PLoS ONE: Behavioral, medicinsk billedbehandling og Histopatologiske funktioner i en ny Rat Model of Bone Cancer Pain

Abstrakte

Prækliniske knoglekræft smerte modeller efterligner den menneskelige tilstand er forpligtet til at reagere på de kliniske virkelighed. Bryst- eller prostatacancer patienter klare med knoglemetastaser oplever intraktabel smerte, som påvirker deres livskvalitet. Avanceret overvågning er således forpligtet til at afklare knogle kræft smertemekanismer og forfine behandlinger. I vores model af rotte-femorale brystcarcinom MRMT-1 celleimplantation blev smerte indtræden og tumorvækst overvåges i 21 dage. Den kirurgiske procedure udføres uden arthrotomi tilladt registrering af tilfældige smerter i fri bevægelse rotter. Sammen med den gradvise udvikling af mekanisk allodyni og hyperalgesi, blev påvist adfærdsmæssige tegn på ambulant smerte på dag 14 ved anvendelse af en dynamisk vægtbærende apparat. Osteopenia blev afsløret fra dag 14 samtidig med forvaltningsmæssigt af trabekulære arkitektur (μCT). Knoglemetastaser blev visualiseret så tidligt som dag 8 ved MRI (T

1-Gd-DTPA) før smerte afsløring. PET (Na

18F) co-registrering afslørede intraossøse aktivitet, som bestemt af anatomiske overlejring i MRI efter osteoklastisk hyperaktivitet (TRAP farvning). Smerter og knoglenedbrydning blev forværret med tiden. Knogleremodellering blev ledsaget af c-Fos (spinal) og ATF3 (DRG) neuronal aktivering, opretholdt af astrocyt (GFAP) og mikroglia (Iba1) reaktivitet i lumbale rygmarv. Vores dyremodel viser betydningen af ​​samtidig optage smerte og tumor progression og vil give os mulighed for bedre at karakterisere terapeutiske strategier i fremtiden

Henvisning:. Doré-savard L, Otis V, Belleville K, Lemire M, Archambault M , Tremblay L, et al. (2010) adfærdsmæssige, medicinsk billedbehandling og Histopatologiske funktioner i en ny Rat Model of Bone Cancer Pain. PLoS ONE 5 (10): e13774. doi: 10,1371 /journal.pone.0013774

Redaktør: Pedro R. Lowenstein, Cedars-Sinai Medical Center og University of California Los Angeles, USA

Modtaget: 5 feb 2010 ; Accepteret: 11 oktober 2010; Udgivet: 29 Oktober 2010

Copyright: © 2010 Doré-Savard et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af tilskud fra Cancer Research Society (PS) og fra CIHR /Rx D forskningssamarbejde program i partnerskab med den canadiske Pain Society, AstraZeneca Inc., CIHR Institute of Aging, CIHR Institut for Muskuloskeletal Sundhed og Gigt, CIHR Institute af Neurovidenskab, mental sundhed og Narkotikamisbrug (PS) og The Quebec Bio-Imaging Network. L.D.-S. holder CIHR Frederick Banting og Charles Best, FRSQ, canadiske Arthritis Netværk og RSBO stipendier. PS er en CIHR ny investigator. L.G. er en FRSQ Junior 1- ny investigator. P.S., M.L., L.G. og R. L. er medlemmer af FRSQ-finansierede Centre de Recherche Clinique Etienne-Le Bel. PS og L.G er medlemmer af Quebec Pain Research Network, M.L. og R. L. er medlemmer af Quebec Bio-Imaging Network. M.L. er Canada Research Chair i Magnetic Resonance Imaging. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Astra-Zeneca Inc. forudsat midler gennem en canadisk Pain Society program. Eksperimenterne ikke indebar nogen Astra-Zeneca produkt eller sammensatte heller ikke Astra-Zeneca spille en rolle i valget af awardees. Ingen af ​​forfatterne er medarbejdere eller ejere af Astra-Zeneca. Derfor ikke denne kommercielle bidragyder ikke ændre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker vedrørende datadeling og materialer som detaljeret online af vejledningen for forfattere.

Introduktion

Blandt kræft med en dårlig prognose , der stammer fra bryst-, lunge- og prostata almindeligvis metastaserer til skelettet [1], [2]. Mens primær knoglecancere er sjældne, over 70% af mennesker håndtere fremskreden bryst- eller prostatacancer vil udvikle knoglemetastaser [3]. Den vigtigste faktor er ansvarlig for faldet i livskvaliteten i knoglemetastaser bærende patienter er smerte [4].

Bone kræft smerter stammer fra nerve kompression, iskæmi og frigivelse af proinflammatoriske stoffer ved tumoren og celler fra knogle miljøet [5]. Således lytiske kræftceller påvirker knogle homeostase gennem frigivelse af cytokiner, der fremmer patologisk resorption af osteoklaster [6], [7]. Foruden knoglenedbrydning [8], osteoklast hyperaktivitet skaber et surt miljø ansvarligt for indkvartering af smerte [9]. Compensative og anarkistisk knogledannelse ved osteoblaster komprimerer fri nerveterminal endelser spredt i knoglemarven, matrix og periosteum [10], hvilket fører til skabelsen og vedligeholdelsen af ​​smerte. Foreningen af ​​disse fænomener producerer en unik mekanisk og neurokemiske debut, der går ud over kombinationen af ​​neuropatisk og inflammatorisk smerte [11].

Bone kræft smerter unikke egenskaber gør det terapeutisk umedgørlig [11]. Faktisk har typiske tilgange, herunder anti-inflammatoriske lægemidler og opiater begrænset lindring effektivitet [12]. På grund af sin progressive karakter, der eskalerende doser forpligtet til i tilstrækkelig grad lindre knoglekræft smerte [13], hvilket fører til bivirkninger og i sidste ende til forfejlede overholdelse [4], [14]. Endvidere morfin blev for nylig vist sig at accelerere kræft-induceret knogletab hos osteolytiske cancere [15], [16]. Ligeledes lovende antiresorptive bisfosfonat behandlinger [17], [18], [19], [20], [21], vist sig at bremse kræft progression og indirekte lindre smerter, blev nedtonet af komorbide osteonekrose [22]. Bone kræft smerte er således fortsat en bekymring, hvilket understreger behovet for at fremhæve vores forståelse af sine neurobiologiske mekanismer for at udvikle mere effektive strategier.

Animal modeller blev udarbejdet for at efterligne den menneskelige tilstand i et forsøg på at forstå knoglekræft smerte . Musemodeller for calcaneus og humerus kræft [23], eller rotte modeller af skinneben kræft med bryst-MRMT-1 [24], 4T.1 [25] og Walker 256 [26], eller prostata AT-3.1 [27] celler blev udviklet at karakterisere lokale ændringer eller neural plasticitet spinal strukturer rager til benet. Fra et klinisk synspunkt, lårben, dog er den hyppigst påvirket lang knogle [28]. Mus femorale modeller involverer intramedullære implantation af fibroblast cancercellelinier at inducere smerte rapporteres (fx fibrosarkom [29], [30]). Men disse modeller baseret på at efterligne primære knogle kræft. Størstedelen af ​​sekundære knoglecancere stammer fra bryst- eller prostatakræft, kendt for deres knogle-metastaserende egenskaber [31]. Men for modeller, der involverer de typer af celler, induktion er enten intravenøs (fører til flere websted metastaser [32], [33]), eller følger en kirurgisk procedure, hvor en patellar arthrotomia og delvis ændring af knæleddet er modtagelige for nedsat bevægelsesevne , som igen forspænder evalueringen af ​​smerte-relateret adfærd. Faktisk invasionsevne og kirurgiske procedurer skal forblive minimal for at vurdere gennembrudssmerter uden indblanding. Sidstnævnte smerte manifestation er den mest refraktære betingelse for at overvinde for personer coping med kroniske cancersmerter og blandt de hårdeste at vurdere i dyremodeller.

Ud over smerte vurdering, midler til at opdage og overvåge knogle patologier har udviklet sig at inkorporere X-ray micro-beregnet tomografi (μCT) og knogle scintigrafi [34]. Ikke desto mindre, forebyggende bestemmelse af tumor rugende og progression har potentiale til at forbedre smertestillende doseringer og begrænse knogle remodellering. Avanceret ikke-invasiv og lav stråling medicinsk billeddannelse, såsom positronemissionstomografi (PET) og magnetisk resonans billeddannelse (MRI) eller kombinationen af ​​begge ville være ønskeligt, at effektive og gentagne prøver for nøjagtige og strenge analgetiske terapi justeringer [35] .

rotten er fortsat de mest undersøgte arter i smerte paradigmer [36]. Vi har derfor valgt en rotte brystcarcinom cellelinie for sine spontant metastaserende og transplanterbare egenskaber. Evnen til MRMT-1 til metastaserer til fjerntliggende organer er uløseligt forbundet med disse syngene celler [37]. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi en intervention i Sprague-Dawley rotte femur at implantere brysttumorceller hjælp af en lys kirurgisk procedure i et forsøg på at efterligne den kliniske smerter. Vi udnyttet en kombination af innovative adfærdsmæssige og medicinsk billedteknik, støttet af immunhistokemiske og patologiske observationer, at karakterisere modellen. Formålet med undersøgelsen er at forbedre klinisk relevans med hensyn til model og værktøjer, der anvendes til at screene nye blyforbindelser, for at karakterisere knogle tumor progression samt at belyse de mekanismer, der ligger til grund tilblivelsen og vedligeholdelsen af ​​smerte knoglekræft.

Metoder

Cell kultur

Mammary rotte metastase tumor (MRMT-1) celler (carcinoma) blev venligt leveret af Cell Resource center for Biomedical Research Institute of Development, Aging og Kræft (Tohoku Universitet 4-1, Seiryo, Aoba-ku, Sendai, Japan) og høstet i RPMI 1640 medium (Gibco, Montreal, Quebec, Canada) suppleret med 10% føtalt bovint serum (varmeinaktiveret) og 2% penicillin /streptavidin (Gibco, Montreal, QC, Canada). Celler blev løsnet ved kort eksponering til 0,25% vægt /volumen trypsin-EDTA (Gibco, Montreal, QC, Canada) og parat til injektion. Kort fortalt blev cellerne pelleteret ved centrifugering, skyllet med 1 ml Hanks balancerede saltopløsning fritaget af calcium, magnesium eller phenol (HBSS; Gibco, Montreal, QC, Canada) (3 minutter ved 200 x g.) Og yderligere centrifugeret på samme betingelser. Pelleten blev resuspenderet i 1 ml HBSS, og cellerne blev talt med et hæmocytometer. Cellerne blev fortyndet for at opnå en endelig koncentration til injektion af 30000 celler i 20 pi og vedligeholdes på is før operation

Dyr

Voksne Sprague-Dawley (200-225 g;. Charles River Laboratories, St.-Constant, Quebec, Canada) blev holdt i en 12 timers lys /mørke cyklus med adgang til mad og vand

ad libitum

. Animal-relaterede procedurer blev godkendt af Etisk Komité for Animal Care og eksperimenter af Université de Sherbrooke og udføres i henhold til reglerne i den canadiske Rådet om Animal Care (CCAC). Rotter blev akklimatiseret i 4 dage til dyret facilitet og i 2 dage til manipulationer og implantaterne inden adfærdsmæssige undersøgelser. Bemærk, at testet for svie og anvendes til immunhistokemiske analyser dyr var forskellige fra dem, der afbildes ved MRI eller MR-PET, da langvarig anæstesi kan påvirke adfærdsmæssige reaktioner.

Kirurgi

Efter fuldstændig anæstesi med 5 % isofluran (Abbott Laboratories, Montreal, QC, Canada) blev rotter lagt i rygleje og deres højre poter blev barberet og desinficeret med 70% v /v ethanol. Anæstesi blev opretholdt med 2,5% isofluran og rotte øjne var beskyttet med en oftalmisk væske gel (Tear-gel, Novartis, Mississauga, ON). En minimal hud incision (8-10 mm) udsættes de

quadriceps femoris

.

vastus lateralis

blev indridset (5-8 mm i længden) for at eksponere den femorale epicondyle, mens patellar ligament forblev uberørt og minimal skade blev påført til de omkringliggende muskler og blodkar. Ved hjælp af en 0,8 A stereotaktisk boremaskine (Foredom, Bethel, CT, USA) forbundet til et 1,75 mm carbid stål grat (Stoelting Co., Wooddale, IL, USA) blev en lille og overfladisk hulrum snurrede mellem den mediale epicondylus og adductor tuberkelbakterier (ca. 1 mm i dybden). I denne hulhed, blev en 25-gauge nål indsat i en 45 ° vinkel, så den kan nå den intramedullære kanal af femur. Nålen blev erstattet med en stump-ende 25-gauge nål forbundet til en 50 pi Hamilton-sprøjte indeholdende 20 pi af cellesuspensionen (cancer gruppe) eller HBSS (sham-gruppen). Sprøjten blev efterladt på plads i 1 minut for at tillade celle dispersion i knoglemarven. Nålen blev derefter fjernet og kaviteten blev forseglet med dental amalgam (Prodigy A3, Kerr, Orange, CA) og polymeriseres med en hærdende lys (QHL75, Dentsply, Milford, DE). Stedet blev grundigt vasket med sterilt deioniseret vand. Musklen og bindevæv blev lukket med diskontinuert sutur fremstillet med syntetiske absorberbare suturer (Monocryl, Ethicon, Sommerville, NJ), og huden blev lukket med en kontinuert sutur fra ikke-absorberbare kirurgiske sutur (prolene, Ethicon, Sommerville, NJ ). Såret blev til sidst vasket med 3% v /v peroxid og sprøjtet med en bitter løsning (Aventix Dyresundhed, Flamborough, ON).

Adfærdsmæssige undersøgelser

Mekanisk allodyni

blev vurderet ved anvendelse af en dynamisk plantar esthesiometer (Ugo Basile, Stoelting, IL, USA), en automatiseret version af von Frey hår. Dyrene blev placeret i indhegninger på en forhøjet trådnet og reaktioner på punktformet mekanisk stimulering blev vurderet ved hjælp af esthesiometer. En lige metaltråd (0,5 mm diameter) blev orienteret under puden, indtil den rørte plantare overflade af bagpoten og begyndte at udøve en opadgående kraft. Den nødvendige kraft til at fremkalde en tilbagetrækning respons blev målt i gram og registreret automatisk, når poten blev trukket tilbage, eller den forudindstillede cut-off blev nået (50 g). Fem værdier blev taget skiftevis på begge ipsilaterale (opererede side) og kontralaterale bagpoter med intervaller på 15 s.

Mekaniske nociceptive tilbagetrækning responser

blev målt med analgesiameter (Ugo Basile, Stoelting, IL , USA), som anvender en lineært stigende tryk (16 g /s) via en acryl stylus. Pennen blev placeret over den mediale dorsum af bagpote, mellem 1. og 2. mellem tarsus og metatarsus og gennemsnittet af fire på hinanden følgende foranstaltninger begynder med venstre eller højre bagpote, skiftevis, blev registreret som tærsklen tilbagetrækning i gram. Cut-off var sat til 200 g. Sammenligning for hver test dag blev udført ved at fratrække ipsilaterale vægt (g) fra den kontralaterale vægt værdi (g) for at bestemme tærsklen pote tilbagetrækning (PWT) forskel.

Statisk vægtbærende

var målt ved hjælp af Incapacitance Meter (IITC Life Science, Woodland Hills, CA, USA). Dyret blev placeret med bagbenene i hvile på de to vægt-gennemsnitsperioder platform pads. Enheden registreres den gennemsnitlige vægt lagt på hver pude over en 2 sekunders interval. Målingen blev gentaget 3 gange. De opnåede med incapacitance måleren resultater blev anvendt som en kontrol for en anden vægtbærende test, Dynamic vægtbærende test (Bioseb, Boulogne, Frankrig). Indretningen bestod af et bundløst plexiglas kabinet (25 × 25 × 24 cm

3) og en sensor (1936 single bortførere). Sensoren blev anbragt på gulvet af kabinettet, der dækker hele overfladen. Rotten fik lov til at bevæge sig frit i apparatet i 5 min og vægtbærende oplysninger blev transmitteret direkte til en bærbar computer via et USB-interface. De rå data blev analyseret med DWB 1.1.0.6 software (Bioseb). En pote blev detekteret, når en captor indspillet en vægt på mindst 4 g og mindst 2 tilstødende fangevogtere indspillet en vægt på mindst 1 g. Poten skulle være stabil i mindst 0,5 s, der skal medtages. Ved hjælp af en synkroniseret video-optagelse af testen og den skalerede kort over de fundne zoner blev hver formodet pote valideret af en observatør og identificeret som en venstre eller højre og forgrunden eller bagpote. Andre zoner opdaget, der repræsenterer halen eller en anden kropsdel, blev også inkluderet i analysen.

Effekten af ​​subkutan morfin

blev evalueret på dagen 11, 14, 18 og 21 i vores model . Morfin-sulfat-stamopløsning (50 mg /ml) blev fortyndet i sterilt saltvand til opnåelse injektionskoncentration (3 mg /ml). Rotter blev end injiceret s.c. med 3 mg /kg (1 pl /g) og vendte tilbage til deres bur. Adfærdsmæssige forsøg blev udført 30 minutter efter injektionen, som beskrevet tidligere.

Immunhistokemi

Rotter blev dybt bedøvet med 5% isofluran og transcardialt perfunderet med 4% paraformaldehyd (PFA) i phosphatpuffer (0,1 M , pH 7,4). Rygmarv og dorsalrodsganglier (DRG) blev post-fikseret i 30 minutter i 4% paraformaldehyd og derefter overført til 30% saccharose (48 h) for kryobeskyttelse. Serielle frosne rygmarv sektioner, 35 um tykke, blev skåret under anvendelse af en glidende mikrotom, opsamlet i PBS og behandles som fritflydende sektioner. Frosne DRG blev indlejret i OCT Tissue-Tek, skåret på en kryostat ved en tykkelse på 12 um, indsamles og behandles på objektglas.

Vævssnit blev inkuberet i 60 minutter ved stuetemperatur i en blokeringsopløsning på 5% normalt gedeserum i PBS med 0,5% Triton X-100 og 2% albumin og derefter inkuberet i 30 minutter i 0,1 M glycin-opløsning for at reducere autofluorescens. Snittene blev derefter inkuberet med det primære antiserum natten over ved 4 ° C. Rygmarv snit blev immunfarvet med antistoffer mod markører af mikroglia, ioniseret calcium bindende adaptormolekyle 1 (Iba1, polyklonale antistof kanin-anti-Iba1, 1:1000, Wako, Richmond, VA, USA), astrocytter, glial fibrillært surt protein (GFAP, monoklonalt klon GA5 muse-anti-GFAP, 1:500, Sigma, Oakville, Ontario, Canada) og c-Fos protein (c-Fos, polyklonalt kanin-anti-Fos, 1:20 000, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) og i DRG mod aktiverende transskriptionsfaktor 3 (ATF-3 (C-19), polyklonalt kanin-anti-ATF-3, 1:500, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA). Efter inkubation blev vævssnit vasket to gange i 10 minutter i PBS og inkuberet i det sekundære antistof opløsning i 2 timer ved stuetemperatur. Sekundære antistoffer konjugeret til fluorescerende markører Alexa Fluor® 488 og Alexa Fluor 647® blev anvendt ved 1:500 (Invitrogen Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Snit blev derefter monteret med Aquamount. Fraværet af krydsreaktivitet blandt de sekundære antistoffer blev verificeret ved at udelade primært antistof under inkubation natten over.

Fos protein og ATF-3 faktor blev også påvist ved immunhistokemi under anvendelse af avidin-biotin-peroxidase metode. DRG dias og rygmarv sektioner blev behandlet med 0,5% hydrogenperoxid i 30 min for at inhibere endogen peroxidaseaktivitet og inkuberet i 30 min i en blokeringsopløsning på 5% normalt gedeserum, 2% albumin, og 0,5% Triton X-100 i PBS. Snittene blev derefter inkuberet natten over ved 4 ° C i den primære c-Fos (rygmarv) og ATF-3 (DRG) antistoffer, som blev fortyndet i 1% NGS med 0,1% Triton X-100. Efter inkubering blev snittene skyllet og blokeret med 3% NGS i 15 minutter og inkuberet i 2 timer i det sekundære antistof, biotinyleret gede-anti-kanin IgG (gede-anti-kanin-H + L, 1:500, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), efterfulgt af streptavidin-peberrodsperoxidase med avidin-biotin fremgangsmåde til 1 time (peberrodsperoxidase streptavidin, PK-6100, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) ved stuetemperatur. Snit blev derefter inkuberet i 3 minutter med 0,02% diaminobenzidin med 0,01% hydrogenperoxid, derefter dehydreret og dækglas med Permount® Mounting Media (SP15-500, Fisher Scientific, NY, USA).

Kvantificering

Brug et Olympus konfokal Imaging mikroskop og Olympus FluoView FV1000 software blev sektioner fra den lumbale rygmarv taget med identiske erhvervelse parametre (gain, eksponering tid) og analyseret ved konfokal mikroskopi at karakterisere immunofluorescens (IF). Epifluorescens og lyse-field billeder blev taget af en Leica DM4000 mikroskop udstyret med et Leica DFC350FX og en InfinityX kamera til immunfluorescens.

Fos-immunoreaktive kerner blev talt, når der har små, afrundede eller ægformede, mørk farvning, sammenlignet at kontrolere. Lag afgrænsning blev udført med en rotte rygmarv histo-arkitektur skabelon [38], i overensstemmelse med lumbal segment L1 /L2 /L3 af sektionen. I den foreliggende undersøgelse blev c-Fos-immunreaktive celler tælles som kombineret lag I-II, III-IV, V-VI, og VII-VIII henholdsvis. Otte 35-um rygmarv sektioner over L1 /L2 /L3 segment af hvert dyr (n = 3) blev tilfældigt udvalgt per dyr per betingelse for at bestemme total c-Fos nummer.

kvantificering af ATF-3 positive neuroner i DRG 12-um-tykke snit blev udført ved at tælle antallet af neuroner med ATF-3 immunreaktive kerner ved 20X forstørrelse, ved anvendelse af et Leica DFC350FX mikroskop. DRG svarende til de lumbale rygmarv niveauer L1 /L2 /L3 blev udvalgt som de vigtigste projektion steder af primære afferente fibre innerverer lårbenet [39], [40]. Optælling af ATF-3 positive celler blev udført én gang i tre serier, hver 36 um. Denne optælling blev udtrykt som gennemsnitlige antal ATF-3 immunoreaktive celler per sektion (n = 24). Sham og cancer dyr fra 3 uafhængige eksperimenter blev anvendt til ATF-3-bestemmelse.

Glial farvning for GFAP og Iba-1 i L1 /L2 /L3 rygmarv blev kvantitativt analyseret ved optisk tæthed med Image J softwareversion 1.6. Billede J blev først kalibreret med et billede fra en kontrol dyr efter kalibrere funktionen. Indstillingerne blev derefter bevares for alle efterfølgende analyser. Tre tilfældigt udvalgte sektioner af rygmarven L1-L3 i hvert dyr (n = 3) blev analyseret. De optiske tætheder af ni sektioner (tre sektioner /dyr) blev midlet til at give en gennemsnitlig tal for hver tilstand.

Radiologisk analyse

røntgenbilleder blev udført på dissekerede knogler ved hjælp af en Faxitron MX-20 ( Faxitron, Lincolnshire, IL). Billeder blev taget ved 26 kV, eksponeringstid: 10 s; Forstørrelse: 2X. Micro-computertomografi analyser blev udført på dissekerede lemmer af testede rotter med et 1072 MicroCT-system (SKYSCAN, Kontich, Belgien). Parametrene var: kilde: 80 kV, 124 uA; zoom: 20X; pixelstørrelse: 14,06 um; eksponeringstid: 3,0 s; rotation: 0,9 °. Bone Volumen /Total Volume (BV /TV) bestemmelse: kortikal + trabekulær knogle volumen (BV) divideret med enhver form for væv (TV) i intervallet 5626 mm svarende til 201 tværsnit (volumen af ​​interesse; VOI), startende fra væksten plade af den distale femur. Trabekulær BV /TV er defineret af knogletrabecula volumen divideret med TV fra VOI. Analyser blev udført med CT Analyser 1.10.0.1 (SKYSCAN, Kontich, Belgien).

Magnetic Resonance Imaging og positronemissionstomografi

MRI undersøgelser blev udført på

Centre d’imagerie moléculaire de Sherbrooke

med en 210 mm mindre dyr 7T scanner (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) og en 63 mm volumen RF-spole. Sprague-Dawley rotter blev placeret i den liggende stilling i en MR-kompatibel cradle udstyret med en hjemmebygget pote støtte designet til at positionere både lemmer stabilt og reproducerbart. Dyr blev bedøvet med 3% (induktion) og 1,5% (stabilisering) isofluran i oxygen. En feedback-kontrollerede dyr varm-luft varmelegeme system blev anvendt til at holde dyrets kropstemperatur ved fysiologiske niveauer og respirationsraten blev kontinuerligt overvåget (SA Instruments Inc., Stony Brook, NY, USA). MRI-protokollen omfattede købet af aksiale (sagittal) præ-kontrast og 10 minutter efter kontrast

T

1-vægtede billeder, ved hjælp af en gradient ekko sekvens med TR: 210 ms, TE: 3.35 ms , flip vinkel: 30 °, matrix: 256 × 256, FOV: 60 × 60 mm

2, NA: 8 (30 sagittale skiver), 1,5 mm tyk. En 600-pi bolus af kontrastmiddel (Gd-DPTA, Magnevist, Berlex) injiceret via halevenen. Dyr blev afbildet før og 6, 8, 10, 13, 15 og 18 dage efter implantation. Til bedømmelse tumorindtrængen, et område af interesse (ROI), herunder hele knogle cortex og medullær kanal af femur, blev defineret. Denne ROI gav en voxel intensitet histogram for begge bagpoter. De kontralaterale maksimale voxel intensiteter blev brugt til at fastsætte den patologiske tærskel. Hver ipsilaterale voxel resterende blev farvet i henhold til dens intensitet med en gul-rød skala. Mathlab Version 7.1 (Mathworks Inc., Natick, Massachusetts, USA) blev anvendt til at analysere data og udføre beregningerne.

positronemissionstomografi blev udført ved hjælp af LabPET4 Sherbrooke med Core Temperature Control. Ring diameter: 162 mm; FOV: 37.5 mm; Krystaller: 3072; Rumlig opløsning: 1,35 mm FWHM FOV; Støj-ækvivalent tæller: 37 kcps på 245 MBq (250-650 keV). Umiddelbart efter MR-scanninger, forblev dyrene under bedøvelse i samme stilling og vuggen blev overført til PET-scanner. Kollimatoren blev justeret til de hind knæleddene; 9,25 MBq Na

18F blev injiceret i.v. (200 pi ved 500 pl /min). Fordelingen af ​​radiotraceren blev overvåget i løbet af 30 minutter, og prøveudtagning dobbelt-volumen blev udført i 30 min. Vejrtrækning og kropstemperatur af dyret blev overvåget på alle tidspunkter under hele proceduren.

Histologisk analyse og måling af osteoklastaktivitet

Enogtyve dage efter tumor injektion, rotter blev aflivet og lårben blev fjernet . Lårben blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 72 timer, afkalket i 10% EDTA (pH 7,4) i 2-3 uger, og endelig indstøbt i paraffin. Paraffinblokke blev skåret i 3- eller 5 um-tykke snit med en mikrotom forsynet med en carbid klinge og skiver blev farvet med Harris ‘hæmatoxylin og eosin for at bestemme kræft celleinfiltration og knoglenedbrydning. At identificere aktiverede osteoklaster blev tartrat-resistent surt phosphat (TRAP) farvning udføres. Brug af leukocyt (TRAP) Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), blev skiverne udsættes for substratet i 1 time og farvning blev visualiseret med et Leica DM4000B (Leica, Toronto, ON, Canada). I alt blev 3,5 felter talt ved en forstørrelse på 250 gange for et samlet areal på 1 mm

2. Mærkede osteoklaster blev talt langs mineraliseret knogle-tumor eller knogle-knoglemarvsceller grænseflader og 4-7 skiver blev analyseret for hvert dyr, fra grupper på 4 dyr.

Statistiske analyser

Von Frey og DWB blev analyseret ved hjælp af en to-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-hoc test og Randall-sellitto blev analyseret med en Students

t

-test for sammenligning af kontraindikationer og ipsilaterale bagpoter for hver dag. C-fos, ATF-3 og Iba1 /GFAP tæller forskelle blev bestemt med et gentaget foranstaltning ANOVA efterfulgt af en Bonferroni multiple sammenligningstest. Normalitet blev evalueret med Kolmogorov-Smirnov og Shapiro-Wilks test. BV /TV grafer blev analyseret med en envejs ANOVA og TRAP tæller med en t-test. P ≤ 0,05 blev betragtet som den grad af statistisk signifikans.

Resultater

Implantation af mammacancer celler i lårbenet inducerer berøringsfølsom fremkaldte og ambulant smerte

I forsøget på at mimic klinisk knoglekræft smerte, udførte vi en lokal injektion af cellerne direkte i lårbenet mellem den mediale epicondylus og adductor tuberkelbakterier. Virkningen af ​​kirurgi blev minimeret ved implantation på dette anatomisk sted, hvilket reducerer chancerne for patellar ligament eller ledskader. Følgelig som vurderet af von Frey og dynamisk vægtbærende (DWB), viste sham dyr ingen tegn på mekanisk allodyni eller bevægelsesevne forringelse hele adfærdsmæssige testperioden (fig. 1A, C), selv i de tidlige dage efter det kirurgiske indgreb (data ikke vist). Kræft-bærende hanrotter podet med 30.000 MRMT-1 celler vises en nedsat tærskel tilbagetrækning i det dynamiske von Frey test fra dag 14 (36,7 ± 2,0 g; p 0,05;. Figur 1A). Efter dette, allodyni skred hurtigt indtil dag 21, da det var maksimal (23,3 ± 1,5 g, p 0,001). Cancerceller inokuleret i højre bagpote fremkaldte ikke mekanisk allodyni på den kontralaterale side (Fig. 1A). Samtidigt til allodyni, mekanisk hyperalgesi udviklet gradvist i tumor-bærende rotter. Som målt med Randall-Selitto test, blev der observeret en signifikant forskel mellem tærskler ipsilaterale og kontralaterale pote tilbagetrækning fra dag 18 (30,9 ± 10,8 g, s 0,001) til dag 21 (25,7 ± 7,6 g, p 0,01, Fig 1B. ). Disse resultater viser, at målbare touch-fremkaldte smerte adfærd udvikles efter injektion af carcinomceller i lårbenet, som tidligere demonstreret med MRMT-1 celleimplantation i skinnebenet [24]. Efter smerte afsløring på dag 14, havde subkutan administration af morfin (3 mg /kg) ikke vende mekanisk allodyni induceret af tumor progression i kræft-bærende rotter (figur S1).

(A) Allodyni blev bestemt ved anvendelse af von Frey test efter tumorimplantation. tærsklen Tilbagetrækningen mindskes gradvist fra dag 11 som svar på nociception overnatning i kræft-bærende dyr (n = 10). Den kontralaterale pote forbliver upåvirket, ligesom sham-behandlede ipsilaterale ben (n = 10). (B) Vurdering af hyperalgesi blev udført ved anvendelse af Randall-sellitto test. Resultater udtrykkes som tærskel pote tilbagetrækning (PWT) forskel mellem de ipsi- og contra-laterale bagpoter. Signifikant hyperalgesi blev observeret på dag 18 og 21 (n = 10). (C) Kvantificering af dynamiske vægtbærende i de implanterede dyr, udtrykt i procent af animalsk vægt. En væsentlig forskel i vægtfordelingen på hver pote observeres fra dag 15. (D) Dynamisk analyse af overfladen af ​​kontakt mellem bagpote og sensoren viser lignende resultater på dag 15, 18 og 21, når de ipsi- og kontralaterale poter er sammenlignet i cancerpatienter grupper (n = 7 i hver gruppe). Dataene er gennemsnit ± S.E.M, *: p ≤ 0,05; **: P≤0.01 ***:. P≤0.001

Limb ubehag blev først vurderet af statisk vægtbærende. Fra dag 15, var halvdelen af ​​den ipsilaterale vægt omfordelt til den kontralaterale pote (data ikke vist). For at evaluere en repræsentativ vægt omfordeling tværs af hele dyrets krop, uden tilbageholdenhed, udførte vi DWB vurderinger. Kinetikken for overførsel til bagpoterne svarede til dem observeret i statisk bærende, begyndende omkring dag 12 og stigende indtil dag 21 (fig. 1C). Det er dog bemærkelsesværdigt, at vægten kompensation hovedsagelig blev foretaget på andre end den kontralaterale bagpote kropsdele, såsom halen, bund maven eller forpoter. Faktisk på dag 21, blev ca. 50% af vægten bæres andetsteds end bagpoterne, sammenlignet med 33% før smerte indtræden (data ikke vist). Følgelig pote overflade i kontakt med gulvet var også signifikant påvirket fra dag 15 i sammenligning med den kontralaterale pote (fig. 1D). Disse smerte adfærd afspejler den kliniske observation af gennembrudssmerter, som opleves efter bevægelse tumor-bærende lemmer hos patienter knoglekræft.

Neuronal og glial plasticitet i kræft-bærende dyr

Metastase spredning i rotte femur inducerer neuronal aktivering og gliale ændringer i hele afferente fibre, der rager til L1-L3 spinal columna segmenter. Vi takker Drs.