PLoS ONE: Udvikling af Multiplexed Bead-baserede Immunoassays til påvisning af tidlige fase kræft i æggestokkene med en kombination af Serum Biomarkers

Abstrakt

CA125 som biomarkør for kræft i æggestokkene er ineffektiv for den almindelige befolkning. Formålet med denne undersøgelse var at evaluere multipleksede bead-baseret immunassay af multiple æggestokkene cancerassocierede biomarkører såsom transthyretin og apolipoprotein A1, sammen med CA125, at fremme identifikation og vurdering af prognose af kræft i æggestokkene. Vi målte serumniveauerne af CA125, transthyretin og apolipoprotein A1 fra serum fra 61 raske individer, 84 patienter med benign ovariesyndrom og 118 patienter med ovariecancer bruger multiplex flydende assaysystem blev Luminex 100. Resultaterne analyseres derefter efter til sunde og /eller godartet versus kræft i æggestokkene fag. Da CA125 blev kombineret med de andre biomarkører, blev den samlede sensitivitet og specificitet væsentligt forbedret i ROC-kurve, som viste 95% og 97% følsomhed og specificitet, hhv. Ved 95% specificitet for alle faser øget følsomhed over for 95,5% mod 67% for CA125 alene. For trin I + II, følsomheden steget fra 30% for CA125 alene til 93,9%. Trin III + IV, var de tilsvarende værdier 96,5% og 91,6%, henholdsvis. Også de tre biomarkører var tilstrækkelige for maksimal adskillelse mellem noncancer (sunde plus godartet gruppe) og trin I + II eller alle trin (I-IV) for sygdom. Den nye kombination af transthyretin og apolipoprotein A1 med CA125 forbedret både følsomheden og specificiteten af ​​kræft i æggestokkene diagnose sammenlignet med de enkelte biomarkører. Disse resultater tyder på fordelen af ​​kombinationen af ​​disse markører til diagnosticering af kræft i æggestokkene

Citation:. Kim YW, Bae SM, Lim H, Kim YJ, Ahn WS (2012) Udvikling af Multiplexed Bead-baserede Immunoassays til påvisning af tidlige fase kræft i æggestokkene Ved hjælp af en kombination af Serum Biomarkører. PLoS ONE 7 (9): e44960. doi: 10,1371 /journal.pone.0044960

Redaktør: Jose Luis Perez-Gracia, Universitetsklinikken i Navarra, Spanien

Modtaget: 11. marts 2012; Accepteret: August 10, 2012; Udgivet 10. september, 2012 |

Copyright: © Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af Grundforskningsfonden Korea (NRF), Seoul, Republikken Korea (Grant # 5-2011-A0154-00119). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ovariecancer har en højere dødelighed-til-sag-forhold end nogen anden gynækologisk malignitet, da det har en tendens til at være kompleks af symptomer og fejldiagnosticeret end andre sygdomme, som resulterer i langt de fleste patienter med ovariecancer bliver diagnosticeret i fremskredne metastatiske stadier (stadium III /IV) [1] – [3]. Det 5-års overlevelsesraten for patienter med tidlig fase kræft varierer fra 50 til 95%, men kun ca. 20% af alle indberettede tilfælde er fanget i de tidlige stadier; 5-års overlevelse er ca. 11%, når påvist i de fremskredne stadier (III /IV) [4] – [6]. Derfor har været fokuseret mange bestræbelser på at identificere diagnostiske biomarkører til tidlig opdagelse af kræft i æggestokkene [7], [8]. En robust påvisningsfremgangsmåde baseret på molekylære profiler for ovariecancer er endnu ikke klarlagt, fordi sygdommen udviser metaboliske ændringer som følge af tilstedeværelsen af ​​tumoren og potentielle genetiske variationer, der påvirker blodets kemi under tumorprogression [9].

cancer antigen 125 (CA125) assay er den mest anvendte kliniske biomarkør for ovariecancer [10]. Imidlertid har CA125 vist sig at være en dårlig diagnostisk tumor biomarkør fordi den mangler specificitet og sensitivitet for tidlig ovariecancer (kun 23% i trin I ovariecancer, i modsætning til mere end 80% i fremskreden ovariecancer) [11]. Det er hævet over referenceniveauer i kun 50% af klinisk påviselig tidligt stadium sygdom, og ikke sjældent forhøjet hos patienter med benigne æggestokkene sygdomme [12], [13]. Desuden er CA125 niveauer falsk forhøjede hos gravide kvinder og kvinder med påviselige intraperitoneale patologier [14] – [16]. Derfor har man forsøgt at kombinere eller erstatte CA125 med andre markører, og forskere har vurderet evne nogle etablerede markører til at forbedre identifikationen og prognose af ovariecancer [12], [17], [18], hvilket viser, at tilføjelse af en eller flere markører til CA125 ville forbedre diagnostik og prognostisk ydeevne, hvis følsomhed blev forbedret uden tab i specificitet. Men fordi målingen af ​​serum koncentrationen af ​​hvert formodet biomarkør med individuelle ELISA kræver betydelig tid, omkostninger og prøvevolumener, nye metoder eller teknologier til multiplexing skal udvikles.

Luminex perle-baseret system er en automatiseret high-throughput assay platform, der giver multiplexing i en opløsningsfase, hvilket resulterer i at det er særlig fleksibel og destruktiv til proteinanalyse. Anvendelsen af ​​påvisning antistoffer mærket med biotin og streptavidin-R-phycoerythrin tillader kvantificering af antigen-antistof-reaktioner, der forekommer på mikrosfæren overfladen gennem måling af den relative fluorescensintensitet. Derfor er systemet i stand til at måle op til 100 analytter samtidigt i et lille prøvevolumen (mindre end 50 pi), hvilket indikerer multivariate metoder, der bruger et panel af biomarkører til at forudsige specifikke kliniske endepunkter af interesse.

I denne undersøgelse, forsøgte vi at måle tre serum biomarkører for ovariecancer, CA125, transthyretin og apolipoprotein A1, under anvendelse af en multiplex bead-baseret immunassay-system, og evaluerede den kombinerede effekt af de tre biomarkører til diagnosticering af ovariecancer sammenlignet med de de enkelte markører alene.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Alle patienter, der deltager i undersøgelsen havde underskrevet en samtykkeerklæring om, at patienternes prøver kan anvendes til videnskabelig intentioner. Prøver blev opnået fra patienterne på Institut for Obstetrik og Gynækologi i konkordans med procedurer, der er godkendt af Institutional Review Board af det katolske universitet i Korea (07BR212).

Patienter og prøver

Alle patienter blev indskrevet på St. Marys Hospital i katolske Medical School i perioden fra januar 2001 til juli 2007 i henhold til de procedurer, der er godkendt af Institutional Review Board af det katolske universitet i Korea. Denne undersøgelse var baseret på analyser af serum indsamlet fra 118 patienter med kræft i æggestokkene, 84 med godartet sygdom, og 61 raske kvinder. Serumprøver fra patienter blev indsamlet før operation, og derefter inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af centrifugering ved 3000 rpm i separation. Serummet blev opbevaret ved -70 ° C indtil anvendelse i eksperimenter; hyppige nedfrysning og optøning blev undgået. De etaper og kvaliteter af tumorer fra æggestokkene kræftpatienter blev tildelt i henhold til de retningslinjer, som International Federation of Gynækologi og obstetrik (FIGO), og de tilmeldte grupper blev derefter opdelt efter alder.

Konjugation af primær antistoffer med mikrokugler Salg

Tre forskellige typer af mikrosfærer (1 × 10

6 mikrosfærer til hvert antistof, Biosource, Camarillo, CA) blev fremstillet i hvert rør, og blev derefter resuspenderet godt ved hvirvelblanding og lydbehandling efterfulgt ved centrifugering i 2 minutter ved 8000 rpm. Supernatanter blev kasseret, og pellets blev gemt og vasket en gang med 100 pi saltvand. Firs pi 100 mM monobasisk natriumphosphat (pH 6,2, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 10 pi 50 mM sulfo-NHS (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) og 10 pi 50 mM EDC (Pierce Biotechnology) blev tilsat, og opløsningen blev derefter inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering (8.000 rpm, 2 minutter), blev pelleterne gemt og vasket to gange med 250 pi af 50 mM MES (pH 5,0, Sigma-Aldrich). Efter fjernelse af supernatanten blev 500 pi MES tilsat til hvert rør, herunder forskellige mikrosfærer. Efter tilsætning af 0,5 ug af hvert antistof [anti-CA125 (Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA), anti-transthyretin (Abcam), og anti-apolipoprotein A1 (Fizgerald Industries International, Inc.)] i hvert rør blev rørene inkuberet i 2 h på et rysteapparat, som var beskyttet mod lys. Efter inkubationen blev antistofbundne mikrosfærer pelleteret ved centrifugering i 2 minutter ved 8000 rpm, og 500 pi 1% BSA puffer blev derefter tilsat. Efter yderligere inkubering i 30 minutter ved stuetemperatur blev mikrosfærerne vasket to gange med 1% BSA buffer og derefter opbevaret ved 4 ° C beskyttet mod lys.

mærkningsprodukter biotiner på de sekundære antistoffer

for mærkning biotiner på de sekundære antistoffer blev en biotin mærkning kit (Alpha Diagnostics International Inc., San Antonio, TX), der anvendes i overensstemmelse med protokollen af ​​producenten. Kort beskrevet biotin blev tilsat i et forhold på 1:10 (biotin: antistof). Efter inkubation i 1 time ved stuetemperatur under beskyttelse mod lys, blev dialyse udført med phosphatbufret saltvand (PBS).

Analyse af prøver ved multiplex flydende matrix-system, Luminex 100

Serummet fra sunde individer og æggestokkræft patienter blev fortyndet til 1:100 i en buffer med 1% BSA (Sigma-Aldrich) og 0,05% Tween 20 (Sigma-Adrich). Halvtreds pi af hver fortyndet serum blev udpladet på et 1,2 um filter plade (96 brønde), hvortil 2.500 perler af hvert antistof-bundne mikrosfære blev tilsat i 50 pi. Efter inkubation i 2 timer ved stuetemperatur under beskyttelse mod lys, blev de vasket to gange med PBS-buffer med 0,05% Tween 20. Et hundrede pi af 0,4 ug streptavidin-R-phycoerythrin (Sigma-Aldrich) blev tilsat til hver brønd, og pladerne blev derefter inkuberet i 30 minutter, efterfulgt af to vaske med PBS indeholdende 0,05% Tween 20. identifikationen af ​​antistofbundne mikrosfærer og screening af antigen-antistof-bundne mikrosfærer blev udført ved hjælp af Luminex 100 (Luminex Corp, Houston, TX) i overensstemmelse med protokollen af ​​producenten. Intervaller af koncentrationerne af hvert antigen for standardkurver var 10-250 U /ml for CA125, 0,1-100 ug /ml for transthyretin og 0,5-50 ng /ml for apolipoprotein A1. Dataene blev analyseret af BeadView programmet (Upstate, Charlottesville, VA).

Statistisk analyse

Variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til at vurdere den statistiske signifikans af forskelle mellem den sunde enkeltpersoner og æggestokkene kræftpatienter. SigmaPlot (v12.0, Systat, Chicago, IL) og SAS (v9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA) blev anvendt til statistisk analyse for at bestemme følsomhed, specificitet, og modtageren operatør karakteristik (ROC) kurve ( bEMÆRKNING i File S1).

bemærkning kriterier

En beskrivelse af opfyldelsen af ​​Reporting Anbefalinger for tumormarkør Prognostiske Studies (NB) [19] kriterier for biomarkør undersøgelser findes i File S1.

Resultater

serum niveauer af æggestokkene tumormarkører i sund kontrol, godartet og kræft i æggestokkene grupper

karakteristika patienter og serumniveauer af kræft i æggestokkene markører er vist i tabel 1 . Koncentration af serum biomarkører såsom CA125, transthyretin og apolipoprotein A1 i serum fra raske individer, godartede patienter og æggestokkene cancerpatienter blev samtidigt målt med en multiplex flydende matrix, der anvender mikroperler coatet med capture-antistoffer og biotin-mærkede antistoffer mod hvert af de tumormarkører og streptavidin-R-phycoerythrin. Serumniveauerne af CA125 var signifikant højere hos patienter med ovariecancer end hos raske individer og godartede patienter, mens niveauerne af transthyretin og apolipoprotein A1 var lavere i patienter med ovariecancer (fig. 1a). Først, sammenlignede vi serumniveauerne af disse tre tumormarkører ifølge tumor faser (fig. 1B). Serumniveauerne af CA125 blev gradvist forhøjet med tumor fase. Også, blev både transthyretin og apolipoprotein A1 steget betydeligt i raske personer. Dernæst forsøgte vi at sammenligne serumniveauerne af tre tumormarkører ifølge histologiske typer ovariecancer (fig. 1C). Serum niveau af CA125 var den højeste i serøs varetype med dem i de andre typer.

(A) raske kontrolpersoner, godartet ovariesyndrom og æggestokkene kræftpatienter (B) tumor stadier i æggestokkene kræftpatienter (C) forskellige histologiske undertyper i æggestokkene kræftpatienter. P-værdi over en gruppe betegner statistisk signifikans af forskellene mellem hver gruppe og raske kontrolpersoner. Hver kræft i æggestokkene fag blev sammenlignet med raske kontrolpersoner. N, raske kontroller; BE, godartet ovariesygdom; C, clear cell; E, endometrioide; G, granulosacelle; M, mucinøs; S, serøs; O, andet.

Sammenligning af følsomheden og specificiteten mellem tre tumormarkører alene og kombinationen af ​​tre markører til diagnosticering af kræft i æggestokkene

Så sammenlignet vi følsomheden og specificitet mellem hver markør alene og de tre markører i kombination med henblik på at diagnosticere kræft i æggestokkene under anvendelse receiver operating characteristic (ROC) analyse. I denne undersøgelse anvendte vi afskæringsværdier på 35 U /ml, 100 ng /ml og 500 ng /ml for CA125, transthyretin og apolipoprotein A1, henholdsvis for bedre diagnostisk nøjagtighed for de testede her prøver. Ved at bruge disse afskæringsværdier, var vi i stand til at minimere satserne for falsk-positive og falsk-negative resultater i differentieringen af ​​godartede patienter fra individer med kræft i æggestokkene. De følsomheder og særlige for at skelne mellem kræft i æggestokkene og godartet sygdom er vist i figur 2. Følsomheden og specificiteten af ​​de enkelte markører med CA125, transthyretin og apolipoprotein A1 var 77,4% og 70,8%, 69,7% og 63,6%, og 60,2% og 56,9%, (fig. 2A). Følsomheden og specificiteten af ​​de enkelte markører for debuterende (fase I og II) var 51,6% og 51,2%, 61,2% og 59,2%, og 51,3% og 54,6%, henholdsvis (fig. 2B). Og følsomheden og specificiteten af ​​de enkelte markører for sen-fase (fase III og IV) var 93,4% og 84,3%, 74,9% og 68,2% og 58,4% og 55,1%, henholdsvis (fig. 2C). Ved simpel visning af kurver, den diskriminerende magt i fig. 2A er beskeden endnu bedre for CA125, i fig. 2B, meget svag for alle biomarkører med nogle præference TTR, og i fig. 2C, klart stærkest til CA125 efterfulgt af TTR og ubrugelig for ApoA1.

De viste blev opnået ved forarbejdning kvantificerede rådata ved SigmaPlot 12.0 versionen software og følsomheden kurver /specificitetsværdier blev forudsagt fra arealet under kurverne og de beregnede data. ROC-kurver for CA125, transthyretin og apolipoprotein A1 alene: (A) godartede patienter versus patienter med ovariecancer; (B) godartede patienter versus patienter med trin I til II ovariecancer; (C) godartede patienter versus patienter med trin III til IV ovariecancer.

Når CA125 blev kombineret med de biomarkører (transthyretin og apolipoprotein A1), den samlede sensitivitet og specificitet for at skelne mellem kræft og sund æggestokkene personer blev væsentligt forbedret i ROC-kurven (fig. 3A-C). De tre biomarkører (CA125, TTR, og Apo-A1) signifikant fornemme patienter med tidlig fase ovariecancer fra raske individer. Ved 95% specificitet for alle faser øget følsomhed over for 95,5% mod 67% for CA125 alene. For trin + I II øgede følsomhed over for 93,9% fra 30% for CA125 alene. For trin III + IV var de tilsvarende værdier henholdsvis 96,5% og 91,6%, hvilket tyder på, at de tre-biomarkør panel klassificeret tidlige fase kræftformer med 94% sensitivitet på 95% specificitet, hvilket var betydeligt højere end CA125 alene. Den overordnede sensitivitet og specificitet til at skelne mellem kræft i æggestokkene og benign ovarie sygdom blev lidt bedre i den fase I + II patientgruppe kun, som viste 61,6% og 58% sensitivitet og specificitet, henholdsvis (fig. 3D-F). I figuren er det tydeligt, at forskellen mellem CA125 og panelet for sunde vs. total og trin I + II ovariecancer er meget signifikant (P 0,0001), men ubetydelig for sunde vs. stadium III + IV cancer (P = 0,043); i modsætning til de mere vigtige skelnen mellem godartet vs. ovariecancer er forskellen mellem CA125 og panelet mangler for godartet vs. total og fase I + II æggestokkræft og temmelig bedre for godartet vs fase III + IV ovariecancer (P = 0,045). Som det vigtigste diskrimination generelt postuleres mellem en ondartet gruppe og dens forskelligt relevant godartet sygdom gruppe, bliver det klart, at forskellen mellem CA125 og panelet er lidt bedre for godartet vs etaper III + IV.

Kurverne vist blev opnået ved forarbejdning kvantificerede rådata af SAS 9.1-version software og følsomheden /specificitetsværdier blev forudsagt fra arealet under kurverne og de beregnede data. ROC kurver for CA125 alene, og tre-biomarkør panel: (A) raske kontrolpersoner versus patienter med kræft i æggestokkene. Den overordnede forskel i AUC mellem tre-biomarkør panel og CA125 alene var statistisk signifikant (P 0,0001); (B) raske kontrolpersoner versus patienter med trin I til II kræft i æggestokkene (P 0,0001); (C) raske kontrolpersoner versus patienter med trin III til IV ovariecancer (P = 0,043); (D) godartede patienter versus patienter med kræft i æggestokkene. (P = 0,49); (E) godartede patienter versus patienter med trin I til II ovariecancer (P = 0,19); (F) godartede patienter versus patienter med trin III til IV ovariecancer (P = 0,045).

De tre biomarkører var tilstrækkelige for maksimal adskillelse mellem sund plus godartet gruppe og scene I + II eller alle faser (I-IV) (fig. 4). De kombinerede grupper af raske og godartede patienter blev testet af ROC-analyse versus total og scene I + I eller fase III + IV ovariecancer grupper ved at estimere en blanding mellem fig. 3A-C og 3D-F resultater. Faktisk AUC test for signifikante forskelle mellem CA125 og de tre-biomarkør panel viser ingen forskel versus trin III + IV og klare, men beskedne væsentlige forskelle i forhold den samlede (P = 0,012) og trin I + II ovariecancer (P = 0,014) .

ROC kurver for CA125 alene, og tre-biomarkør panel: (A) raske kontrolpersoner plus godartede patienter versus patienter med kræft i æggestokkene. (P = 0,012); (B) raske kontrolpersoner plus godartede patienter versus patienter med trin I til II ovariecancer (P = 0,014); (C) raske kontrolpersoner plus godartede patienter versus patienter med trin III til IV ovariecancer (P = 0,52).

Validering

For at bekræfte, om denne kombination er den højeste nøjagtighed multivariate klassificering algoritmer, vi brugte to-biomarkør paneler (CA125 plus transthyretin, CA125 plus apolipoprotein A1, og transthyretin plus apolipoprotein A1). Den samlede sensitivitet og specificitet af disse to-biomarkør paneler blev ikke forbedret til at skelne mellem ovariecancer og raske individer sammenlignet med tre-biomarkør panel i ROC-kurven (fig. 5A-C), hvilket antyder, at de tre-biomarkør panel viste den højeste nøjagtighed, mens de to-biomarkør paneler viste lignende tendenser med tre-biomarkør panel mellem en ondartet gruppe og dens godartede sygdomsgruppe (fig. 5D-F). Og de tre-biomarkør panel var tilstrækkeligt for maksimal adskillelse mellem sund plus godartet gruppe og scene I + II eller alle faser (I-IV) (Figur S1).

ROC kurver for CA125 alene, to og tre -biomarker paneler: (A) raske kontrolpersoner versus patienter med ovariecancer; (B) raske kontrolpersoner versus patienter med trin I til II ovariecancer; (C) raske kontrolpersoner versus patienter med trin III til IV ovariecancer; (D) godartede patienter versus patienter med kræft i æggestokkene; (E) godartede patienter versus patienter med trin I til II ovariecancer; (F) godartede patienter versus patienter med trin III til IV ovariecancer.

Start med en befolkning på æggestokkene kræftpatienter, stratificeret simpel tilfældig udvælgelse uden tilbagelægning blev brugt. Til validering, 50% af disse patienter skulle bruges som et træningssæt at fastslå fordelen ved kombinationen af ​​disse markører til diagnosticering af ovariecancer. Resten af ​​patienterne tjente som valideringssættet til uafhængig validering nytten af ​​denne biomarkør. Uddannelse og validering sæt var meget ens med hensyn til patientens karakteristika. I træningssættet, generel sensitivitet og specificitet af de tre-biomarkør panel viste den højeste nøjagtighed, mens de to-biomarkør paneler viste mindre følsomme tendenser end de tre-biomarkør panel i ROC-kurve (figur S2, S3, S4). I valideringen sæt, tre-biomarkør panel viste den højeste nøjagtighed (figur S5, S6, S7).

For at se, om denne kombination giver den højeste klassifikation magten i algoritmer multivariate klassificering, brugte vi fire-biomarkør panel (CA125 plus transthyretin plus apolipoprotein A1 plus hæmoglobin). Den overordnede sensitivitet og specificitet af disse fire-biomarkør panel blev ikke forbedret for at skelne mellem kræft i æggestokkene og raske individer (og /eller godartet gruppe) sammenlignet med de tre-biomarkør panel i ROC-kurve (Figur S8-S9), tyder på, at de tre-biomarkør panel er tilstrækkelig for maksimal adskillelse mellem sunde (og /eller godartet gruppe) og trin i + II eller alle trin (i-IV). Tilsammen kunne de tre-biomarkør panel være en stærk biomarkør til diagnosticering af kræft i æggestokkene.

Diskussion

Konventionelle æggestokkene kræft screening-værktøjer er ineffektive for den almindelige befolkning [3]. Den mest undersøgte markør for ovariecancer, CA125, er et protein, der findes på niveauer i de fleste ovariecancerceller der er forhøjet i forhold til normale celler og en potentielt nyttig markør for diagnose og prognose efter behandling af ovariecancer, men CA125 udtrykkes i kun 50-60% af patienter med tidlige fase sygdom, og er også ofte forhøjet hos kvinder med godartede ovarie sygdomme [20] – [22]. På grund af de sårbare punkter i CA125 som biomarkør for ovariecancer [23], der kombinerer en eller flere andre tumormarkører med CA125 kan forbedre følsomheden og specificiteten af ​​diagnosen af ​​ovariecancere eller tidligere påvisning af sådanne cancere [9]. Således har været udsendt en betydelig indsats for at få et minimum Positiv prædiktiv værdi (PPV) på 10% og en specificitet på mere end 99% som en effektiv ovariecancer screeningstest [24], [25]. I 2009 blev en klinisk test (OVA1) godkendt af FDA. Testen var baseret på estimering af indholdet af fem proteiner (transthyretin, apolipoprotein A1, transferrin, beta-2-mikroglobulin, og cancerantigen 125) i blodet, som derefter blev kombineret til et enkelt score, der spænder fra 0 til 10, under anvendelse af en unik algoritme (OvaCalc). Mens der ikke findes publicerede undersøgelser for OVA1 [26], blev det rapporteret, at OvaCalc algoritmen præstation viste 92,5% følsomhed, 43,0% specificitet, 41,9% positiv prædiktiv værdi, og 92,9% negativ prædiktiv værdi. Og blandt de 96 patienter diagnosticeret med epitelial ovariecancer, OvaCalc udpeget alle undtagen 1 som høj risiko. Men det blev ikke rapporteret, hvor mange kvinder med godartede ovarie betingelser var forkert kategoriseret som høj risiko for malignitet, men dette antal formodes at være betydelige. Ud over i øjeblikket utilstrækkelig evidens (fx utilstrækkelig offentliggjort beviser), testen er ikke godkendt som en screening for tidlige fase kræft i æggestokkene og kan føre til større mængder af falsk-positive resultater som et screeningsværktøj [26]. Således er der behov for yderligere undersøgelser for at forbedre specificitet og følsomhed af de kombinerede biomarkører i både retrospektive og prospektive kliniske undersøgelser som en screeningsværktøj. Nogle af testresultaterne er blevet offentliggjort [23]. Men til dato ingen screeningstest har opnået tilstrækkelig ydelsesegenskaber, der skal anvendes som et værdifuldt værktøj til påvisning af tidlige stadium ovariecancer. I denne undersøgelse evaluerede vi en ny kombination af tre kendte biomarkører for ovariecancer, CA125, transthyretin og apolipoprotein A1, i et forsøg på at forbedre følsomheden af ​​CA125, der viser, at transthyretin og apolipoprotein A1 blev forhøjet følsomhed og specificitet CA125 i tidligt stadium ovariecancer. Mens transthyretin og apolipoprotein A1 er blevet brugt flere gange som potentielle biomarkører for kræft i æggestokkene [23], [27], den tre-biomarkør panel blev nyligt evalueret ved hjælp af vores koreanske befolkning. Endvidere denne undersøgelse præsenteres effektivt validering af anvendelsen af ​​en multiplex flydende assay system til samtidig påvisning af flere biomarkører til diagnosticering af ovariecancer. Cutoff 35 U /ml for CA125 vi bruges er generelt accepteret som normal [28].

Transthyretin er blevet brugt som en biomarkør for malnutritional status og inflammation, akutte og kroniske sygdomme, men posttranslationelle modificerede former har også rapporteret som en del af en biomarkør panel til tidlig opdagelse af ovariecancer [29] – [31]. Serumniveau fuldlængde transthyretin blev nedreguleret blandt patienter med senere stadium ovariecancer forhold til det i raske kontroller og patienter med colorectal, bryst, eller prostatacancer. Det blev konstateret, at svarende til toppen ved m /z 12,8 kD, en trunkeret form af transthyretin viste en mangel på de N-terminale ti aminosyrer. Foruden mutationer på proteinniveau, eksisterer TTR i forskellige isoformer [32]. For nylig blev en trunkeret variant af transthyretin sammen med apolipoprotein A1 og en bindevæv aktiverende protein III beskrives som en effektiv panel af nye biomarkører til detektering tidligt stadium epitelial ovariecancer hos kvinder [23].

Apolipoprotein A1 er større proteinbestanddel af højdensitets lipoprotein (HDL) i plasma [33]. Det blev vist, at koncentrationen apolipoprotein A1 i blodet er reduceret i forskellige typer af cancer [34]. Apolipoprotein A1 er blevet identificeret som en potentiel biomarkør for ovariecancer, kolorektal cancer, kronisk obstruktiv lungesygdom og kræft i bugspytkirtlen [29], [35], [36]. Der blev imidlertid også rapporteret kontroversielle bemærkninger herunder opregulering af apolipoprotein A1 i en række forskellige maligne tumorer i æggestokkene, leveren, bryst [37]. For nylig blev apolipoprotein A1 vist at forøge følsomheden af ​​CA125 til detektering tidligt stadium epitelovariecancer og foreslog et lovende terapeutisk middel til behandling af ovariecancer [23], [38].

Men når de anvendes enkeltvis , de undersøgte her markører ikke overgå CA125 i deres følsomhed og særlige ved diagnosticering af kræft i æggestokkene. Ved at kombinere de enkelte markører er blevet forsøgt af andre forskere som en strategi for at øge den samlede ovariecancer opdagelse sats [23], [39] – [41]. Her har vi anvendt en kombination af de to serum markører med CA125, og sammenlignede følsomheder og særlige mellem tre-markør panel og hver markør alene. Resultater fra ROC-kurve analyse viser, at kombinere tre biomarkører havde en meget forbedret følsomhed forhold til den for hver biomarkør alene. De tre-biomarkør panel klassificeret tidlige fase kræftformer med 93,9% følsomhed og sen-fase kræftformer med 96,5% sensitivitet ved 95% specificitet. Vi tilføjede også hæmoglobin, en af ​​vores serum biomarkører offentliggjort for nylig [42], i panelet for at bekræfte, om denne kombination giver den højeste klassifikation magt. Men, har fire-biomarkør panel (CA125 plus transthyretin plus apolipoprotein A1 plus hæmoglobin) ikke forbedre den overordnede sensitivitet og specificitet til at skelne mellem kræft i æggestokkene og raske individer (og /eller godartet gruppe) sammenlignet med de tre-biomarkør panel i ROC-kurve. Således, uanset hæmoglobin, de tre-biomarkør panel var tilstrækkeligt for maksimal adskillelse mellem noncancer (sunde plus godartet gruppe) og trin I + II eller alle trin (I-IV) på sygdom. Følsomheden og specificiteten af ​​dette panel for trin I + II kan sammenlignes med resultater med en fire-biomarkør panel udvalgt fra 96 ​​ansøgerlande antigener målt ved immunoassays med multiplex teknikker [43]. Deres panel af biomarkører klassificeret korrekt 67% af godartede læsioner som noncancer. En anden undersøgelse viste den kliniske anvendelighed af en CA125 /HE4 kombineret test for diskriminering af benigne og maligne æggestokkene masserne med 76,4% sensitivitet ved 95% specificitet [44]. Den høje specificitet og tilsvarende stigninger i følsomhed for de tre-biomarkør panel har merit i æggestokkene kræftscreening forsøg. Det blev imidlertid rapporteret, at for den almindelige befolkning, PPV af en 6-markør panel (leptin, prolactin, OPN, IGF-II, MIF, CA-125) målt ved en multiplex bead-baseret immunoassay system ville være 6,5% , hvilket indikerer, at 14 ud af 15 kvinder med et positivt testresultat ville opleve falsk-positive testresultater [45].

der er flere begrænsninger, der skal behandles vedrørende nærværende undersøgelse. Først kunne en klarere beskrivelse af befolkningen, såsom alder og race distribution, ernæringstilstand, tilstedeværelse af peritoneal carcinomatose og ascites, tilstedeværelse af infektion sygdom, udelukkelse af autoimmun sygdom eller anden maligniteter (såsom metastatiske ovariecancer fra gastrointestinale system) være meget vigtigt til vurdering af biomarkør niveauer [46] – [49]. For det andet bør naturlige variation af visse markører og individuel biologisk variation over tid også betragtes som den tilknyttede variabilitet kunne inducere en række assay målefejl ved falsk-positive resultater [50], [51]. For eksempel er den iboende intraindividuelle biologiske variation i CA125 var større i præmenopausale end hos postmenopausale kvinder [52]. Og selv i en multi-center case-kontrol undersøgelse, kan der være biomarkør koncentration forskelle. En 4 markør-panel (apolipoprotein A1 + transthyretin + inter-α-trypsininhibitor IV + CA125), for eksempel, udviste koncentrationsforskelle mellem biomarkører sæt og uafhængig validering sæt [17]. Det er blevet accepteret, at der kan være demografiske og epidemiologiske forskelle, og prøve behandling protokoller forskelle mellem sygehuse, hvilket fører til forskellige resultater. Således er der behov for en model til estimering analytiske og biologiske komponenter variation af markører.