PLoS ONE: MIR-371-5p Letter kræft i bugspytkirtlen Cell Proliferation og Reducerer Patient Survival

Abstrakt

Baggrund

microRNA (miRNA) spiller en afgørende rolle i tumorigenese, enten som en tumor suppressor eller som et onkogent miRNA, afhængigt af forskellige tumortyper. Til dato har forskerne opnået en betydelig mængde af viden med hensyn til miRNA i kræft i bugspytkirtlen. Men udtryk og funktion af miR-371-5p i bugspytkirtelkræft er ikke klart belyst. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge rollerne for miR-371-5p i bugspytkirtelkræft og dens association med overlevelsen af ​​patienter med kræft i bugspytkirtlen.

Metoder

udtryk for miR-371 -5p blev undersøgt i pancreas kanalen adenocarcinom (PDAC) og deres tilstødende normale pancreas væv (ANPT) eller i bugspytkirtelkræft cellelinier ved QRT-PCR. Foreningen af ​​miR-371-5p udtryk med den samlede overlevelse blev bestemt. Proliferation og apoptose af SW-1990 og Panc-1-celler, transficeret med MIR-371-5p efterligner eller inhibitor, blev vurderet ved anvendelse MTT-assay og flowcytometri hhv. Tumorigeniciteten blev evalueret via mus xenograft eksperimenter. miR-371-5p promoter interaktioner blev analyseret af kromatin immunopræcipitationsanalyser (chip). Proteinekspression blev analyseret ved Western blot.

Resultater

Ekspressionsniveauet af MIR-371-5p blev dramatisk opreguleret i kliniske PDAC væv sammenlignet med ANPT. Patienter med højt miR-371-5p udtryk havde en væsentligt kortere overlevelse end dem med lav miR-371-5p udtryk. In vitro og in vivo assays viste, at overekspression af MIR-371-5p resulterede i celleproliferation og forøget tumorvækst, der var forbundet med inhibitor af vækst 1 (ING1) nedregulering. Interessant, vi fandt også, at ING1 til gengæld inhiberede ekspression af MIR-371-5p i promotorregionen.

Konklusioner

vores undersøgelse viser en hidtil ukendt ING1-MIR-371-5p regulerende feedback-loop, som kan have en afgørende rolle i PDAC. miR-371-5p kan således vise sig at være en ny prognostisk faktor og terapeutisk mål for kræft i bugspytkirtlen behandling

Henvisning:. Han D, Miao H, Xu Y, Xiong L, Wang Y, Xiang H, et al . (2014) MIR-371-5p Letter kræft i bugspytkirtlen Cell Proliferation og Reducerer Patient Survival. PLoS ONE 9 (11): e112930. doi: 10,1371 /journal.pone.0112930

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: 10. juli 2014 Accepteret: Oktober 16, 2014; Udgivet: 20. november 2014

Copyright: © 2014 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Innovation for Videnskab og TechnologyCommission Shenzhen Kommune (nr JCYJ20140414103937769). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataopsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

PDAC er en stærkt malign fænotype karakteriseret ved hurtig progression, tidlig metastaser, og en begrænset reaktion på strålebehandling og kemoterapi. Trods mere end 10 års FDA-godkendte terapeutiske regimer og store forbedringer i medicinsk behandling, er blevet observeret nogen signifikant effekt på PDAC patient overlevelse [1]. Nu er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA med en 5% 5-års overlevelse årligt [2]. Derfor er der et presserende behov for at identificere biomarkører, der vil fremme tidlig diagnosticering og tillader personlige strategier til patienter med høj risiko for PDAC behandling.

Udvikling og progression af PDAC er en kompleks proces, der involverer dereguleringen af ​​multiple vigtige gener til celle biologiske processer. Transkriptionsfaktorer (TFS) og miRNA er fremtrædende regulatorer til genekspression [3]. I de seneste 10 år, miRNA er særligt vigtige i næsten alle tumor udvikling undersøgelser, fordi de kan være mål for genomiske læsioner, der kontrolleres af klassiske tumor signaler, og de selv til stede som en klasse af onkogener eller tumor undertrykkere [4]. For nylig har miRNA blevet foreslået at være tæt forbundet med PDAC tumorigenese [5].

miRNA er små (21-24 nt) ikke-kodende RNA-molekyler, der regulerer genekspression ved at binde løst komplementære sekvenser i 3′ -untranslated region af target mRNA til at undertrykke translation eller inducere mRNA spaltning [6]. Opdagelsen af ​​miRNA har kastet nye indsigter vedrørende regulering af celledeling, differentiering, apoptose og ældning, og har også bidraget til patientbehandling, herunder diagnose og behandling [7].

Selvom tidligere undersøgelser har afklaret rollerne af mange miRNAer i bugspytkirtelkræft [8], har ingen undersøgelser rettet rolle miR-371-5p. Nylige undersøgelser viste, at MIR-371-5p blev signifikant forhøjet i gastrisk cancer (GC) patienter og reguleret hepatocellulært carcinom (HCC) celleproliferation ved at fremskynde G1 /S overgang [9], [10]. Især, yderligere validering indikerede, at serum MIR-371-5p, som en ny biomarkør, havde stort potentiale i at diskriminere GC patienter fra raske kontroller [9]. Vi hypotese derfor, at miR-371-5p også kan være en ny mekanisme bidrage til øget PDAC risiko ved at forstyrre cellecyklusprogression via målrettet cellecyklus-relaterede gener. For at løse dette problem, vi sammenlignede miR-371-5p udtryk profiler mellem PDAC væv og ANPT. Vi viser her, at MIR-371-5p ekspression blev signifikant opreguleret i PDAC væv sammenlignet med ANPT, hvilket resulterede i celleproliferation og forøget tumorvækst. Således kan miR-371-5p vise sig at være en ny prognostisk faktor og terapeutisk mål for kræft i bugspytkirtlen behandling.

Materialer og metoder

Cell kultur

PDAC cellelinjer SW-1990 og Panc-1 blev opnået fra det kinesiske center for Type Culture Collection (Shanghai, Kina). Celler blev opretholdt i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycinsulfat). Cellerne blev dyrket i en fugtig inkubator ved 37 ° C suppleret med 5% CO2.

celleproliferationsassay

MTT [3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2 , 5-diphenyltetrazoliumbr-omide] – baseret assay blev udført for at vurdere virkningen af ​​mIR-371-5p på PDAC celleproliferation. Celler blev podet i plader med 96 brønde (5000 celler /brønd i 200 pi medium) og inkuberet i 24 timer ved 37 ° C, 5% CO

2. PDAC celler blev transficeret med MIR-NC, MIR-371-5p, MIR-kontrol, anti-MIR-371-5p, NC-siRNA eller ING1-siRNA under anvendelse af lipofectamin 2000-reagens (Life Technologies) i 1, 2, 3 og 4 dage, henholdsvis i overensstemmelse med producentens anvisninger. Celler dyrket med komplet medium blev anvendt som blank kontrol. Ved afslutningen af ​​kulturen, 20 pi 5 mg /ml MTT (Sigma, USA) -opløsning blev tilsat per brønd, og cellerne blev inkuberet i yderligere 4 timer ved 37 ° C. Supernatanter blev fjernet, og formazankrystaller blev opløst i 150 pi dimethylsulfoxid (Sigma, USA). Endelig blev den optiske densitet bestemmes ved 490 nm under anvendelse af multi-mikroplade testsystem (POLARstar OPTIMA, Tyskland). I hvert assay blev fem parallelle brønde foretaget, og resultaterne blev opsamlet som middelværdien af ​​mere end tre uafhængige forsøg. Lysater blev høstet for western blot analyse.

Cell cyklus analyse

For at analysere cellecyklus, DNA-indhold pr duplo blev analyseret ved hjælp FACSort Cellquect software (BD Biosciences, USA). PDAC Celler blev anbragt i 6-brønds plader natten over og transficeret med MIR-NC, MIR-371-5p, MIR-con, anti-MIR-371-5p, NC-siRNA, eller ING1-siRNA i 48 timer henholdsvis.

ved slutningen af ​​dyrkning blev cellerne fikseret i 75% iskold ethanol natten over ved 4 ° C. De fikserede celler blev farvet med 50 pg /ml propidiumiodid (PI) indeholdende 50 ug /ml RNase A (DNase free) i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke og analyseret ved fluorescens-aktiveret cellesortering (Becton Dickinson, USA). Cellerne blev anslået ved 488 nm, og emissionen blev opsamlet gennem et 630 nm filter. I alt blev 20.000 celler opsamlet fra hver prøve. Fordelingen cellecyklus blev evalueret ved at beregne andelen af ​​celler i G0 /G1, S, og G2 /M faser. I hvert uafhængigt forsøg blev tre parallelle brønde fremstillet, og procedurerne blev udført i tre eksemplarer. Data opnået blev præsenteret som gennemsnit ± SD.

Luciferase reporter assays

Kort fortalt fragmenterne af den 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af ING1 mRNA indeholdende den formodede (WT) var amplificeret ved PCR fra genomisk DNA, og PCR-produktet blev subklonet ind i en pGL3-kontrolvektor (Promega, USA) umiddelbart nedstrøms for luciferasegenet. For at konstruere mutant pGL3-ING1 (MU) blev QuickChange site-directed mutagenese (Stratagene) anvendes til at inducere seks punktmutationer i UTR-regionen i WT-pGL3-ING1. Plasmid DNA blev sekventeret for ægthed.

Til luciferase reporter assay, celler blev cotransficeret med 300 ng pGL3-ING1-WT eller pGL3-ING1-Mut-konstruktioner og pcDNA3-miR-371-5p eller negativ kontrol ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Hver prøve blev cotransficeret med 50 ng pRL-TK plasmid, der udtrykker Renilla luciferase (Promega, USA). Celler blev opsamlet 48 timer efter transfektion og analyseret ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA). Relative luciferase målinger blev foretaget 48 timer efter transfektion ved brug af dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) under anvendelse af en luminescens-tæller. Transfektioner blev udført in duplo og gentaget mindst 3 gange i uafhængige forsøg. MIR-371-5p inhibitor, siING1 og deres negative kontroller (NC) blev indkøbt fra Panagene Inc (koreansk) og Santa Cruz (USA) hhv. Sekvenser var som følger: MIR-371-5p inhibitor: 5′-TTTTAACATTGCACT-3 ‘. Ad-ING1 adenovirus (Kat #: 1601), og dens kontrol Ad-GFP adenovirus (Kat #: 1700) blev købt fra Vector Biolabs (USA)

Kvantitativ RT-PCR

Total RNA. blev isoleret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, USA). 2 ug totale RNA’er blev revers transkriberet under anvendelse af MIR-371-5p specifikke reverse transskriptionsprimere (Ribobio, Kina) ved anvendelse af poly-A polymerase baseret First-Strand Synthesis kit (Takara Bio, Japan) ved at følge fabrikantens protokol, og den relative ekspression af mIR-371-5p blev bestemt under anvendelse SYBR Premix Ex Taq (Takara, Kina). U6 snRNA blev anvendt til normalisering. Det delta-Ct metode blev anvendt til at evaluere analyserne af real-time PCR data. I semi-kvantitativ RT-PCR, de endelige PCR-produkterne efter bestemt antal cyklusser blev elektroforeret i 2% agarosegeler efterfulgt af farvning med ethidiumbromid, og fotograferet under UV-gennemlysning. Primere til MIR-371-5p: RT-primer, 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTGCC-3 ‘; Fremad, 5’-GTCGTATCCAGTGCAGCCG-CCACTCAAACTGTGGGG-3 ‘. Primere til U6 snRNA: RT-primer, 5’-GGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAAAT-ATGG-3 ‘; Fremad, 5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3 ‘.

chromatin immunopræcipitationsassay (chip)

ING1 binding til promotoren af ​​miR-371-5p blev testet ved hjælp af chip-analyse. Chip assay blev udført under anvendelse af EZ-chip kit fra Millipore (Millipore, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt, ca. 3 × 10

6 Panc-1, inficeret med enten Ad-GFP-ING1 eller Ad-GFP adenovira blev tværbundet under anvendelse af 1% formaldehyd (BIO-RAD, USA) i 15 minutter ved 37 ° C. Celler blev høstet efter standsning med 0,125 M glycin og lyseret chip lysispuffer (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM Tris (pH 8,0), 0,1% deoxycholat, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 ug /ml pepstatin, 1 ug /ml aprotinin og 1 ug /ml leupeptin). Ekstrakter blev sonikeret seks gange i 9 s hver og lysater blev spinne ved centrifugering ved 14000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C. Af denne prøve blev 150 pi brugt som input. Supernatanterne blev immunoprecipiated med enten anti-ING1 eller med muse IgG (negativ kontrol) ved 4 ° C i 4 timer, efterfulgt af protein G Sepharose (Sigma, USA) i 2 timer ved 4 ° C. Immunopræcipitaterne blev sekventielt vasket med 1 ml ChIP lysepuffer to gange, chip lyseringsbuffer med 500 mM NaCl to gange og med LiCI /detergent-opløsning (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 250 mM LiCI, 0,5% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 1 mM EDTA) to gange og endelig med TE-buffer (10 mM Tris og 1 mM EDTA, pH 8,0). Perlerne blev elueret under anvendelse af 1% SDS og 0,1 M natriumbicarbonatopløsning. Inputtet og eluenten prøverne var revers-tværbundet ved anvendelse NaCl i 5 timer ved 65 ° C. DNA fra prøverne blev isoleret ved phenol-chloroform efterfulgt af ethanolpræcipitation. Promotor binding blev testet ved PCR under anvendelse af primere spænder opstrøms regioner af MIR-371-5p starte sites, primersekvenser: Chip-ING1, F: 5′-AATGTTCACTGCCGCACTGT-3 ‘; R: 5’-ACACCTATAATCCCTGC- TAC-3 ‘; Chip-neg-F: 5’- ACGGCCAACATGCTCAGG-3 ‘; R: 5’- TGTTTGCAACTGCTGCGTTAG-3 ‘

Western blot-

Cellerne blev lyseret med 1% RIPA Lysis Buffer (50 mM Tris-HCI, pH 8.0,150 mM natriumchlorid, 1. % NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% natriumdodecylsulfat, 2 mM EDTA) indeholdende 1 × proteaseinhibitorcocktail (Roche) 48 timer efter transfektion. Supernatanterne blev opsamlet, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af BCA Assay Kit (Pierce). De proteinprøver blev adskilt på 10% SDS-PAGE og derefter overført til en PVDF-membran. Membranen blev blokeret med 5% fedtfri mælk, efterfulgt af en inkubation natten over ved 4 ° C med en angivet primær kanin-antistof. Membranen blev vasket tre gange i TBST og dernæst inkuberet med et sekundært antistof. Sidst, blev det bundne antistof påvist ved kemiluminescens med ECL Detection Reagent (Pierce). Dataene blev normaliseret til GAPDH eller β-actin.

In vivo

bugspytkirtelkræft xenograftmodel

Panc-1 celler fra moderat differentieret PDAC blev stabilt transficeret med miR-371 -5p eller mIR-NC kontrol plasmid. De transficerede celler blev opsamlet, suspenderet i 200 pi PBS (1 x 10

7-celler), og blev injiceret subkutant hos 4 uger gamle BALB /c nøgne mus (

n

= 10 /gruppe) . Musene blev holdt i et specifikt patogenfrit miljø i 5 uger og derefter aflivet. Tumoren volumen

V

blev beregnet ved hjælp af sin længde

L

og bredde

W

, efter ligningen

V

= 0,4

LW

2. Brugen af ​​nøgne mus overholdt Guide for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, og undersøgelsen blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Southern Medical University.

Patienter og tumorvæv

blev opnået i alt 60 humane pancreas cancer væv (PC) og matchede normale tilstødende pancreas væv (NP) under operationen på Baoan Hospital (Shenzhen, Kina) mellem januar 2008 og december 2010. diagnosen var baseret på patologiske tegn. Desuden blev yderligere 15 par PDAC og kontrolprøver indsamlet fra patienter under kirurgiske resektioner og opbevares i flydende kvælstof. Alle 75 patienter skal skriftligt informeret samtykke til brug af deres væv og forsøgsprotokollen blev godkendt af den etiske komité i det sydlige Medical University.

Statistisk analyse

De sammenslutninger af miR-371- 5p-ekspression med de kliniske patologiske karakteristika blev analyseret under anvendelse af Chi-square eller Mann-Whitney test. Overlevelseskurven blev konstrueret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet under anvendelse af log-rank test. Grupper blev sammenlignet ved hjælp af en Students

t

-test. Korrelation analyse blev udført under anvendelse af Spearmans korrelationsanalyse. Alle sandsynlighed værdier blev analyseret ved hjælp af en to-halet test, og statistisk signifikans blev indgået ved

* P 0,05,

** P 0,01,

*** P 0,001; # Repræsenterer ingen statistisk signifikans. Analyserne blev udført ved hjælp af SPSS (version 17.0) software (SPSS Inc., USA). Data blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (SD).

Resultater

opregulering af miR-371-5p i bugspytkirtelkræft væv er forbundet med overlevelse

For at bestemme ekspressionsniveauer af miR-371-5p i bugspytkirtlen kræftpatienter blev miR-371-5p påvist i alle de 15 par af kræft i bugspytkirtlen væv og deres matchede noncancerous pancreas væv ved hjælp af en QRT-PCR-metode. Som vist i figur 1A viste PC væv signifikant højere ekspression af MIR-371-5p sammenlignet med den for NP-væv (

P

0,05). Desuden afslørede Kapan-Meier overlevelsesanalyse at patienter med miR-371-5p positivt udtryk (figur 1B) havde en signifikant dårligere prognose end dem med en negativ udtryk (Fig.1C). Den multivariate Cox regressionsanalyse viste, at miR-371-5p udtryk (hazard ratio [HR] = 2,748, 95% konfidensinterval [CI] = 1,211-5,914, P = 0,03), var uafhængige prognostiske faktorer for samlet overlevelse.

(A) Gennemsnitlig udtryk niveau af miR-371-5p i humane PDAC prøver (

n

= 15) og normale pancreas væv (

n

= 15). miRNA overflod blev vurderet ved QRT-PCR og normaliseret til U6 RNA. Værdier er præsenteret som middelværdi ± S.D. (B og C) MIR-371-5p ekspressionsniveauer og samlet overlevelse efter resektion af pancreascancer med MIR-371-5p -negativ versus MIR-371-5p -positive grupper. MIR-371-5p – positive gruppe havde signifikant kortere overlevelse end miR-371-5p -. Negativ gruppe (n = 30 /gruppe,

P

= 0,021)

mIR-371-5p fremmet celledeling både

in vitro

in vivo

for at undersøge effekten af ​​miR-371-5p på bugspytkirtlen vækst kræftceller, den PDAC cellelinjer med forskellige kvaliteter SW-1990 og Panc-1 blev forbigående transficeret med en miR-317-5p efterligner eller hæmmer (anti-miR-371-5p) og deres respektive nationale koordinatorer. Det QRT-PCR-analyse viste, at miR-371-5p efterligner forårsagede en 14,42 og 6,47 gange stigning i miR-371-5p udtryk i PANC-1 og SW-1990 celler, henholdsvis (2A). I mellemtiden er den anti-miR-371-5p faldt miR-371-5p udtryk ved 3,14 og 3,28 folder i PANC-1 og SW-1990 celler henholdsvis sammenlignet med de kontrol-cellelinjer (Fig.2B). MTT proliferationsassay blev udført i SW-1990 og Panc-1-celler, der blev transient transficeret med en MIR-371-5p efterligner eller inhibitor. Resultaterne viste, at MIR-371-5p -mimics fremmet tumorcellevækst, hvorimod anti-MIR-371-5p inhiberede tumorcellevækst (P 0,01, 2C og D) For at undersøge den mekanisme, ved hvilken anti-miR- 371-5 inhiberer celleproliferation, analyserede vi cellecyklus fordelingen af ​​Panc-1 og SW-1990 celler, der var transficeret med anti mIR-371-5p og kontrollen. En større andel af celler transficeret med anti- akkumuleret i G1-fasen MIR-371-5p, hvorimod S-fasen befolkningen faldet (Fig.2E). Imidlertid blev en modsat resultat observeret i celler transficeret med MIR-371-5p (data ikke vist). Disse resultater tydede på, at den proliferative inhibering af anti MIR-371-5p skyldtes delvis et G1-fasen af ​​de to pancreatiske cancercellelinjer.

(A og B) Ekspressionsniveauet af MIR-371 -5p blev testet i 48 timer i bugspytkirtelkræftceller transficeret med miR-371-5p efterligner, anti-miR-371-5p og deres respektive kontrol (NC, 40 nM) ved QRT-PCR. (C og D) Spredningen af ​​PDAC cellelinier transient transficeret med MIR-371-5p efterligner, MIR-371-5p inhibitor eller kontrol blev analyseret ved MTT proliferationsassay. (E) Anti-miR-371-5p øger andelen af ​​celler i G1 som skønnet ved hjælp af flowcytometri (venstre panel, **

P

0,01, n = 4). Og repræsentativ cellecyklus Histogrammer (anti-miR-NC vs anti-miR-371-5p) præsenteres (højre panel). (F) Nøgne mus blev subkutant inokuleret med Panc-1-celler transficeret med MIR-371-5p plasmid eller MIR-NC kontrol plasmid, i deres flanker. Billedet repræsenterer tumorer dannet i 10 mus. (G) Vækstkurver for tumorvolumener. Grafen repræsenterer tumorvækst, 5 uger efter podning. Tumorvolumen blev beregnet, og alle data er vist som middelværdi ± S.D. (

n

= 10).

For yderligere at bestemme, om miR-371-5p var involveret i tumorudvikling, en stabil miR-371-5p -overexpression cellelinje og kontrol cellelinje blev subkutant injiceret i de nøgne mus, og til gengæld blev tumorvæksten aktivitet målt. Når tumorerne blev høstet, den gennemsnitlige mængde af tumorerne afledt af MIR-371-5p gruppe var større i forhold til kontrolgruppen (Fig.2F og G,

P

0,05). Disse resultater var i overensstemmelse med virkningerne af miR-371-5p overekspression in vitro og kraftigt antydet, at miR-371-5p kunne fremme udbredelsen af ​​PDAC celler.

ING1 er et direkte mål for miR-371-5p og involveret i miR-371-5p fremkaldende fremme af PDAC celler spredning

for at udforske det potentielle mål, hvorigennem miR-371-5p fremmer udbredelsen af ​​bugspytkirtelkræftceller, tog vi fordel af bioinformatik til at forudsige den formodede miR-371-5p mål. Både Target Scan og Miranda systemer forudsagde ING1, en central tumor suppressor, for at være et formodet mål for miR-371-5p. For at kontrollere, om miR-371-5p direkte målrettet miR-371-5p mRNA i PDAC tumorer og cellelinjer, in vitro og in silico analyse blev udført. Først blev anti miR-371-5p eller kontrol transficeret i SW-1990 og Panc-1 celler, og vi fandt, at hæmmet udtryk for miR-371-5p øget ING1 protein niveauer i begge linjer (fig. 3A). Derefter MIR-371-5p efterligner eller kontrol blev transficeret ind i de ovennævnte 2 cellelinier. Vi fandt, at tvungen ekspression af MIR-371-5p faldt ING1 proteinniveauer i begge cellelinier konsekvent (fig. 3A). Disse resultater viste, at miR-371-5p kunne fremme udbredelsen af ​​PDAC celler med faldende af ING1 udtryk in vitro.

(A) ING1 udtryk i SW-1990 og Panc-1-celler efter transfektion med anti miR -371-5p eller miR-371-5p efterligner eller kontrol opdaget af western blotting. (B-I) ING1 blev opdaget af qRTPCR i 50 pancreas cancer (PC) væv og blev modsvaret de tilstødende noncancerous pancreas væv (NP). Den ING1 overflod blev normaliseret mod GAPDH. (B-II) Forholdet mellem ING1 og MIR-371-5p ekspression blev udforsket af Spearmans korrelation i 50 PDAC væv. ING1 udtryk var negativt korreleret med miR-371-5p i 50 PDAC tumorvæv. (C) Forudsagt følgeskader parring af mål 3′-UTR-regionen i ING1 (vildtype eller muteret) og miR-371-5p modne sekvens. Luciferaseaktivitet på tilstedeværelse af både vildtype ING1 3′-UTR eller mutant og MIR-371-5p blev sammenlignet med kontrolgruppen. (D) Western blot blev udført for at analysere ING1 ekspression i si ING1 transficerede Panc-1-celler. β-actin blev anvendt som en intern kvantitativ kontrol. (E) Effekt af siING1 på celleproliferation blev målt ved MTS assay. (F) Panc-1 celler blev transficeret med NC, miR-371-5p hæmmer eller miR-371-5p hæmmer og siING1, og derefter MTS analysen blev udført.

For yderligere at bekræfte de lovgivningsmæssige forhold mellem miR-371-5p og ING1, undersøgte vi ekspressionen af ​​ING1 i PDAC prøver (PC) og deres tilsvarende normale væv (NP). Brug af QRT-PCR, fandt vi, at det gennemsnitlige niveau for ING1 ekspression var signifikant lavere i PC væv sammenlignet med den for NP-væv (fig. 3B-I). En signifikant omvendt korrelation observeredes mellem ING1 og miR-371-5p udtryk i bugspytkirtelkræft væv (Spearman korrelation, r = -0,4802) og tilstødende noncancerous væv (r = -0,4103, data ikke vist) (fig. 3B-II).

for at evaluere evnen hos mIR-371-5p binding til 3’UTR af ING1, udførte vi en luciferase reporter assay og observeret et signifikant fald i luciferaseaktivitet i nærvær af mIR-371-5p – ING1 i SW-1990 celle sammenlignet med kontrollerne (fig. 3C). For at validere, om ING1 var et direkte mål for miR-371-5p, vi muterede den miR-371-5p bindingssteder i 3’UTR af ING1 og observerede tab af undertrykkelse (fig. 3C). Tilsammen foreslog data, som ING1 var et direkte mål for miR-371-5p.

For at belyse, om vækstfremmende effekt af miR-371-5p blev medieret af repression af ING1 i PDAC celler, den virkning ING1 på cellevækst blev undersøgt. Først blev Panc-1 celler transficeret med siRNA mod ING1 eller dens kontrol, og så vi undersøgte cellevækst ved MTT assay (fig. 3D). MTT-assay Resultaterne viste, at gendæmpning af ING1 fremmet celleproliferation af Panc-1-celler (Fig.3E). Desuden blev den inhiberende virkning af MIR-371-5p inhibitor på cellevækst vendes, når ING1 ekspression blev knockdown (Fig.3F). Tilsammen disse resultater viste, at ING1 er et funktionelt vigtigt mål for miR-371-5p som er involveret i udbredelsen af ​​PDAC celler.

ING1b regulerer miR-371-5p udtryk

ING familie af type II tumorsuppressorer tjene som både epigenetiske ‘læsere’ og målrette histon acetyl transferase (HAT) og histon deacetylase (HDAC) »forfattere« af epigenetiske histon koden [11]. Den ING1 protein har også været impliceret i reguleringen miRNA niveauer [12]. At identificere, om ING1 regulerer miR-371-5p udtryk blev Panc-1 celler inficeret med adenovirus udtrykker GFP alene eller med adenovirus, der udtrykker både GFP og ING1. MIR-371-5p blev bekræftet at falde betydeligt, og reproducerbart som reaktion på ING1 overekspression (Fig.4A). Desuden som vist i Fig.4B, suberoylanilid hydroxamsyre (SAHA), en histon deacetylase (HDAC) -hæmmer, øget MIR-371-5p ekspression betydeligt i Panc-1-celler, hvilket er i overensstemmelse med epigenetisk regulering af ING1 som en del af HDAC1 og HDAC2 komplekser. Desværre fik SAHA ikke ændre ING1 ekspression. Chip-analyse af ING1 viste, at ING1 bundet til promotor-området af miR-371-5p (Fig.4C), hvilket indikerer, at ING1 direkte regulerer miR-371-5p udtryk. Således ING1 epigenetisk regulerer MIR-371-5p ekspression i PDAC.

(A) Ekspressionen af ​​MIR-371-5p i Panc-1-celler som respons på ING1 overekspression i 48 hs, blev bestemt ved kvantitativ real . -Tiden PCR-assays (øvre panel Bjælkerne repræsenterer middelværdien ± SD (**

P

. . 0,01, n = 5) (nederste del) Western blot blev udført for at analysere ING1 ekspression (B) miR -371-5p niveau blev bestemt under anvendelse real-time RT-PCR i Panc-1-celler som respons på behandling med HDAC inhibitor suberoylanilid hydroxamsyre (SAHA). Bjælkerne repræsenterer middelværdien ± SD (øvre panel, *

P

0,05, n = 5) (nederste del) Western blot blev udført for at analysere ING1 ekspression (C) Celler inficeret med kontrol GFP adenovirus eller med den samme virus, der også koder ING1 blev høstet 24 timer senere og forberedt til chip.. analyse ved hjælp kontrol- eller ING1 antistoffer. PCR af immunpræcipitation produkter viste, at ING1 bundet til regionen opstrøms for miR-371-5p.

diskussion

En fuldstændig forståelse for de molekylære mekanismer der ligger til grund pancreas tumor initiering og progression er vigtig for nye prognostiske og terapeutiske metoder, der skal forbedre resultatet af patienter med kræft. I de seneste år, er miRNA fremstår som en ny klasse af gen regulatorer er involveret i forskellige tumorer [13]. Her giver vi den første bevis på, at miR-371-5p spiller en kritisk rolle i bugspytkirtlen tumorigenese. Det er ofte opreguleres i PDAC. Konsekvent, er MIR-371-5p overekspression markant forbundet med uheldige patienternes overlevelse, hvilket antyder, at det er en dårlig prognostisk faktor. Den positive forhold miR-371-5p niveauer med spredning understøtter forestillingen om, at det virker som en kræftpsykologisk miRNA.

De kendetegn observeret hos patienter med PDAC er sammenfattet i mus xenograftmodeller. MIR-371-5p-overudtrykkende celler udvikler store tumorer, som er reverteret ved injektioner af en specifik inhibitor imod den. En modsat opførsel observeres med MIR-371-5p lav-udtrykkende celler og injektion af det tilsvarende mimic RNA. Til dato har miR-371-5p vist sig at være involveret kun i hepatocellulære karcinomer, hvilket indikerer, at dens overekspression er forbundet med mere aggressive tumorer og en dårligere resultat [14], i overensstemmelse med data opnået i PDAC. Men bidrag miR-371-5p til denne proces skal yderligere undersøgelser.

Vores forståelse af de biologiske funktioner af miRNA afhængig identifikation af relevante target gener. Men den forudsigelse af miRNA mål er stadig en udfordrende forskningsområde. Størstedelen af ​​miRNA-target sekvensen matching er baseret på ufuldkommen komplementaritet af miRNA med 3′-UTR’er af target mRNA. Kravet om komplementaritet kun syv eller otte nukleotider kan resultere i hundredvis af mulige mål [15]. Hidtil meget få målgener af miR-371-5p er blevet bekræftet i forskellige biologiske systemer.

Heri vi validere ING1 som en direkte funktionel mål for miR-371-5p i PDAC, tilføjer oplysninger til tidligere rapporterede celletyper [16]. ING familien af ​​type II tumorsuppressorer bidrager til væksten af ​​forskellige tumorer [17]. Denne familie er godt bevaret og indeholder fem gener. Blandt dem,

ING1

er det bedst karakteriserede medlem og koder fire proteinisoformer [18]. Den ING familie af tumorsuppressorer fungerer som læsere og forfattere af histon epigenetiske kode, der påvirker DNA-reparation, kromatin remodeling, cellulære degeneration, cellecyklus regulering og apoptose [18]. Overekspression af ING1 forårsagede cellecyklusstop på G1 fasen med efterfølgende apoptose, hvorimod undertrykkelse af dets udtryk øget koloni fokus dannelse og vækst

in vitro

tumordannelse

in vivo

[19]. Imidlertid forbliver de detaljerede molekylære mekanismer, som ING1 fungerer som en tumor suppressor ufuldstændigt defineret.

ING1 regulerer genekspression via regulering histonacetylering og methylering [20]. ING1 er hovedmålet for HDAC-hæmmer SAHA, og synes at primært regulere kromatin komprimering og efterfølgende ekspression af delmængder af gener gennem epigenetiske mekanismer. Derudover er der rapporteret mange miRNA at være reguleret af epigenetiske mekanismer [21]. Vi spurgte derfor, om miR-371-5p reguleres af ING1. I den aktuelle undersøgelse, viser vi, at ekspressionen af ​​miR-371-5p epigenetisk reguleres af ING1 og at miR-371-5p vender en betydelig del af de hæmmende virkninger af ING1 på celleproliferation. Desuden ændringer i ING1 udtryk påvirker celledeling og apoptose, reproduktion i en omvendt tilstand de virkninger som følge af miR-371-5p, som yderligere demonstreret i tumorprøver. De gensidige og inverse variationer af ING1 niveauer efter miR-371-5p modulation viser tydeligt, at de mekanistisk er forbundet. Den stramme samspil mellem ING1 og miR-371-5p yderligere bevist af deres samtidige lyddæmpning: ING1 knockdown helt vender virkningerne på celleproliferation og apoptose grund miR-371-5p hæmning, identificerer det som en stor nedstrøms effektor af denne miRNA.