PLoS ONE: Proton-pendulfart Lichen Compound Usnic Acid Påvirker mitokondrie og Lysosomal Funktion i Cancer Cells

Abstrakt

lichen sammensatte usnic syre (UA) er en lipofil svag syre, der fungerer som en proton shuttle og forårsager tab mitochondriel indre membran potentiale. I den aktuelle undersøgelse viser vi, at UA behandling inducerede dannelsen af ​​autophagosomes i humane cancerceller, men havde minimale virkninger på normale humane fibroblaster. Men autophagic flux var ufuldstændig, nedbrydning af autophagosomal indhold ikke forekomme, og forsuring var defekt. UA-behandlede celler viste reduceret ATP-niveauer og aktivering af AMP-kinase samt tegn på cellulær stress. UA er derfor sandsynligt, at udløse autophagosome dannelse både energi udtynding og stress betingelser. Vores resultater viser, at H

+ – shuttling effekt af UA opererer ikke kun i mitokondrier som tidligere vist, men også i lysosomer, og har betydning for terapeutisk manipulation af autofagi og pH-bestemt lægemiddel fordeling

. Henvisning: Bessadottir M, Egilsson M, Einarsdottir E, Magnusdottir IH, Ogmundsdottir MH, Omarsdottir S, et al. (2012) Proton-pendulfart Lichen Compound Usnic Acid Påvirker mitokondrie og Lysosomal Funktion i kræftceller. PLoS ONE 7 (12): e51296. doi: 10,1371 /journal.pone.0051296

Redaktør: Gabriele Multhoff, Technische Universitaet Muenchen, Tyskland

Modtaget: 18 juni 2012; Accepteret 31. oktober, 2012; Udgivet: December 5, 2012 |

Copyright: © 2012 Bessadottir et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Eimskip Doctoral fonden og Islands Universitet Research Fund (www.hi.is). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Laver, symbiosen mellem en fungal partner og en photobiotic mikroorganisme, der findes over hele verden og giver anledning til et stort antal unikke sekundære metabolitter [1]. Den dibenzofuran derivat, usnic acid (UA) er en kendt sekundær metabolit og er blevet undersøgt i en vis udstrækning [2]. En bred vifte af biologiske aktiviteter er blevet rapporteret for usnic syre, f.eks antimikrobielle, antivirale, antipyretiske, antiinflammatoriske og analgetiske virkninger [2]. Antitumoraktiviteten af ​​UA var først rapporteret tre årtier siden i lungecarcinom hos mus og i P388 leukæmi [3], [4]. Det er endvidere vist, at usnic syre har anti-mitotiske virkninger på humane cancercellelinier [5] og forårsager et tab af levedygtige celler i leukæmi, lunge- og brystcancerceller [6], [7]. Men eksponering for UA ikke aktivere p53 og er ikke blevet foreslået at være involveret i DNA-skader [8].

UA er en lipofil svag syre (p

K

en 4.4), der kan forårsage proton lækage ved at diffundere gennem mitokondriske membraner [9]. I muse leverceller usnic syre forstyrrer den normale metaboliske processer i celler ved frakobling oxidativ phosphorylering i mitokondrier og ved at aktivere oxidativ stress [10]. Mitokondrier spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​celledød veje og mitokondrie ændringer er blevet beskrevet i kræftceller, herunder øget stabilitet, og dermed hæmme frigivelsen af ​​cytochrom

c

og forhindre induktion af apoptose [11]. Vores tidligere undersøgelse viste, at UA behandling medfører tab af mitochondriemembranpotential i to forskellige cancer cellelinjer [12]. Interessant nok er det blevet vist, at ændringer i mitochondriemembranpotential kan føre til udbrud af autofagi [13].

Autophagy er en proces, der både kan støtte cancercelleoverlevelse under næringsstof mangel, men kan også fremme cancercelledød . De molekylære veje, der bestemmer denne dobbelte rolle er fortsat uklar, og det er sandsynligt, at funktionen af ​​autophagy i kræft afhænger af tumor scenen, cellulær kontekst og væv af oprindelse [14], [15]. Mere end 30 forskellige protein kodende gener, kendt som Autophagy-relaterede gener (ATG), er blevet identificeret og studier i musemodeller har vist, at macroautophagy er afgørende for opretholdelsen af ​​cellulær homeostase i mange væv [16], [17]. Autophagy kan udløses af ernæring udtømning eller metabolisk stress og kan variere afhængigt af efterspørgslen efter substrat nedbrydning og stimulus. De energi sensor AMP kinase signaler til pattedyr mål for rapamycin kompleks en (mTORC1), en vigtig regulator af autophagy, som direkte styrer proteinsyntese og anabolske processer i et næringsstof-følsom måde. Sult-induceret autophagic vesikler dannes, som sandsynligvis vil indeholde fri cytosol [18], [19]. Derudover kan andre stresstilstande, såsom beskadigede organeller intracellulære patogener eller stress i det endoplasmatiske reticulum inducerer autophagy gennem forskellige veje fra dem aktiveres ved sult [19]. Modningsprocessen, det sidste trin i autofagi, involverer levering og nedbrydning af autophagic last. Fusion forekommer med lysosomer, og autophagic vesikler smelter sammen og indholdet nedbrydes. Det sure miljø i lysosomer er afgørende for de endelige skridt i autophagy, og ved at forstyrre vacuolær H

+ ATPase, som er involveret i forsurende lysosomer, kan færdiggørelsen af ​​autofagi hæmmes [15], [19].

Formålet med denne undersøgelse var at udforske yderligere konsekvenserne af tab af mitokondrie membranpotentiale induceret af UA. Vi spurgte, om dette skyldes frigivelse af cytochrom

c

og udløste apoptose. Tab af membranpotentiale og ejendom UA til shuttle protoner over membraner ville forventes at føre til et fald i ATP-produktion af mitokondrier [9]. Vi fandt, at UA behandlede cancerceller var faldet ATP-niveauer og øget phosphorylering af AMP-kinase. Interessant, UA udløste autophagy men uden nedbrydning af autophagosomal indhold, hvilket tyder på en forstyrrende effekt på autophagolysosomal forsuring. Vores resultater viser, at induktion af autofagi blev medieret af en kombination af respons på næringsstof mangel samt cellulære stress.

(A) Niveauer af ATP, målt i et luminometer, blev reduceret i T47D-celler efter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer. Data er præsenteret som luminescens /celle for hver gruppe sammenlignet med DMSO-kontrol. Fejlsøjler indikerer standardafvigelser på middelværdien, * p 0,05. (B) Phosphorylering af AMP-kinase, verificeret ved Western blotting, blev påvist i T47D-celler efter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 og 48 timer

Materialer og Metoder.

plantemateriale, Cell Culture og Udsættelse for teststoffer

(+) – Usnic syre (97%) blev isoleret fra

Cladonia Arbuscula

(Wallr.) Rabenh. (Bægerlav-familien) indsamlet i åbent land i Island, ikke privatejede. Isolering og identifikation blev udført som beskrevet [12]. Stoffet blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO, Merck, 2951) og fortyndet til anvendelse i cellekultur-medium. Alle test omfattede kontroller hvor den højeste tilsvarende koncentration af DMSO blev anvendt. De brystcancercellelinier T47D og MCF7 og bugspytkirtelkræft cellelinje Capan-2 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATTC) gennem LGC Promochem. T47D indeholder en enkelt muteret kopi af p53 [20], men Capan-2 og MCF7 er homozygote for vildtype-p53 [21]. MCF7 er østrogenreceptor positivt [22]. Primære humane fibroblaster blev dyrket fra normal hud biopsier og anvendes i passage 6-13 (National bioetik Udvalg tilladelse VSNb2006020001 /03-16; informeret samtykke opnået). Alle cellelinier blev holdt i RPMI-1640 vævskulturmedium (GIBCO ™, 52400), indeholdende 0,5% penicillin og streptomycin (GIBCO ™, 15.140-148) og 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS, GIBCO ™, 10270) med T47D modtager yderligere 0,01 mg /ml insulin (Sigma, I1882) og videredyrket efter udsendelsen trypsin (0,25% trypsin /EDTA, Difco ™, 215.240) som passende. Celler blev podet på et passende antal overstiger 70-80% sammenflydning efter den 24.-timers kultur. (+) – Usnic syre (5 eller 10 ug /ml), metformin (10 mM; Sigma, D150959) og kontrol opløsningsmiddel blev tilsat, og cellerne blev inkuberet under standardbetingelser, i forskellige tidsrum. Til induktion af autophagy ved næringsberøvelse blev celler inkuberet med Hanks opløsning (Sigma, H9394) for de sidste 40 min af inkubationstid.

Induktion af autophagic vakuoler, med dobbelte membraner karakteristiske for autophagosomes, blev påvist ved elektronmikroskopi i T47D-celler efter behandling med UA (2,5 og 5,0 ug /ml, DMSO 0,1%) i 24 timer. Sorte pile angiver autophagic vakuoler, hvide pile angiver dobbelt membran formation.

(A) En stigning i LC3 puncta blev registreret, ved immunfluorescens i T47D og MCF7-celler efter behandling med UA (10 ug /ml) i 24 timer. Ingen effekt blev set i normale fibroblaster. Målestokken vist repræsenterer 20 um og gælder for alle paneler. (B) LC3 puncta per celle blev talt og kvantificeres ved ImageJ og data repræsenteret som LC3 puncta /celle for hver gruppe sammenlignet med DMSO-kontrol. Fejlsøjler indikerer standardafvigelser på middelværdien, * p 0,05, ** p 0,001. (C) Stigning i LC3 I og LC3 II, verificeret af Western blotting, blev påvist i T47D-celler efter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer

estimering af. niveauer af ATP

Celler blev løsnet ved trypsinbehandling, en lille portion fjernet til optælling og høstet ved anvendelse af 0,5 M perchlorsyre (Merck, 1,00519) i 10 minutter ved 4 ° C. Efter centrifugering 10 pi af supernatanten blev blandet med 1 ml destilleret vand. Bioluminescens blev analyseret under anvendelse 75 pi luciferase-reagens (Promega, FF2021), der lyserede cellerne og forudsat substratet luciferin. Luminescens blev målt i et luminometer (Turner TD 20/20) og udtrykt som luminescens /celle.

(A) nr nedbrydning af P62 blev detekteret ved Western blotting, i T47D og MCF7-celler efter behandling med UA ( 5,0 og 10 ug /ml, 24 timer, DMSO 0,1%). (B) LYSOTRACKER, detekteres ved fluorescensmikroskopi, viser diffus farvning i T47D-celler efter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer og 72 timer. (C) LYSOTRACKER intensitet per celle blev kvantificeret ved ImageJ og data præsenteret som middelværdi fluorescens værdien for hver gruppe sammenlignet med DMSO-kontrol. Fejlsøjler indikerer standardafvigelser på middelværdien, ** p 0,001. Målestokken vist repræsenterer 100 um og gælder for alle paneler. (D) Ingen effekter på Lamp2 immunfarvning blev opdaget, efter behandling med UA

(

10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer. Målestokken vist repræsenterer 100 um og gælder for alle paneler. (E) Et plasmid der udtrykker mRFP-GFP-LC3 blev transficeret i T47D celler. Mangel på autophagolysosomal forsuring blev set efter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer ved påvisning af særskilte GFP puncta. Målestokken viste repræsenterer 20 um og gælder for alle paneler.

Electron Microscopy

Efter 24 timers inkubationstid ved standardbetingelser celler blev høstet ved trypsinisering og fikseret i 1 ml glutaraldehyd (Ted Pella Inc., 18426) opløsning i 60 minutter ved stuetemperatur, derefter centrifugeret og opbevaret ved 0-5 ° C i 24 timer. Efter fjernelse af glutaraldehyd blev to dråber af en 2% gelatineret opløsning (Ted Pella Inc., 19225) i destilleret vand tilsat til cellepelleten, omhyggeligt blandet og opbevaret ved 0-5 ° C i 24 timer. Prøverne blev derefter vasket to gange med PBS og osmiumtetroxid (Ted Pella Inc., 18463) tilsat til hver prøve i en time og vasket igen med PBS. Prøver blev skåret i 2-5 mm stykker under en makroskop hjælp barberblade. Stykkerne blev dehydreret ved anvendelse af ethanol (Merck, 64271D) ved stigende koncentrationer, under rotation. Epoxy-harpiks (Ted Pella Inc., 18300) blev tilsat, først på 1:01 (vol: vol) med 99% ethanol (Merck, 64271) i en time, derefter to gange harpiks kun i en time hver gang. Formene blev derefter anbragt i en ovn ved 70 ° C i 24 timer. Harpiksen blev derefter skåret med et glas kniv (tykkelse ca. 0,5 um) og farvet med toluidinblåt til udvælgelse af prøver til sektionering med en diamant kniv (70-100 nm tykkelse). Prøverne blev anbragt på en kobber ramme før farvning med en 0,06 g /ml bly-citratopløsning (Ted Pella Inc., 19.314) og blev visualiseret ved anvendelse af et Philips EM300 elektronmikroskop. Projektioner blev udviklet ved anvendelse af standardprocedurer til fotografering. Den fremkaldte film blev scannet ind i en computer med en Nikon Coolscan V ED

(A) Et fald i p-p70S6k blev opdaget ved immunoperoxidasefarvning, efter behandling med UA (10 ug /ml;. DMSO 0,2% ) i 24 timer. Målestokken vist repræsenterer 100 um og gælder for begge paneler. (B) En stigning i p-eIF2α blev registreret, efter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%). I 6 timer

Immuncytokemi

Til immunfluorescensfarvning, celler blev høstet og fikseret i 4% paraformaldehyd (Sigma, P6148) og farvet med anti-cytochrom

c,

muse IgG2a monoklonalt antistof (Abcam, ab110325), spaltet caspase-3, kanin-polyklonalt antistof (Cell Signaling, 9661) eller LAMP2, muse IgG1 monoklonalt antistof (H4b4, opnået fra University School of Medicine, Baltimore), efterfulgt af Alexa Fluor rød 546 gede-anti-kanin IgG-antistof (Invitrogen, A11010), Alexa Fluor grøn 488 gede-anti-kanin IgG-antistof (Invitrogen, A11070) eller Alexa Fluor rød 546 gede-anti-muse-IgG

2a antistof (Molecular Probes, A11018) For kernefarvning TO-PRO-3 iodid (Invitrogen, T3605) anvendt. For LC3 detektion blev cellerne fikseret med methanol (Sigma, 34860) i 10 minutter ved -20 ° C og farvet med anti-LC3B (D11), kanin-IgG monoklonalt antistof (Sigma, L7543) efterfulgt af Alexa Fluor grøn 488 gede anti -rabbit IgG-antistof (Invitrogen, A11070). De farvede celler blev visualiseret og fotograferet under et konfokalt mikroskop (Zeiss, LSM 5 Pascal). For immunoperoxidasefarvning celler blev fikseret med methanol (Sigma, 34860) i 5 min ved -20 ° C og farvet med anti-phospho-p70S6 kinase (Thr389, 108D2), kanin-IgG, monoklonalt antistof (Cell Signaling, 9234), anti -LC3B (D11), kanin-IgG monoklonalt antistof (Sigma, L7543) og anti-P62 (SQSTM1), kanin-polyklonalt antistof (Enzo, PW9860) efterfulgt af inkubering med monoklonalt muse-anti-kanin immunoglobuliner IgG1ĸ (Dako, M0737), polyklonale kanin anti-muse immunglobuliner IgG (Dako, Z0259), PAP, peberrodsperoxidase og monoklonale muse-anti-peberrod immunkomplekser, IgG1 (Dako, P850) og DAB tabletter, chromogen (Dako, S3000). De farvede celler blev visualiseret og fotograferet under en under lysmikroskop (Leica DMI 3000B).

Western blot analyse

Celler blev høstet og lyseret med RIPA buffer. Proteinindhold blev kvantificeret spektrometrisk hjælp Bradford-reagens (Sigma, B6916). Proteiner blev separeret på NuPAGE 10% Bis-Tris Mini Gels og overført til 0,2 uM polyvinylidendifluorid (PVDF) membran ved elektroblotting. Membraner blev probet med anti-phospho-AMPKα (Thr172) kanin-IgG-monoklonale antistoffer (Cell Signaling, 4188), anti-P62 (SQSTM1), kanin-polyklonalt antistof (Enzo, PW9860), anti-LC3B (D11), kanin-IgG monoklonalt antistof (Sigma, L7543), anti-phospho-eIF2α (Ser51) kanin-polyklonalt antistof (Cell Signaling, 9721) eller anti-G3PDH kanin-anti-humant polyklonalt antistof (R 0,05 og p 0,001 hhv. Billeder og data er vist, er repræsentative for hvad der blev observeret i mindst tre separate forsøg. Salg

Resultater og Diskussion

indre vej af apoptose udløses ved åbning af porerne i den ydre mitokondriske membran fører til frigivelse af cytochrom

c

i cytosolen og aktivering af caspasekaskaden [26]. For at følge op på vores tidligere arbejde om virkningerne af UA på mitokondriemembranen potentielle [12] undersøgte vi cytochrom

c

lækage og spaltning af caspase-3 ved immunfarvning i brystkræft T47D og pancreas cellelinje Capan-2. Ingen cytokrom

c

frigivelse eller spaltede caspase-3 produkter var påviselige efter behandling med usnic syre (10 ug /ml) efter 24, 48 og 72 timer (data vist i 72 timer.. Fig S1A og Fig S1B ). Disse resultater understøtter vores tidligere data, som UA forårsager sent nekrose men ingen apoptose [12], og viser, at selv om mitokondrie pH-gradient er forstyrret, mitokondrierne selv er intakt.

Det er blevet rapporteret, at usnic syre årsager afkobling af mitokondrier [27], inhiberer mitokondriel respiration og medfører et fald i ATP-niveauer i murine hepatocytter [10]. Genekspression data fra microarray analyse har styrket det forslag, at usnic sure pendulkørsler protoner mod gradient skabt af den mitokondrielle elektrontransport, da det fører til induktion af gener associeret med komplekser I-IV i elektrontransportkæden [9]. For at undersøge dette nærmere blev ATP-niveauer evalueret og phosphorylering af AMP-kinase analyseret i T47D-celler. Resultaterne viser, at UA behandling fører til nedsat cellulære niveauer af ATP efter 24 timer behandling (5,0 ug /mL p = 0,0523, 10 ug /ml p = 0,010). Som forventet blev nedsat mængde ATP forbundet med øget phosphorylering af AMP kinase efter både 24 og 48 timer behandling (10 ug /ml) (fig. 1A og B).

Denne nedgang i cellulære energi niveau og udløsning af sensing mekanisme ville forventes at inducere autofagi. Elektronmikroskopi analyse af T47D-celler behandlet med UA (2,5 og 5,0 ug /ml) i 24 timer, der mere markant tilstedeværelse af autophagic vakuoler, med dobbelte membraner karakteristiske for autophagosomes, sammenlignet med kontrollen (fig. 2). Disse resultater blev fulgt op af analyse for LC3 puncta ved immunfluorescens, og en estimering af den overflod af autophagosomes, på forskellige tidspunkter og behandlinger af tre celletyper (fig. 3A, fig. 3B og fig. S2a-C). Ingen virkninger blev set efter behandling med UA (10 ug /ml) i 2 timer i nogen af ​​de tre cellelinier, men blev observeret en stigning efter behandling med anti-diabetisk lægemiddel metformin i T47D brystcancercellelinie, som var ikke længere til stede efter længere tids behandling. Metformin er tidligere blevet vist at stimulere AMP kinase allerede efter en time [28]. Efter 24 timers behandling med UA (10 ug /ml) en signifikant stigning i LC3 puncta var tydelig sammenlignet med kontroller i de to brystcancercellelinier. Immunoperoxidasefarvning af T47D-celler viste også øget tilstedeværelse af LC3 puncta efter UA behandling (fig. S2D). Disse resultater blev yderligere bekræftet ved at observere en stigning i LC3 I og LC3 II ved Western blotting (fig. 3C). Virkningerne på normal hud fibroblaster blev ikke markeret. Til sammenligning blev celler udsultet med 40 minutters inkubation i næringsstof-fri Hanks balancerede opløsning. Selvom visuel inspektion foreslog nærvær af autophagosome dannelse i udsultede celler (fig. 3A), LC3 puncta var vanskelige at tælle og dette barske behandling var ikke godt tolereret af cellerne.

Efter at have observeret en stigning i LC3 puncta efter behandling med UA, vi undersøgt, om dannelsen af ​​autophagic vakuoler blev efterfulgt af autophagic flux. Niveauerne af autophagosomal lasten P62 blev evalueret efter udsættelse for UA. Koncentrationen af ​​p62 har vist sig at aftage hvis autophagic flux forøges, da det nedbrydes i processen [29]. Dannelse af autophagosomes som følge af behandling med UA efter 24 timer (5,0 og 10 ug /ml) i T47D og MCF7-celler (Fig. 4A og fig. S3) blev efterfulgt af nedbrydning af internaliseret protein. Fraværet af p62 nedbrydning efter 24 timer antyder en afbrydelse af lysosomal syrning og autophagolysosome modning, som kunne være forårsaget af proton shuttling egenskaber usnic syre tværs af lysosomale membran, som det ses i depolarisering af mitokondrierne [9], [10].

for at evaluere yderligere virkningerne af UA på lysosomer vi brugte den lysosomale markør lysoTracker i T47D-celler, hvilke etiketter og spor sure organeller i cellerne. Resultaterne viste meget markant diffus stigning i lysoTracker farvning i T47D celler efter UA behandling i 24 og 72 timer (fig. 4B og fig. 4C). Denne farvning mønster er blevet fortolket som lysosomale dilatation som er forårsaget af behandling med klorokin, som akkumulerer inde lysosomer. I celler behandlet med chloroquin, immunofarvning for den lysosomale membran-protein kopieret Lamp1 mønstret opnået med lysoTracker, hvilket således bekræfter lysosomal dilatation [30]. I modsætning hertil i vore forsøg, immunfluorescensfarvning for det lysosomale protein Lamp2 viste ingen morfologiske ændringer og blev ikke observeret nogen forskel mellem behandlede og ubehandlede celler (Fig. 4D). Dette indikerer, at lysoTracker var farvning uden lysosomet og kunne forklares ved det faktum, at fastholdelsen af ​​farvestoffet indersiden af ​​lysosomer afhænger sur pH [31]. Den diffuse lysoTracker farvning efter UA behandling kan således skyldes protoner bliver sendt ud af lysosomet, på samme måde som det forekommer på tværs mitokondriemembranen.

At udforske autophagosome modning efter UA behandling, anvendte vi en plasmid-konstruktion , tfLC3 (mRFP-GFP-LC3 tandem-mærket fluorescerende protein), som vi transficeret de T47D celler. Denne fremgangsmåde er tidligere blevet anvendt til at følge autophagic modningsproces. GFP-LC3 mister fluorescens som følge af lysosomale surhed mens mRFP fluorescens er stabilt [23], [24]. Resultaterne viste, at GFP-fluorescens i udsultede celler blev svækket indebærer sure betingelser og nedbrydning af lysosomale hydrolaser, mens mRFP fluorescens forblev stabil. Efter behandling med UA i 24 timer blev GFP, samt mRFP observerede fluorescens indikerer afbrydelse af autophagolysosomal forsuring og forringede nedbrydende betingelser efter behandling med UA (fig. 4E). Den manglende af disse celler til at fuldføre autofagi kunne bidrage til akkumulering af autophagic vakuoler og fastholdelse af ikke nedbrudt P62.

En af de adaptive funktioner for de fleste kræftformer er dysreguleret pH. I normale celler intracellulær pH ​​er lavere end den ekstracellulære pH. I kræftceller gradienten vendes skabe et gunstigt miljø for metastatisk progression. Højere intracellulær pH-værdien holdes på grund af øget H

+ efflux grund af ændringer i ekspressionen og /eller aktiviteten af ​​plasmamembran-pumper og transportører [32]. PH-gradienten i tumorceller er til gavn for den cellulære ophobning af svage syrer, såsom usnic syre, der forårsager svage syrer for at være hovedsagelig neutral ved lavt pH og lette deres overførsel over membranen. Behandling med UA viser signifikant induktion af gener, der er forbundet til komplekser I til IV af elektrontransportkæden, som kunne være en kompenserende mekanisme til at bevare proton gradient over den mitokondriske indre membran [9], [32].

har Studier af flere arvelige syndromer, der disponerer for forskellige typer af tumorer og karcinomer ført til identifikation af mTOR pathway som en regulator af autofagi. Blandt nedstrøms mål for mTORC1 er p70S6K og 4EBP1, som har en væsentlig rolle i celle-cyklus kontrol og spredning [33], [34]. I fig. 1B viser vi, at UA aktiverer AMP-kinase, som signalerer til mTORC1 kompleks. At udforske nedstrøms mål for mTORC1 vi analyserede effekter i UA-behandlede celler på fosforyleret p70S6K ved immunoperoxidasefarvning. Resultaterne viste et markant fald i farvning efter behandling i 24 timer (Fig. 5A). Celler reagerer på næringsstof mangel ved at inducere autofagi men denne proces kan også udløses af cellulært stress [19]. At udforske, om UA kunne udløse autofagi af anden mekanisme testede vi for tegn på cellulær stress i T47D-celler efter behandling med UA (10 ug /ml) i 6 timer. Forøget phosphorylering af eIF2α, som er en af ​​de anerkendte tegn på ER stress, blev påvist (fig. 5B).

Virkningerne af usnic syre på autofagi kan sammenlignes med dem, der er beskrevet for malariamiddel chloroquin som i øjeblikket er i kliniske forsøg i kombination med anticancer regimer [19]. Klorokin er en svag base (p

K

en 8,5) og akkumuleres inde lysosomer, som bliver udspilet og dysfunktionelle, blokering autophagic flux [19]. I modsætning hertil usnic syre er en svag syre, der shuttles protoner over membraner og således øge lysosomal pH, som vist ved fastholdelse af GFP-signal, men lysosomal form blev ikke påvirket (LAMP2 farvning). ER stress induceres af proteasomhæmning og ER-associeret autofagi er derfor særlig relevant for cancerterapi med proteasominhibitorer. Det har vist sig, at kombinere chloroquin med proteasominhibitoren bortezomib øger tumor celledød

in vitro

in vivo

[35]. Cellulær optagelse og intracellulær fordeling af lægemidler påvirkes af pH [32], [36]. Chloroquin kan eksempelvis forhindre intracellulær binding i lysosomer [36], men har ingen effekt på mitokondrisk akkumulering af daunorubicin, hvilket antyder, at forbindelsen ikke påvirker mitokondrisk pH [37]. Som usnic syre påvirker pH i lysosomer og mitokondrier Det forventes at påvirke intracellulær narkotika distribution.

Som konklusion har vores tidligere undersøgelse vist, at UA medfører tab af mitochondriemembranpotential. I den aktuelle undersøgelse, har vi vist, at dette ikke fører til frigivelse af cytochrom

c

udløsning af apoptose. H

+ shuttling effekt af UA opererer på to organeller, mitokondrier og lysosomer og dens indvirkning på autophagosome dannelse sandsynligvis vil blive udløst både ernæring udtømning og stress betingelser. Autophagic flux er dog ufuldstændig og nedbrydning af autophagosomal indhold ikke forekommer. Vores resultater har konsekvenser for terapeutisk manipulation af autofagi og pH-bestemt stof distribution.

Støtte Information

Figur S1.

UA ikke forårsager apoptose. (A) Cytochrom c lækage var ikke påviselig ved immunofluorescens i T47D og Capan-2-celler efter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24, 48 og 72 timer. (B) Ingen spaltningsprodukter af caspase-3 var påviselige efter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) efter 24, 48 og 72 timer. Målestokken viste repræsenterer 20 um og gælder for alle paneler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0051296.s001

(TIF)

Figur S2.

UA inducerer dannelse af autophagosome vakuoler. LC3 puncta per celle blev talt og kvantificeret ved ImageJ og data præsenteret som 95% familie-wise konfidensniveau. (A) T47D-celler behandlet med UA i 2 og 24 timer. (B) MCF7-celler behandlet med UA i 2 og 24 timer. (C) Normale humane fibroblaster behandlet med UA i 2 og 24 timer. (D) En stigning i LC3 immunoperoxidasefarvning blev detekteret i T47D-celler efter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer. Målestokken vist repræsenterer 100 um og gælder for begge paneler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0051296.s002

(TIF)

Figur S3.

UA ikke fører til nedbrydning af P62. Noget fald i P62 immunoperoxidasefarvning blev detekteret i T47D-celler efter behandling med UA (10 ug /ml; DMSO 0,2%) i 24 timer. Målestokken vist repræsenterer 100 um og gælder for begge paneler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0051296.s003

(TIF)

Tak

Vi er taknemmelige for medlemmer af Biomedical center, University of Iceland, Jóhann Arnfinnsson for hjælp med elektronmikroskopi og Jenny Björk Þorsteinsdóttir til teknisk bistand. Vi takker Anna Helga Jónsdóttir for hjælp med statistik.