PLoS ONE: Hvad kan vi lære af kugleformede Kultur Systems? Insights fra Tumorspheres afledt af primære Colon Cancer Tissue

Abstrakt

På grund af deres selv-fornyelse og tumorgene egenskaber, har tumor-initierende celler (tics) været en hypotese at være vigtige mål for kolorektal cancer (CRC). Men undersøgelsen af ​​TIC hæmmes af, at identifikation og dyrkning af TIC er stadig genstand for omfattende debat. Flydende tredimensionale sfæroide kulturer (SC), der vokser i serumfrit medium suppleret med vækstfaktorer formodes at være beriget i TIC. Vi genererede SC fra friske klinisk tumor prøver og sammenlignede dem med SC isoleret fra CRC celle-linjer samt at klæbende differentierede modstykker. Patient-afledte SC display selvfornyelse kapacitet og kan fremkalde serielle transplanterbare tumorer i svækket immunforsvar mus, som fænotypisk ligner tumoren oprindelseslandet. Desuden den oprindelige tumor væv og etableret SC bevarer flere lignende CRC-relevante mutationer. Primær SC udtrykke centrale stemness proteiner såsom SOX2, OCT4, NANOG og LGR5 og vigtigere viser øget kemoresistens evne i forhold til deres vedhængende differentieret modparter og cellelinje-afledt SC. Slående, celler afledt af sfæroid eller omliggende differentierende dyrkningsbetingelser viste lignende selvfornyelse kapacitet og lige dannede tumorer i immun-deficiente mus, hvilket antyder, at selvfornyelse og tumor-initiering kapacitet TIC er ikke begrænset til fænotypisk umodne sfæroide celler, som vi beskrive at være meget plast og i stand til at generhverve stilk-celle træk, selv efter lange differentieringsprocesser. Endelig har vi identificeret to gener blandt en kugle genekspression signatur, der forudsiger sygdom tilbagefald i CRC patienter. Her foreslår vi, at SC stammer fra friske patient tumor væv til stede interessante fænotypiske funktioner, der kan have klinisk relevans for kemoresistens og sygdom tilbagefald og derfor udgør et værdifuldt redskab til at teste for nye CRC-behandlinger, overvinde resistens.

Henvisning : Qureshi-Baig K, Ullmann P, Rodriguez F, Frasquilho S, Nazarov PV, Haan S, et al. (2016) Hvad kan vi lære af kugleformede Kultur Systems? Insights fra Tumorspheres afledt af primære Colon Cancer Tissue. PLoS ONE 11 (1): e0146052. doi: 10,1371 /journal.pone.0146052

Redaktør: Alessandro Datti, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, CANADA

Modtaget: August 11, 2015; Accepteret: 11. december 2015; Udgivet: 8. januar 2016

Copyright: © 2016 Qureshi-Baig et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Alle genekspression filer findes i databasen ArrayExpress under tiltrædelsen nummer E-mtab-3575

Finansiering:. Forfatterne vil gerne takke Fondation Cancer (give F1R-LSC-PAU-13HY2C) til finansiering af denne undersøgelse og Fonds National de la Recherche (FNR) for at støtte KB og PU under tilskudsordning for AFR. Vi takker også den integrerede Biobank Luxembourg (Israel Beer Breweries) til at støtte denne undersøgelse. Forfatterne er også taknemmelig for, at Fondation du Pélican de Mie et Pierre Hippert-Faber under ledelse af Fondation de Luxembourg for at støtte KB og PU. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser : 5-FU, 5-fluorouracil; CRC, colorectal cancer; TIC, tumorfremkaldende celle; CSC, cancer stamceller; SC, sfæroide kulturer; SFC, sfære dannende celle; TIC, tumor-initierende celle

Introduktion

Kolorektal carcinom (CRC) er den tredje hyppigst diagnosticerede kræftform for både mænd og kvinder og den næsthyppigste årsag til kræft dødelighed i de vestlige lande [ ,,,0],1]. Trods store fremskridt i de seneste årtier, en masse polemik stadig over baggrunde af kræft debut, metastaser og CRC progression. De to dominerende begreber carcinogenese postulat stokastiske (klonal evolution model) og hierarkisk (kræft stamceller model) organisering af tumorer. Ifølge de sidstnævnte, delmængder af celler, de såkaldte tumor-initierende celler (tics) også kendt som cancer stamceller (CSCS) har ansvaret for tumor evolution [2].

TIC er først blevet beskrevet i rammen af ​​hæmatopoietiske maligniteter [3]. Et par år senere blev TIC også identificeret i en bred vifte af solide tumorer såsom bryst [4,5], hud [6], hjerne [7-9], bugspytkirtel [10], lunge [11] og kolon [ ,,,0],12,13]. Tics er defineret ved deres (1) selvfornyelse, (2) at differentiere og (3) tumor-initierende kapacitet. De er blevet beskrevet at opformere tumorer, der er i stand til den gentog heterogeniteten af ​​primære tumorer [3]. Den høje tumorigent potentiale TIC forværres af deres stærke modstand mod radio- og kemo-terapi. Tics er i stand til at omgå DNA beskadigelse under stråling og kemoterapi ved reduktion af ROS og forøget aktivitet af DNA checkpoint kinaser [14]. Den resterende delmængde af TIC kan inducere dannelsen af ​​nye tumorer, hvilket fører til en hurtig recidiv [15]. Som følge heraf kunne TIC-specifikke behandlinger potentielt føre til en reduceret risiko for tumor tilbagefald og en forbedret prognose for CRC patienter. Interessant, forskellige nyere undersøgelser støtter den kliniske relevans af målretning TIC-associerede gener [16].

På trods af betydelige fremskridt i colon TIC forskning, forbliver isolering, identifikation og karakterisering af kolon TIC ufuldstændigt etableret. Forskellige strategier kan vedtages for at få kolon TIC ud af tumorvæv. Isolation teknikker til tics er baseret enten på deres immunogene eller funktionelle egenskaber [17]. Den antigene fremgangsmåde drager fordel af en række celleoverflademarkører, fx prominin-1 (almindeligvis kendt som CD133), CD44, CD34, CD24, epithelial antigen (EpCAM /ESA), CD166, CD29, Lgr5, CD49f og ALDH -1 [17]. Funktionel isolering af TIC afhængig forskellige karakteristika, såsom forankringsuafhængig vækst, kemoresistens, selvfornyelse, asymmetrisk division, og pluripotens. I de seneste år sfæroide kulturer (SC), der er afhængige af forankringsuafhængige vækst egenskaber af stamceller, er blevet anvendt til at berige for TIC i hjernen [18,19], bryst [5,20], og colon [12,21 , 22] væv. Det er godt accepteret, at SC bevare mere trofast karakteristika oprindelige tumorer, herunder genekspression profiler, tumor heterogenitet og tumor morfologi, sammenlignet med regelmæssige vedhængende kulturer [12,19,21-25]. Derudover sfæroider spejle 3D cellulære kontekst og relevante patofysiologiske gradienter af

in vivo

tumorer [26]. i hvilket omfang sfære dannelse analyser favorisere Men berigelsen af ​​TIC er ikke helt klar endnu. Første er det bemærkelsesværdigt, at sfæroiderne også indeholde differentierede tumorceller [21,22,27,28]. For det andet kunne nogle undersøgelser på CRC faktisk vise, at SC har TIC karakteristika [12,21,29-31], mens andre ikke kunne finde nogen berigelse, når man sammenligner dem til vedhængende differentierede kulturer [31-36]. Vigtigere fleste af de ovennævnte undersøgelser er baseret på cellelinier. Det kan spekuleret på, at de inkonsistente observationer opnået med cellelinjer kan skyldes fænotypiske forskelle mellem udvalgte kloner, der kunne have fundet sted over lange perioder af cellekultur [37].

I betragtning af disse modstridende resultater, besluttede vi at karakterisere SC fra forskellige oprindelser i lyset af TIC berigelse. I modsætning til traditionelle cellelinier, patient-afledt primære kulturer afspejler den heterogene karakter af tumor biologi, som det findes i patienter. Således betydningen af ​​denne undersøgelse er at karakterisere genereret SC direkte afledt fra friske kirurgiske prøver og sammenligne dem med deres klæbende differentieret modstykke samt til SC afledt af CRC cellelinjer. Vi ønsker at bestemme, om SC udviser træk af stemness, herunder selvfornyelse, stamceller markør udtryk, differentiering potentiale, modstandsdygtighed over for kemoterapi og tumorgenicitet

in vivo

.

Materiale og metoder

Generation af primær SC og deres differentierede modparter

menneskelige kolon vævsprøver blev indsamlet af det integrerede Biobank Luxembourg (Israel Beer Breweries, www.ibbl.lu) i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier. Alle humane prøver, der anvendes i omfanget af dette arbejde blev doneret frit og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra donoren for brugen af ​​denne prøve i forskning. Etisk godkendelse blev opnået fra Comité National d’Ethique de Recherche, Luxembourg (reference 201009/09). Frisk reseceret colontumorvæv fra 35 CRC patienter blev opsamlet og straks behandlet i kultur. Væv blev vasket flere gange i serumfrit Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) -F12 suppleret med antibiotisk-antimykotisk middel (Invitrogen). Prøverne blev hakket i 1-2 mm

3 stykker efterfulgt af inkubation i collagenase type IV (0,05 mg /ml; Invitrogen) og hyaluronidase (2 ug /ml; Sigma) i 1 time ved 37 ° C. Enkelt cellesuspension blev opnået ved blanding hvert 15. minut og ved filtrering gennem en 70 um cellefilter (BD Biosciences). Primær colon SC blev holdt i ultralav Attachment (ULA) celle dyrkningsflasker (Corning) i serumfrit stamcelle medium indeholdende DMEM-F12 suppleret med B-27 (1x) og N-2 (1x) kosttilskud (Invitrogen), BSA (4 mg /ml; Roth), ikke-essentielle aminosyrer (1x, Sigma), glucose 0,15% (Sigma), insulin (4 U /l; Sigma), Heparin (4 ug /ml), N-acetylcystein ( 1 mM; Sigma), EGF (20 ng /ml; Biomol), bFGF (20 ng /ml; Miltenyi Biotec), og penicillin /streptomycin (1x, Lonza). Dette medium vil yderligere blive betegnet som stamcellemedium (SCM). Til karakterisering formål, vi kun brugt tidlig passage SC inden for denne undersøgelse (ikke mere end 15 passager).

Vi genererede vedhængende voksende differentierede kulturer fra SC på meget tidlige passager. Til dette blev differentierende betingelser anvendt: tidlige sfæroider blev dissocieret og dyrket i DMEM-F12 suppleret med 10% FCS og 1% penicillin /streptomycin i regelmæssige celle dyrkningsbeholdere. I modsætning til SC, differentierede kulturer vokse som adhærente celler. Disse kulturer blev holdt under differentiering i mindst 5 passager inden den anvendes til eksperimenter.

sfæroid kulturer afledt fra CRC cellelinier

HT29, HCT116, LS174T, SW480, og SW620 CRC cellelinier blev opnået enten fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, USA) eller den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) og holdt i anbefalede dyrkningsbetingelser. Til dyrkning af SC, blev cellelinjer dyrket i serum-frit DMEM-F12 suppleret med B-27 (1x; Invitrogen), Insulin (4 U /l; Sigma), Heparin (4 ug /ml; Sigma), EGF ( 20 ng /ml; Biomol), bFGF (20 ng /ml; Miltenyi Biotec), og penicillin /streptomycin (1x, Lonza). Cell line identitet blev bekræftet ved korte tandem repeat genotypebestemmelse ved DSMZ.

3D klumpformet invasion assay

5000 celler af SC udpladedes runde bund 96 brønde ULA-plader i 100 pi DMEM- F12-medium med 1% penicillin /streptomycin. Efter 3 dages sfære dannelse, 10% FCS og 1,25 mg /ml collagen (PureCol, CellSystems) blev tilsat. Efter 1 time af størkning blev sfæroid /collagen suspension overlejret med 100 pi /brønd DMEM-F12 med 10% FCS. Invasion blev overvåget ved at måle den maksimale sfæroid udvækst diameter efter 7 dage.

cellevækst og proliferation

adhærente celler blev podet i plader med 6 brønde og SC i ULA plader med 6 brønde i deres respektive medium. Efter 5 dage blev celler dissocieret til en enkelt cellesuspension, farvet med Trypan blå og talt med en celletælling indretning (CEDEX, Roche).

In vitro

begrænsende fortynding sfære dannelse assays

SC blev dissocieret i TrypLE Express (Gibco) ved pipettering op og ned i 1 minut, inkuberet ved 37 ° C i 3 minutter og ledt gennem et 40 um cellefilter (BD Biosciences) for at opnå enkeltcellesuspensioner.

Single celleassay

: Celler blev podet ved en densitet på 1 celle per brønd i en 96-brønds plade ved et endeligt volumen på 100 pi. Enkelt celle seeding effektivitet var ca. 30% og kun brønde, der oprindeligt indeholdt enkeltceller blev evalueret for efterfølgende analyser. Sfæroider blev talt efter 10-14 dage, afhængigt af vækstraten for den anden primære SC. 50-60 enkeltceller pr betingelse blev analyseret for kugle-dannelse og kun spheres større end 50 um i størrelse blev inkluderet i analyserne. Den ekstreme begrænsende fortynding analyse ELDA software (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) [38] blev anvendt til at bestemme det estimerede stamcelle frekvens for enkelt celleassays.

1000 celleassay

:. 1000 celler /brønd blev podet i en 6-brønds plade ULA og sfæroider blev talt efter 7 dage

Immunofluorescens

Immunofluorescens blev udført på cytospins ( EZ Cytofunnels) (Thermo Scientific) for SC og på dækglas for vedhængende cellekulturer. Prøver blev fikseret med iskold methanol i 10 minutter ved -20 ° C, blokeret med en 3% BSA /PBS-opløsning efterfulgt af inkubation natten over ved 4 ° C med det primære antistof. Sekundært antistof blev anvendt i 1 time ved stuetemperatur; prøver blev monteret med DAPI-holdige Fluoromount G (Southern Biotech) og analyseret på et konfokalt mikroskop (Zeiss LSM 510 Meta). For at attestere, at farvningen var positiv i hele klumpformet blev z-stakke udført. De anvendte antistoffer er anført i S1A tabel.

fluorescensaktiveret cellesortering og flowcytometri

I flowcytometri blev prøver fremstillet som tidligere beskrevet (Shmelkov et al, 2008) og kørt på en FACS canto II. De primære antistoffer anvendes, er i S1B tabel.

Real-time qPCR

AllPrep ekstraktionskit (Qiagen, Hilden, Tyskland) blev anvendt til at ekstrahere RNA. cDNA blev opnået ved revers transkription under anvendelse af de høj kapacitet cDNA revers transkription kit (Applied Biosystems). Absolute Blå qPCR SYBR Green Low ROX Mix (Thermo Scientific), 2,5 pmol af hver primer og 5 ng cDNA pr reaktionen blev anvendt, og reaktionen blev kørt på en 7500 FAST Real time PCR Detection System (Applied Biosystems) variator med følgende indstillinger : 40x (95 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 30 sek). Ekspressionsniveauer af genet af interesse blev normaliseret mod flere referencepunkter gener [39] ved hjælp af qbase + software [40], i overensstemmelse med retningslinjerne MIQE. De anvendte referencepunkter gener var: EFF1A1, B-Actin, 28S, YWHAZ. Primerpar anvendt til RT-qPCR er vist i S1c tabel.

Kolonidannelse assay Salg

Celler afledt fra SC eller differentierede kulturer blev podet ved forskellige tætheder på 250, 100, 50, 20 celler /brønd i differentierende medium indeholdende serum. Efter 10 dage blev kolonier farves og tælles under et mikroskop.

kemosensitivitet analyser

For at vurdere kemoresistens vi anvendte forskellige analyser. Det første assay var baseret på en 3D sfæroid-system, hvor celler afledt fra SC eller differentierede modstykker blev podet i en rundbundet 96-brønds ULA plade med en tæthed på 5000 celler /brønd i serumfrit DMEM-F12 suppleret med 1% penicillin /streptomycin. Efter 3 dages kugleformet dannelse, 5-fluoruracil (5-FU) (Sigma) blev tilsat ved varierende koncentrationer. Sfære størrelse blev målt hver 24. time i 5 dage og sfære krympning blev vurderet ved at bestemme den relative sfære størrelse kontrol og behandlede betingelser. Det andet assay var baseret på en 2D monolag systemet ved hjælp af celleproliferation reagens WST-1 (Roche, Tyskland). Til dette blev 30.000 celler af både SC og de differentierede modparter udpladet i 96-brønds plader i 200 pi DMEM-F12-medium, suppleret med 10% FCS og 1% penicillin /streptomycin medium med eller uden 50 pM 5-FU. WST-1 blev tilsat ved en 1:10 slutkoncentration efter 5 dage og inkuberes i 1 time ved 37 ° C og den relative overlevelse blev bestemt. Desuden udførte vi enkelt celle og kolonidannende analyser i tilstedeværelse af 5 uM 5-FU til vurdering af kemoresistens.

In vivo

tumordannelse analyser

Ikke-fede diabetiske /alvorlig-kombineret immundefekt (NOD /SCID) mus blev opnået fra Harlan Laboratories Holland og eksperimenter udført i overensstemmelse med alle gældende love og regler efterfølgende godkendes af institutionens Dyrepleje og etisk komité fra University of Luxembourg (Permit nummer: 14-MDM -02). Tumorfremkaldende kapacitet SC i NOD /SCID-mus blev vurderet ved at fremstille serielle fortyndinger af celler (10. 000, 1000, 100 og 10 celler; 5-6 injektioner /celle dosis). Enkelte celler blev resuspenderet i 100 pL af 1: 1 blandet serum-frit medium og matrigel (BD Biosciences) og injiceret subkutant i flanken af ​​6 uger gamle mus. Tumorvækst blev fulgt 1-2 gange om ugen og tumorvolumen blev beregnet ved formlen L * W

2/2. Eventuelle mus viser alvorlige tegn på vægttab eller angst eller en tumorstørrelse nå 1000 mm

3 blev fjernet fra undersøgelsen og aflives for at undgå unødig smerte og ubehag i henhold til de etiske retningslinjer. For serielle transplantationer blev tumorer eksplanteret, dissocieret i kultur og re-injiceres i anden modtagende mus. Sektioner af genererede xenotransplantater blev farvet med eosin og hematoxylin og analyseret af en patolog. For direkte at sammenligne SC med deres differentierede modstykke, vi valgte den laveste testede dosis (10 celler /injektion for T20 og 100 celler /injektion for HT29, n = 5) og celler fra differentierede eller sfæroide kulturer blev injiceret på højre og venstre henholdsvis .

microarrays og mutation profilering

de microarrays blev udført på Luxembourg Institute of Health (LIH) efter RNA kvalitet og renhed kontrol ved hjælp af en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Affymetrix gen chip Human Gene ST v2.0 arrays er udarbejdet i overensstemmelse med den standard protokol. Microarray data blev forbehandles ved hjælp af den Robust Multiarray Analysis (RMA) algoritme med GC-korrektion ved hjælp af kommerciel software Partek Genomisk Suite (version 6.6, Copyright 2015 Partek Inc., St. Louis, MO, USA). Tre gentagelser blev kørt for alle betingelser for microarrays undtagen T18 som vi kørte 4 tekniske gentagelser. Vi måtte trække en prøve af HCT116 cellelinien, på grund af sin lave kvalitet efter hybridisering. Data blev analyseret, og resultaterne visualiseret i R /BioConductor (version 3.1.2). Microarray data er tilgængelige i databasen ArrayExpress under tiltrædelsen nummer E-mtab-3575. Top mutationer blev vurderet ved hjælp af TruSeq Amplikon-Cancer panel (TSACP) med MiSeq platformen ifølge Illumina retningslinjer med følgende kriterier: dybde 1000 og en variant frekvens på 0,05. Af etiske formål var vi ikke i stand til at medtage mutational profil for patient T6.

Differential genekspression og overlevelsesanalyse

Microarrays (ArrayExpress databasen tiltrædelse nummer E-mtab-3575) blev udført i overensstemmelse med standard protokoller (se supplerende materiale og metoder afsnit). Differentielt udtrykte gener mellem SC og de respektive differentierede kolleger blev bestemt ved lineær modellering med empirisk Bayes tilgang realiseret i

limma

pakke (https://www.bioconductor.org/packages/release /bioc /html /limma. html). En fælles sfære gen signatur mellem primær og cellelinje afledt SC blev bestemt som skæringspunktet mellem up-regulerede gener med FDR 0,05 og log-fold ændring log2FC 0,6. To uafhængige offentligt tilgængelige datasæt fra en samling til rådighed i databasen PROGgeneV2 [41], som indeholder oplysninger om den samlede overlevelse CRC patienter blev anvendt til at generere overlevelseskurver: GSE17536 [42], der består af 177 patientprøver og GSE29621 [43], der består af 64 patient prøver. Vi fandt en signifikant sammenhæng med dårlig patientoverlevelse i disse 2 datasæt blandt en samling til rådighed i ovennævnte værktøj. Datasættet GSE39582 [44] bestående af 566 patientprøver blev brugt til at undersøge effekten af ​​det identificerede sfære gen underskrift på sygdomsfri overlevelse.

Statistisk analyse

GraphPad Prism 5 software blev anvendt til statistisk analyse. Vi brugte uparret Student t-test til at sammenligne 2 betingelser og 2-vejs ANOVA test med Bonferroni post-tests for at sammenligne behandlingseffekt over tid. Alle forsøg blev udført i mindst 3 uafhængige forsøg, medmindre andet er angivet.

Resultater

Genereret SC stammer fra primær tumor væv bevarer egenskaberne af originale tumorer

Vi først vurderede evnen at berige for TIC i CRC prøver vha flere af de tidligere rapporterede potentielle overflademarkører. Ekspressionen af ​​formodede stamcellemarkører CD44, CD24, EpCAM, CD166 og CD133 blev analyseret ved flowcytometri. Vi fandt, at patientens biopsier er meget heterogene i form af fænotypiske markører (S1 Fig), spørgsmålstegn ved deres troværdighed til identifikation af TIC. Vi besluttede endvidere at sortere celler direkte fra patient- eller cellelinje-afledt SC efter deres CD133 udtryk og udførte funktionelle encellede analyser. Kuglen danner celle (SFC) frekvens var ens blandt CD133 lav, middel og høj population (S1 Fig), hvilket tyder på, at CD133 ekspressionen ikke korrelerer til øget kugle-dannende kapacitet. Langs den samme linje, flere

in vivo

undersøgelser viser, at CD133 + og CD133- celler danner tumorer med tilsvarende effektivitet [34,45,46]. Samlet set har disse resultater tyder på, at formodede TIC markører er ikke pålidelige til identifikation af TIC i vores system.

SC kan afspejle tumor heterogenitet, som den eksisterer i patienter og er blevet beskrevet til at blive beriget med TIC. Vi indsamlede frisk tyktarmskræft væv fra 35 patienter, som ikke havde fået kemoterapi eller strålebehandling inden operationen. Efter enzymatisk fordøjelse, blev enkelt cellesuspension udplades i SCM for at fremme klumpformet vækst. Tumor eksemplarer af 5 ud af 35 patienter (15% effektivitet) førte til stabil primær SC, at vi var i stand til at opretholde i kultur i længere passager (mere end 20 passager) (figur 1

A

og S2 tabel). De resterende tyktarmskræft væv førte ikke til sfære dannelse eller mistet deres sfære-dannende kapacitet efter nogle få passager. Det er bemærkelsesværdigt, at succesraten observerede er sammenlignelig med andre forsøg på at etablere SC fra kolorektal tumorvæv [47,48]. De biopsier, der gav anledning til en stabil SC var af forskellige histologiske stadier af CRC (S2 tabel). Tre primære SC T6, T18 og T20, der repræsenterer stadie IIIC, scene IIA og scene IVA CRC henholdsvis blev valgt til karakterisering (S2 tabel). Interessant, SC stammer fra T6 og T20 patienter viste en øget invasiv kapacitet i forhold til T18 klumpformet kultur, som var afledt af et tidligere tidspunkt, nemlig fase II (Fig 1

B

og en

C

). Dette resultat antyder, at SC er afledt af primære tumorer, kan bibeholde de invasive egenskaber af deres tumor oprindelsesland. Dog skal denne observation, at blive yderligere behandlet i meget større kohortestudier. Især flere CRC-relevante mutationer påvises i tumoren oprindelseslandet var også til stede i den primære SC (S2 Fig). Vi har desuden etableret vedhængende differentierede modstykker til den primære SC (figur 1

A

og Materiale og metoder afsnit). Sammenligningen af ​​SC med deres respektive differentierede modstykker fra den samme patient kan tillade studere SC-specifikke egenskaber med hensyn til TIC. I nærværelse af serum, SC ændre deres fænotype og vokse som en adhærent cellelag. Interessant nok viste adhærente differentierede modstykker øget proliferation sammenlignet med SC (S3 Fig). Ud over anvendelse af primære tumorvæv, vi også testet evnen hos CRC cellelinjer til dannelse SC. HT29, HCT116, LS174T, SW480 og SW620 cellelinier gav anledning til kugler over flere passager mens opretholdt i SCM (Fig 1A og data ikke vist). Konsekvent til SC stammer fra primært væv, HT29- og HCT116- afledt SC viste en lavere spredning sats sammenlignet med deres forældres vedhængende modstykke (S3 Fig). Denne observation, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [35,36], viser, at ved differentiering, erhverve TIC øget proliferative egenskaber. I de følgende eksperimenter, vi fokuserede på den omfattende karakterisering af 3 SC etableret fra primære patientmateriale og 2 SC stammer fra CRC cellelinjer, nemlig HT29 og HCT116.

(

en

) Morfologiske træk af 2 CRC cellelinier (HT29, HCT116) og 3 primære patient tumorer (T6, T18, T20) dyrkes som SC (S, venstre panel) og deres differentierede modparter (

D

, højre panel). (

b

) 3D klumpformet invasion assay af SC stammer fra primær tumor væv T6, T18 og T20. Repræsentative billeder af indlejrede spheroids efter 7 dages invasion. (

c

) Kvantificering af den maksimale klumpformet udvækst diameter (um) efter 7 dages invasion. Repræsentativt tal af 3 uafhængige eksperimenter, skala bar = 100 um. Data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 8); * P 0,05, ** P. 0,01

klumpformet kulturer viser udtryk for stemness proteiner

For at undersøge nærmere de fænotypiske forskelle mellem SC og de respektive differentierede modparter analyserede vi ekspressionen af ​​vigtige stemness proteiner, såsom SOX2, OCT4, NANOG og LGR5 samt CK20, et centralt epitheldifferentiering markør. Den transskription faktorer OCT4, SOX2 og NANOG er kendt som master-regulatorer af pluripotens og er ansvarlige for at opretholde en udifferentieret tilstand [49] samt favorisere selvfornyelse kapacitet TIC [50]. SC viste høje niveauer af stemness proteiner mens CK20 knapt blev udtrykt (Fig 2

A

). Vigtigt er det, de vedhængende differentierede modstykker udtrykte CK20 og mistede udtryk for centrale stemness proteiner. I lighed med protein niveauer blev ekspressionen af ​​centrale stemness gener steget i SC i forhold til differentierede kulturer (Fig 2

B

). Interessant

LGR5

udtrykkes kraftigt i primær SC, i modsætning til SC afledt af CRC cellelinjer (fig

2A og 2B

). Vi vurderede også udtryk for β-catenin, en funktionel markør for CRC stemness, og fundet et højere udtryk i SC (fig 2

B

). Tilsammen viser disse data, at SC display højere stemness og lavere niveauer af epitheldifferentiering markører.

(

en

) Immunofluorescens farvning af SC afslører en forøget ekspression af centrale stemness proteiner SOX2, OCT4 og LGR5, og en nedsat ekspression af CRC differentieringsmarkør CK20 sammenlignet med adhærente differentierede modstykker. NTERA-2 humane embryonale carcinomceller blev anvendt som positiv kontrol for farvning og viste lignende signal intensitet for alle de vurderede pluripotens markører (data ikke vist). Forstørrelse 40x. (

b

) Gen-ekspression af centrale stemness gener af SC og differentierede modstykker. Repræsentant tal på 3 uafhængige forsøg. Data præsenteres som gennemsnit ± SD, * P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001, ns = ikke signifikant

klumpformet kulturer og vedhængende differentierede kolleger vise lignende selv- fornyelse og tumor-initiering kapacitet

Vi var interesserede i at bestemme funktionelle forskelle med hensyn til TIC egenskaber mellem SC og vedhængende differentierede modstykker. I første omgang forsøgte vi at udføre sfære dannelse analyser ved udpladning forskellige celledensiteter. Mange undersøgelser af TIC viser selvfornyelse kapacitet ved hjælp af kugle dannelse analyser ved podning stort antal celler pr. Men i vores erfaring og som allerede nævnt af andre [33], plating høje celledensiteter fører til sfære dannelse gennem sammenlægning og fusion efterfulgt af efterfølgende spredning snarere end gennem selv-fornyelse kapacitet af en celle, og dermed forfalske sfære danner resultater kapacitet ( S4A fig). For således at sikre en egentlig klonalitet og ikke fusion eller aggregering af celler udførte vi sfære dannelse assays på enkelt celle niveau. De 3 stabile primære SC og 2 SC stammer fra CRC cellelinier alle viste selvfornyende kapacitet, som blev opretholdt over flere passager (Fig 3

A

). For patient T6, der var 1 sfære danner celle (SFC) i 9,14 celler til passage 1, 1 SFC i 7,51 celler til passage 2, og 1 SFC i 11,66 celler til passage 3 (S3 Table). Påfaldende, T20, afledt af en patient, som allerede havde metastase på tidspunktet for resektion, viste en øget SFC frekvens sammenlignet med T6 og T18 (S3 tabel). Interessant, SFC frekvensen stiger fra tidlige passager (passage 5) til slutningen af ​​passager (passage 15-25), hvilket tyder på, at kulturer opretholdt i stamcelle berigende forhold viser øget TIC adfærd over tid (figur 3

B

). Selv efter lang tids kultur i SCM, SC, der er overført til differentiere dyrkningsbetingelser har stadig evnen til at klæbe og morfologisk ligne den differentierede modstykke eller den parentale cellelinje (figur 1

A

og S5D Fig).

(

en

) Sphere formation satser blev bestemt over flere generationer (gen.) ved såning enkelte celler fra tidlig passage SC vokset fra primær tumor væv og CRC-cellelinjer. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. (

b

) Self-fornyelse kapacitet af tidlig (passage 5) og sent (passage 15-25 afhængig af tumor) SC fra primær tumor væv. Data er præsenteret som gennemsnit med 95% konfidensinterval.

Næste, vi studerede tumorigent potentiale SC. Primær SC genereret fra tumorvæv hos patienter T6, T18 og T20 var i stand til at inducere tumordannelse i NOD /SCID-mus med celleantal i området fra 10.000 celler til 10 celler pr injektion (figur 4

A

). TIC frekvens varierede fra 1 i 6 til 1 i 22 kugleformede celler afhængig af den respektive patientprøve (S4 tabel). Tilsvarende SC afledt af CRC cellelinier også indledt tumorvækst i mus med celleantal i området fra 10.000 celler til 100 celler (S6A Fig og S4 Table), selvom HCT-116 SC havde en lavere tumorincidensen sammenlignet med primær SC (S4 tabel) . I begge tilfælde tumor vægt pænt korreleret med injicerede celletal (Fig

4B

og S6B Fig). Interessant primære SC etableret fra tumor prøve af patientens T20 var i stand til at inducere tumordannelse i mus meget hurtigere med højere tumorincidensen forhold til T6 og T18 SC (fig 4

A

og S4 tabel). Fænotypen af ​​T20-afledt SC, som er kendetegnet ved høj SFC frekvens, tumorforekomst og tumorproliferation understreger og rekapitulerer den aggressive karakter af den primære tumor i patientens T20.