derfor er der et akut behov for en forståelse af de underliggende mekanismer tumorinvasion og metastase, og udvikling af terapier til forebyggelse tumorudvikling. Den hepatocytvækstfaktor (HGF) -Met signalering akse er en vigtig regulator af tumorcelleinvasion og metastase [1]. Ligand-induceret c-Met-signalering er kendt for at inducere et epitel-mesenkymale overgang (EMT), hvori epitelceller mister celle-celle sammenvoksninger og indtage en mere motile, mesenkymale fænotype [2]. Induktionen af ​​EMT menes at forbedre tumorcellemigration og invasion gennem basalmembraner. Foruden Met signalering, kan andre faktorer inden for tumormikromiljøet såsom hypoksi, aerob glycolyse, og sure ekstracellulære pH (Phe) øge tumorcelleinvasion [3], [4].

Tumor invasion ofte kræver sekretion af proteolytiske enzymer, selv om nogle former for cellemigrering /invasion er protease-independen [5], [6]. Selvom proteinase sekretion kan forekomme via konstitutivt aktiv sekretion vej, har store roller til lysosomer-lokaliserede proteaser blevet påvist i tumorceller invasion [7], [8]. Vi har tidligere vist, at sure pHe og HGF inducerer handel med lysosomer til celleoverfladen, hvilket resulterer i øget cathepsin B sekretion [9], [10]. Dette er væsentligt som ændret cathepsin B og D lokalisering detekteres i bryst- og melanom modeller som reaktion på Ras transformation eller ændringer pHe [11], [12]. I tidligere publikationer, har vi vist, at den rumlige placering af lysosomer i tumorceller er vigtig for celleinvasion [10], [13]. Når lysosomer er placeret tættere til celleoverfladen, en stigning i udskilte proteaser og detekteres celleinvasion; henviser, når lysosomer er placeret nærmere cellekernen. (væk fra celleoverfladen, dvs sidestillet til cellekernen) tumorceller udskiller færre proteinaser og er signifikant mindre invasiv

Lysosomer handles hele celler langs mikrotubuli og /eller actinfilamenter anvender molekylære motor proteiner, såsom dyneins, kinesiner og /eller myosin familiemedlemmer [14]. Desuden flere GTPaser såsom RhoA, Rab7, Rab27, og ARF familiemedlemmer regulere motorisk protein aktivitet eller rekruttering, således at regulere fordelingen af ​​lysosomer og andre endocytiske vesikler [15], [16].

Rab7 er en regulator af intracellulær endocytiske /membran menneskehandel og er involveret i mange sygdomstilstande, herunder cancer og flere infektionssygdomme (revideret i [17]). Rab7, med en af ​​sine effektorer, RILP (Rab7-interagerende lysosomalt protein), rekruttere dynein-dynactin motor komplekset til lysosomer letter lysosom handel langs mikrotubuli mod cellekernen [18]. Desuden foruden sin anerkendte rolle i vesikeltrafik, Rab7 har for nylig vundet opmærksomhed som en regulator af apoptose i respons på vækstfaktor tilbagetrækning [19] og er blevet foreslået at fungere som et tumorsuppressorprotein [20].

Inhibitorer af natrium-proton-vekslere (NHE’er) har vist sig at være meget effektive til at forebygge celle-overflade rettet lysosom handel og dermed mindske protease sekretion og celleinvasion [9], [10], [13]. EIPA (5 – (

N

ethyl

N

isopropyl) -amiloride) har vist sig at forhindre sure pHe og HGF-induceret celleoverflade-rettet lysosom handel; henviser, har medlemmer af den thiazolidindion familien af ​​forbindelser vist sig at forhindre sure Phe-induceret celleoverflade-rettet lysosom trafficking. Vores tidligere arbejde bestemmes forbindelser troglitazon og EIPA begge udnytte en Rab7-afhængig mekanisme til at fremkalde juxtanuclear lysosomet sammenlægning (JLA) [13]. Troglitazon er en af ​​flere medlemmer af thiazolidindion (TZD) familie af syntetiske high-affinitetsligander for transkriptionsfaktoren peroxisomproliferatoraktiveret receptor-γ (PPAR γ). Men disse forbindelser, herunder ciglitazon (Cig), rosiglitazon (Rosi, Avandia), og pioglitazon (Pio, Actos), udviser PPAR γ uafhængige effekter, og vores laboratorium har vist, kraftige virkning af troglitazon på sure Phe-induceret lysosomer fordeling at være uafhængig af PPAR γ men kræver Rab7 (TZD’er anmeldt i [21]). Faktisk blev det for nylig vist, at lysosomer trafik til celleoverfladen i celler, der udtrykker Rab7 shRNA (uafhængig af ydre stimulus) antyder, at Rab7 er en negativ regulator af celleoverflade-rettet lysosom handel [10]. Desuden Rab7 shRNA udtrykker celler udviste forhøjede niveauer af udskilte proteaser og var mere invasive

in vitro

[10], [13].

Heri præsenterer vi flere linjer af beviser for, at Rab7 kan spille en undertrykkende rolle i tumorvækst og progression, hvilket tyder for det første, at Rab7 er en formodet tumor suppressor

in vivo

. Troglitazon krævede Rab7 at forhindre HGF-induceret protease sekretion og tumorceller invasion

in vitro.

Desuden Rab7 shRNA udtrykkende celler dannede større tumorer

in vivo

, som udviste øget proliferation, nedsat apoptose, og øget invasiv kapacitet til omgivende væv. Endelig shRNA medieret reduktion af Rab7 førte til en stigning i c-Met

in vitro

in vivo

giver en mulig mekanisme for at tage højde for disse ændringer.

Materialer og Metoder

Etik Statement

Ingen humant væv blev anvendt i denne undersøgelse. Alle de dyr, der anvendes i denne undersøgelse fik human måde baseret på retningslinjer fastsat af American Veterinary Medical Association (AVMA) samt i overensstemmelse med vejledning for pleje og brug af forsøgsdyr (Institute for Laboratory Animal Research, Washington, DC ). Alle protokoller, der involverer levende dyr, revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for LSU Health Sciences center-Shreveport. Dette sæt eksperimenter blev udført under den godkendte protokol P-07-059. blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser, at reducere antallet af dyr, der anvendes, og for at udnytte alternativer til in vivo-teknikker, hvis de er tilgængelige.

Cell Culture

Den menneskelige prostatakræft cellelinje DU -145 blev købt fra ATCC og vedligeholdes i RPMI-1640 (Mediatech) med 10% FBS (Gemini Bio-Products) og 1% penicillin-streptomycin (Mediatech). Celler blev holdt i en 37 ° C inkubator med 5% CO

2 og blev sub-dyrket ved opnåelse . 75% konfluens

Reagenser og antistoffer

Phalloidin, 1:100 blev købt hos Molecular Probes. a-tubulin antistof, 1:1000, blev købt fra Lab Vision. LAMP-1 antistof (H4A3), 01:50, blev købt fra Developmental Studies Hybridoma Bank ved University of Iowa, USA. Følgende antistoffer blev anvendt til Western bloting: pMet, Pakt, pErk1 /2, (1:1000), spaltes-caspase-3 (1-200) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), Rab7 (1:1000 ) (Sigma, St. Louis, MO, USA), c-Met (vævsprøver 1:500) (Abcam, Cambridge, MA, USA), c-Met (1:1000) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), Ki67 (1:50) (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Fluoroformærkede-konjugeret sekundære antistoffer (1:100) blev købt hos Jackson Immunoresearch Laboratories (Westrgrove, PA, USA). IHC sekundære antistoffer (1:200) blev indkøbt fra Vector Labs (Burlingame, CA, USA). HGF (Calbiochem, San Diego, CA, USA) blev anvendt ved 33 ng /ml.

Ekstraktion af protein fra frosne tumorprøver Salg

Frosne tumorprøver blev først fortyndet i iskold RIPA puffer indeholdende Roche proteaseinhibitorcocktail (Indianapolis, IN, USA), NaF, og NaVO4 ved et 1:05 ratio, masse og volumen. Prøver blev manuelt homogeniseret under anvendelse af en morter og støder, efterfulgt af kortvarig sonikering, og anbragt på is i 20 minutter med periodisk vortex-behandling. Prøver blev derefter centrifugeret ved 12.000 g i 10 minutter for at fjerne uopløseligt debris. Proteinkoncentrationer blev bestemt ved BCA-assay og lige protein blev fortyndet i Laemmli-buffer og kogt i 10 minutter.

Cathepsin B Sekretion Assay

Assay blev udført som tidligere beskrevet [9], [10] . HGF blev sat til kulturer i 18 timer ved 33 ng /ml.

Immunofluorescens (I.F.) Farvning og mikroskopi

I.F. mikroskopi blev udført som tidligere beskrevet [9], [10]. Kort fortalt blev celler fikseret med iskold 4% PFA for 20 minutter. Celler blev derefter vasket i PBS og derefter inkuberet med anti-LAMP-1 (H4A3-s Iowa State University Hybridoma Bank) ved en 1:100 fortynding i BSP i en time ved stuetemperatur. Celler blev derefter vasket og inkuberet med Dylight 594 anti mus (Jackson IR) ved en 1:100 fortynding i BSP i en time ved stuetemperatur. Phalloidin blev derefter anvendt til at farve actincytoskelettet (phalloidin 488, Molecular Probes) og blev inkuberet i 20 minutter ved 1:200 i BSP ved stuetemperatur. Objektglas blev monteret med DAPI indeholdende SlowFade guld reagens (Invitrogen S36938). Celler blev afbildet under anvendelse af et Olympus BX-50-mikroskop under anvendelse MetaMorph software. Billeder blev fusioneret ved hjælp ImageJ.

lysosomet Distribution Analyse

lysosomet distributionen fra kernen blev målt ved hjælp af LYSOTRACKER software, en generøs gave fra Meiyappan Solaiyappan (Johns Hopkins). I alt 25 celler spænder fra tre uafhængige forsøg blev analyseret for hvert datasæt.

Western blot-analyse

Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [9].

lentiviral Levering af Short-hårnålen RNA

Korte hårnål RNA (shRNA) rettet mod Rab7 (CCGGGCCACAATAGGAGCTGACTTTCTCGAGAAAGTCAGCTCCTATTGTGGCTTTTT) blev leveret i DU145 prostatacancerceller (skabe stabil Rab7 shRNA udtrykkende celler) ved hjælp af Mission lentivirale Transduction Partikler (Sigma) i henhold til producentens protokol og som beskrevet tidligere [9]. Non Target shRNA udtrykkende celler blev dannet ved anvendelse af den samme fremgangsmåde med en kontrolvektor målretning ingen kendte mammale gener (Sigma shc202V).

Invasion Assay

Invasion assays blev udført som tidligere beskrevet [10], [13]. HGF blev tilsat i serumfri medier til både den øverste og nederste kamre i en koncentration på 33 ng /ml. Resultaterne repræsenterer det gennemsnitlige antal invaderede celler i fire synsfelter pr betingelse fra tre uafhængige forsøg.

In vivo Salg Eksperimenter

Seks til 8 uger gamle mandlige SCID /bg mus blev injiceret med 2 x 10

6 DU145 prostatatumorceller stabilt udtrykker enten krypteret (ikke-mål; NT) shRNA eller shRNA rettet mod Rab7 i 100 pi PBS subkutant (n = 6 NT shRNA; n = 7 Rab7 shRNA) . Tumorer blev målbare dag 41 efter implantation og blev målt med digitale skydelærer to gange om ugen. Tumorvolumener blev beregnet ved ligningen: Volumen = π /6 * Længde * Bredde

2. Mus blev aflivet på 104 dage efter implantation og tumorer blev kirurgisk fjernet og fikseret i 10 procent formaldehyd eller frosset. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjer fastsat af LSUHSC-S Institutional Animal Care og brug Udvalg.

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført ved brug af standard DAB teknikker. Kort fortalt blev formalinfikserede tumorer behandlet og indlejret i paraffin. Disse blokke blev derefter snittet, afparaffiniseret og rehydreret i xylen og stigende ethanolkoncentration vaske. Antigener blev afsløret med forvarmet antigen hentning buffer i 15 minutter og derefter afkølet. 0,3% H

2O

2 i methanol blev placeret på objektglassene i 30 minutter for at blokere endogene peroxider, efterfulgt af et protein (serum) blok i 10 min. Primært antistof blev derefter tilsat i 1 time ved den angivne fortynding. Biotinyleret sekundært antistof (1:200) blev derefter tilsat i 30 min. Biotin binding blev øget ved anvendelse af ABC Elite-metoden (Vector Labs) i 30 minutter og pletter blev visualiseret med DAB (Vector Labs) i 7 min. Slides blev modfarvet med hæmatoxylin i 2 min.

Statistisk analyse

GraphPad Software, Prism 3.0 blev anvendt til at udføre alle statistikker. En eller to-halet Mann-Whitney T-tests blev udført for at indikere statistisk signifikans. Alle grafer viser standardfejlen af ​​middelværdien (SEM).

Resultater

Troglitazon Forhindrer HGF-induceret Cell Surface-rettet lysosom Trafficking, Cathepsin B Sekretion, og Cell Invasion

Vi har tidligere vist, at HGF kan inducere celleoverfladen-rettet handel med lysosomer [10]. Derudover har vi vist, at Troglitazon forhindrede sure Phe-induceret celle-overflade rettet lysosom handel [13]. For at bestemme, om Troglitazon også kan forhindre HGF-induceret celleoverflade-rettet lysosom handel, DU145 prostata tumorceller blev co-behandlet med 10 pM troglitazon og 33 ng /pl HGF i 16 timer, hvorefter lysosomer blev visualiseret ved I.F. mikroskopi under anvendelse LAMP1 (lysosom-associeret membranprotein-1) som et tidligere konstaterede lysosom markør [9]. Repræsentant I.F. billeder, der vises i figur 1A viser, at HGF inducerede handel med lysosomer til celleoverfladen som tidligere offentliggjort, og at Troglitazon ikke kun forhindrede HGF-induceret celleoverfladen-rettet menneskehandel, men også inducerede den retrograd handel og sammensmeltning af lysosomer tilstødende til celle kerner. Lysosomer smeltede sammen over mikrotubulus-organiserende center (MTOC) i Troglitazon behandlede celler (data ikke vist; [13]). Kvantificering af lysosomer placering som afstanden fra cellekernen (under anvendelse af tidligere beskrevne software [9], [22] Figur 1B) viste, at HGF forårsagede omfordeling af lysosomer mod celleoverfladen (væk fra cellekernen) og troglitazon forhindrede HGF -induceret celleoverflade-rettet lysosom trafficking.

A) DU145 prostata tumorceller blev behandlet med 10 pM troglitazon og /eller HGF natten over, efterfulgt af IF mikroskopi at visualisere lysosomer (rød), actin (grøn), og kerner (blå). Troglitazon forårsager også lysosomer at klynge juxtanuclear til cellekernerne. B) Kvantificering af den rumlige fordeling af lysosomer er vist som middelafstand fra individuelle cellekerner for hver behandlingsgruppe tilstand. Fejlsøjler repræsenterer S.E.M 30 celler fra mindst tre uafhængige forsøg. C) DU145-celler blev behandlet i 16 timer med troglitazon og /eller HGF, og mængden af ​​Cathepsin B secerneret i dyrkningsmediet blev påvist under anvendelse af en cathepsin B-aktivitet assay (se metoder og materialer). D) DU145 celler podedes på Matrigelcoatede transwell inserts og fik lov til at invadere i 24 timer. Behandlinger blev tilsat hvor det er angivet til både toppen og bunden af ​​indsatsen. * Statistisk signifikans (p 0,001) i forhold til kontrol; ** Statistisk signifikans (p 0,01) i forhold til kontrol. Scale barer: 10 um

For at demonstrere en funktionel konsekvens af lysosom menneskehandel, blev aktiviteten af ​​cathepsin B udskilt i dyrkningsmedier målt.. Stigningen i cathepsin B-aktivitet er direkte proportional med mængden af ​​cathepsin B secerneret fra tumorcellerne [9]. Figur 1C viser, at Troglitazon signifikant forhindrede HGF-induceret cathepsin B sekretion. Endelig blev Matrigel coated transwell indsatse udnyttet til at udføre

in vitro

invasion analyser. Troglitazon væsentligt forhindret invasionen af ​​HGF-behandlede celler (figur 1D). Faldet i invasion var ikke på grund af celledød (data ikke vist [10])

Medlemmer af thiazolidindion (TZD) Familie af lysosomer Forbindelser differentielt Inhibit HGF-induceret Cell Surface-rettet Trafficking og Cell Invasion.

Troglitazon er medlem af thiazolidindion familie af forbindelser. Derfor testede vi evnen hos andre TZD’er at inhibere HGF-induceret celleoverflade-rettet lysosom handel og celleinvasion. Som vist i figur S1A og kvantificeret i figur S1B, Ciglitazon og Rosiglitazon også forhindret celleoverfladen rettet lysosomal trafficking; henviser til, at Pioglitazone ikke havde nogen effekt. De forskellige virkninger af de tre TZD’er på lysosomer klyngedannelse blev rangeret: Troglitazon Ciglitazon = rosiglitazon. Da Pioglitazone havde ingen effekt på lysosom menneskehandel, vi sammenlignede virkningen af ​​Troglitazon og Pioglitazon på celle invasion. Figur S1c viser, at Troglitazon signifikant inhiberede celleinvasion gennem Matrigel coatede filtre; henviser til, at Pioglitazone havde nogen effekt på celle invasion, hvilket tyder på, at den rumlige placering af lysosomer er en iboende vigtigt aspekt i tumor celle invasion.

Den Rab7 GTPase er nødvendigt for forebyggelse af HGF-induceret Cell Surface-rettet lysosomer trafficking, cathepsin B sekretion, og Cell invasion

Selvom vi for nylig har impliceret Rab7 som en negativ regulator af lysosom menneskehandel, cathepsin B sekretion, og celle invasion [10], [13], vi har ikke påvist rollen af Rab7 i forbindelse med troglitazon og HGF. Derfor DU145 celler, der udtrykker Rab7 shRNA (Rab7 knockdown blev 95% sammenlignet med en ikke-mål (NT) shRNA udtrykkende cellelinie (figur 2C indsat) [10]), blev behandlet med HGF eller troglitazon i 16 timer. HVIS. mikroskopi (figur 2A) viste, at Rab7 var nødvendig for troglitazon at forhindre HGF-induceret celleoverflade-rettet lysosom trafficking. Desuden blev lysosomer i Rab7 shRNA udtrykkende celler findes tættere på celleoverfladen, selv i fravær af HGF. Kvantificering af nucleus-lysosom afstand (figur 2B) viser, at lysosomer er betydeligt længere fra cellekerner, og at Troglitazon var ineffektiv til at fremkalde juxtanuclear lysosomer sammenlægning i Rab7 shRNA udtrykkende celler.

A) I.F. mikroskopi blev udført på DU145 prostata tumorceller, der udtrykker enten en ikke-mål (krypteret) shRNA eller en Rab7-directed shRNA at visualisere lysosomer (rød), actin (grøn) og kerner (blå). Rab7 shRNA udtryk forhindrer troglitazon-induceret juxtanuclear lysosomer clustering og forårsager lysosomer til trafik til celleoverfladen uafhængig af HGF. B) Kvantificering af den rumlige fordeling af lysosomer er vist som middelafstand fra individuelle cellekerner for hver behandlingsgruppe tilstand. Fejlsøjler repræsenterer S.E.M 30 celler fra mindst tre uafhængige forsøg. C) NT og Rab7 shRNA udtrykkende DU145-celler blev behandlet i 24 timer med troglitazon og /eller HGF, og mængden af ​​Cathepsin B secerneret i dyrkningsmediet blev påvist under anvendelse af en cathepsin B-aktivitet assay (se metoder og materialer). Cathepsin B sekretion øges og troglitazon ikke længere forhindrer sekretion i Rab7 knockdown-celler. Indsat indikerer LAMP-1 og Rab7 ekspression i non-mål (NT) eller Rab7 shRNA (KD) stabile cellelinier ved Western blot. D) NT og Rab7 shRNA udtrykkende DU145 celler podedes på Matrigelcoatede transwell inserts og fik lov til at invadere i 24 timer. Behandlinger angivet blev tilsat til både toppen og bunden af ​​indsatsen. * Statistisk signifikans (p 0,001) versus NT kontrol; ** Statistisk signifikans (p 0,01) versus NT kontrol. Scale barer: 10 um

Svarende til fordelingen af ​​lysosomer, demonstreret Rab7 shRNA udtrykkende celler forøget cathepsin B sekretion i fravær af HGF (Figur 2C).. Desuden Troglitazon var ude af stand til at forhindre HGF-induceret cathepsin B sekretion i celler, der udtrykker Rab7 shRNA. Lignende resultater blev opnået for celleinvasion. Troglitazon forhindrede HGF-inducerede stigning i tumorcelleinvasion i NT shRNA kontrolceller, men ikke i de Rab7 Knockdown celler (Figur 2D). Desuden Rab7 shRNA udtrykkende celler var signifikant mere invasive i forhold til NT shRNA celler i mangel af stimulus. Taget sammen antyder disse data, at i.) Rab7 ekspression er nødvendig for troglitazon at forhindre HGF-induceret lysosom handel og ii.) Rab7 fungerer som en negativ regulator af celleoverflade-rettet lysosom handel, cathepsin B sekretion, og tumorcelleinvasion.

Rab7 shRNA udtrykkende tumorer vokse sig større på grund af øget spredning og Nedsat Apoptotiske priser

Siden Rab7 shRNA udtrykker DU145 celler var mere invasive

in vitro

blev disse celler injiceret sub-kutant ind i den bageste flanke af SCID mus og tumorvolumen blev målt over tid for at bestemme hvilken, om nogen, virkning Rab7 nedregulering havde

in vivo

. Tumorer afledt af Rab7 shRNA udtrykkende celler blev større end dem fra NT shRNA udtrykkende celler (figur 3A). Forskellen blev signifikant (p 0,05) på dag 79 efter injektion og særdeles signifikant sidste 79 dage (p 0,001). Det er interessant at bemærke, at øget proliferation ikke blev påvist i Rab7 shRNA udtrykker celle

in vitro

(Figur S2). Efter den største tumor nåede 1,4 cm

3, alle mus blev aflivet, og tumorerne blev fjernet kirurgisk. De omgivende murine væv støder op til tumorerne blev også høstet på dette tidspunkt. Tumorer blev derefter opdelt i halve og enten fikseret i ti procent formalin eller flash-frosset.

A) SCID /Bg mus blev injiceret med 2 x 10

6 NT shRNA (n = 6) eller Rab7 shRNA (n = 7), der udtrykker DU145 celler sc Tumorer blev målbare dag 41 og blev målt via digitale skydelærer to gange om ugen. Musene blev aflivet, når den største tumor nåede 1,4 cm

2. Data er udtrykt som kubikmillimeter volumen. Fejl- søjler repræsenterer S.E.M. af 6 og 7 tumorer hhv. * Statistisk signifikans (p 0,05) versus NT shRNA tumorer; ** Statistisk signifikans (p 0,001) versus NT shRNA tumorer. B) Immunhistokemi blev udført på formaldehyd fast tumorvæv (se metoder og materialer). Celleproliferation blev vurderet ved anvendelse Ki-67 som en markør og apoptotiske celler blev visualiseret under anvendelse Spaltet Caspase-3 som markør. C) IHC blev kvantificeret ved at tælle Ki-67 eller Spaltet Caspase-3-positive celler. Tre tilfældige felter pr tumor blev manuelt talt. Antallet af positivt farvning af celler blev afbildet grafisk. * Statistisk signifikans (p 0,01) versus NT shRNA tumorer; ** Statistisk signifikans (p 0,05) versus NT shRNA tumorer. Scale barer: 100 um

Formalin faste tumorer blev derefter sektioneret og indlejret i paraffin til immunhistokemisk (IHC) analyse.. Da en forskel i tumorvækst rate blev opdaget, blev tumor snit farvet med Ki-67 (en spredning markør) og spaltes Caspase-3 (et apoptotisk markør) og modfarvet med hæmatoxylin. Repræsentativ farvning er vist i figur 3B. IHC-farvning blev kvantificeret ved manuel tælling Ki-67 eller Spaltet Caspase-3 farvede celler. Kvantificering vist i figur 3C viser en signifikant (p 0,01) stigning i Ki-67 positive farvning og signifikant (p 0,05) fald i Spaltet Caspase-3 positiv farvning, hvilket antyder, at stigningen i tumor volumen skyldes både øget proliferation og faldt apoptotiske satser.

Rab7 shRNA udtrykkende tumorer udviser Øget invasion og Tissue Remodeling

paraffinindlejret tumor sektioner blev farvet med hematoxylin og eosin og visualiseres ved to forskellige forstørrelser. Som anført ovenfor under kirurgisk fjernelse af tumorer, de tilstødende murine væv og hud blev efterladt intakt. Repræsentative tværsnit af H angivet ved pile). kan detekteres få tumorceller invaderer ind i dette vævslag i kontroldyr tumorer. I modsætning hertil Rab7 shRNA udtrykkende tumorer udviste en langt mere aggressiv fænotype. Integriteten af ​​det omgivende murine væv blev alvorligt kompromitteret og talrige tumorceller blev fundet indflettet inden den murine væv eller i de fleste tilfælde blev den tværstribede arkitektur af det omgivende væv helt kompromitteret. , Konkluderer derfor vi, at ikke kun var den Rab7 shRNA udtrykker tumorer større, havde de øget kapacitet til at omforme og invadere ind i det omgivende væv

H . E farvet s.c. tumor tværsnit med det omgivende murine væv og hud vist ved siden af ​​tumoren. Rab7 Knockdown tumorer udviser forøget infiltration i vævet lag neden under huden sammenlignet med kontrol tumorer. Derudover væv viser forøget uorden og tab af integritet omgiver Rab7 Knockdown tumorer. Målestok:. 100 um

Rab7 mRNA nedreguleres i Prostata Cancer epitelcelle Biopsier, men ikke i det omgivende stromacellers, heller ikke i BPH

Siden Rab7 nedregulering øget tumorvækst

in vivo

og øget invasive kapacitet

in vitro

,

ONCOMINE

database blev søgt at bestemme forskellen mRNA-niveauer af Rab7 i human prostatacancer. Analyse af den differentierede regulering af Rab7 i prostatakræft afslørede seks datasæt spænder ni forskellige prostata væv delmængder. Som det ses i tabel 1, viste flere undersøgelser en signifikant gange formindskelse i Rab7 mRNA-ekspression i området fra -2,501 til -1,128; dog to studier var tvetydig med én probe afsløre en stigning og en anden sonde afsløre et fald på Rab7 mRNA i prostata tumorprøver, og en undersøgelse ikke påvise nogen ændring i Rab7 mRNA-ekspression. Desuden en analyse af PIN-læsioner viste også en signifikant -1,939 fold fald i Rab7, mens to separate analyser af benign prostatahyperplasi (BPH) undlod at vise en reduktion i Rab7. Tilsammen vises en tendens til, Rab7 nedreguleres tidligt i prostata tumor udvikling (PIN læsioner) og forbliver nedreguleret under tumor progression, men er ikke nedreguleret i godartede tilstande såsom BPH.

Rab7 Knockdown forårsager en stigning i c-Met niveauer

til at begynde at bestemme de mekanismer, der regulerer en stigning i tumor spredning og invasion i celler indeholdende reduceret Rab7, vi undersøgte niveauer og aktivering af c-Met i vektor kontrol- og Rab7 shRNA udtrykkende celler. Tilsætningen af ​​HGF med kontrolceller resulterede i øget c-Met phosphorylering og aktivering af downstream signalveje efterfulgt af et gradvist fald i løbet af de næste par timer. I modsætning hertil tilsætning af HGF til Rab7 knockdown-celler resulterede i en mere robust stigning i c-Met phosphorylering og en langsommere tab af aktiverede Met og nedstrøms signalveje partnere over tid (figur 5A). I overensstemmelse med disse data, analyse af totalt c-Met proteinet i kontrol og Rab7 knockdown-celler viste, at c-met-niveauer var højere i celler med mindre Rab7 og at HGF-medieret tab af c-Met blev også svækket (figur 5B).

A) non-mål (NT) vektor kontrol eller Rab7 shRNA udtrykker DU145 celler blev udsat for HGF for de angivne tider. Helcellelysater blev opsamlet og c-met, Akt, og Erk phosphorylering blev påvist ved Western blotting. B) Celler blev behandlet med HGF for de indictated perioder og niveauer af total c-Met-protein blev bestemt ved Western blot analyse. Densitometri fra tre uafhængige forsøg blev anvendt til grafisk gengivelse af c-Met tab over tid. C) Celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af HGF i 30 minutter efterfulgt af Western blot-analyse af de angivne proteiner. D) Proteinlysater af xenotransplantattumorer blev høstet og niveauer af total c-met og Rab7 protein blev påvist ved Western blot. Søjlediagrammet viser den gennemsnitlige c-met og Rab7 ekspression af syv tumorer pr behandlingsgruppe som bestemt ved densitometri af Western-blot. * = P 0,0007 sammenlignet med NT shRNA Rab7. ** = P 0,03 i forhold til NT shRNA c-met. Fejl bar repræsenterer SEM.

Da c-Met var højere i Rab7 Knockdown celler, vi forudsagde, at disse tumorceller ville være mere lydhøre over for lavere koncentrationer af HGF. Som angivet i figur 5C, Rab7 Knockdown celler reagerede på lavere koncentrationer af HGF som målt ved aktivering af c-Met, Akt og Erk.

Endelig, for at bestemme, om c-Met-niveauer blev reduceret i Rab7 Knockdown mus xenotransplantater , protein fra frosset xenograft tumorvæv blev høstet og forberedt til Western blot-analyse. Figur 5D viser, at tumorer dannet ud fra vektor kontrol DU145 celler i gennemsnit indeholdt mere Rab7 og mindre c-Met end tumorer dannet ud fra de Rab7 knockdown-celler.