PLoS ONE: microRNA 130b blænder Migration og invasion af tyk- og endetarmskræft Cells via nedregulering af Integrin β1

Abstrakt

MicroRNA 130b (miR-130b) er betydeligt dysreguleret i forskellige humane tumor typer. I denne undersøgelse ved anvendelse af en mikroarray-assay, vi kendetegnet opregulering af MIR-130b ekspression i kolorektal cancer (CRC) prøver. Men der er begrænset viden om roller afvigende miR-130b udtryk i CRC. Vore studier i CRC-celler viste, at MIR-130b signifikant nedsætter cellemigrering og invasion, men det har ingen åbenbart virkninger på celleproliferation og apoptose. I overekspressionen MIR-130b CRC-celler og CRC prøver, vi iagttog et lavere niveau af integrin β1 protein, hvilket betragtes som en vigtig molekyle involveret i cellemotilitet. Målretningen af ​​3′-UTR-regionen i integrin β1-gen af ​​MIR-130b blev afsløret under anvendelse af en luciferase reporter assay. Reguleringen af ​​integrin β1 af miR-130b blev yderligere vist ved hjælp af miR-130B efterligner og hæmmer af miR-130b. Den forringet motilitet af miR-130b overekspression celler udvindes dels af ekspressionen af ​​integrin β1 mangler 3′-UTR. Derudover knockdown af integrin β1 giver også anledning til et fald i celle migration og invasion, som svarer til den hindret motilitet skyldes overekspression af MIR-130b i CRC-celler. Desuden blev de inverse udtryk for miR-130b og integrin β1 observeret i CRC prøver. Sammenfattende viser disse data, at MIR-130b nedregulerer sit mål-integrin β1, fører til forringet migration og invasion af CRC-celler

Henvisning:. Zhao Y, Miao G, Li Y, Isaji T, Gu J , Li J, et al. (2014) microRNA 130b blænder Migration og invasion af tyk- og endetarmskræft Cells via nedregulering af Integrin β1. PLoS ONE 9 (2): e87938. doi: 10,1371 /journal.pone.0087938

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: November 7, 2013; Accepteret: December 3, 2013; Publiceret: 3 feb 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China Grant 81101859, National Natural Science Foundation of China Grant 81270379, National Natural Science Foundation of China Grant 81070231 og Beijing Natural Science Foundation 5102039. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er korte ikke- kodende RNA’er på 24 til 25 nukleotider, som medierer gendæmpning gennem ufuldkommen hybridisering til 3′-utranslaterede region (3′-UTR) i mål-mRNA’er [1]. MiRNA spiller en vigtig rolle i praktisk talt alle biologiske aktiviteter i pattedyr og andre flercellede [2] organismer. Endvidere er det blevet rapporteret, at miRNA påvirke talrige kræft-relevante processer såsom migration, proliferation. Endnu vigtigere er, er microRNA-molekyler allerede ind i klinikken som diagnostiske og prognostiske biomarkører for patient lagdeling og også som terapeutiske mål og agenter [3]. For nylig er miR-130b afsløret som en af ​​nye tumor-relaterede miRNA og har i høj grad dysreguleret i tumorer ved en omfattende meta-analyse af miRNA udtryk microarray datasæt, som omfatter 33 sammenligninger og næsten 4.000 tumor og tilsvarende nontumors prøver [4]. Derfor har miR-130b er fundet opreguleret i forskellige typer af kræft: gastrisk kræft [5], [6], kutan malignt melanom [7], hoved og hals pladecellekræft [8] og blærekræft [9]. Sammen er det blevet anslået, at miR-130b spiller nøgleroller i løbet onkogenese.

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd og den anden hos kvinder over hele verden. Cirka 608.000 dødsfald som følge tarmkræft estimeres på verdensplan, hvilket gør det den fjerde hyppigste årsag til kræft død [10]. I øjeblikket er en af ​​hindringerne i kræftbehandlingen er den høje tumormetastase. Den metastatiske proces følger af en række trin: Først cancerceller inden den primære tumor bryder væk fra naboceller og invadere basalmembranen. Denne lokale invasion kan ofte være udløst af kontekstuelle signaler, forårsager kræftceller til at gennemgå en epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [11]. Efter intravasation, kan cellerne ekstravasere fra kredsløbet ind i det omgivende væv, hvor de kan forblive i dvale eller iværksætte og opretholde væksten at danne angiogene metastaser [12], [13]. Metastase er den største dødsårsag i mange cancertyper, herunder CRC [14] – [16]. Derfor er en bedre forståelse af den molekylære mekanismer underliggende metastaser nødvendig for at fremme udviklingen af ​​effektive terapeutiske strategier for patienter med CRC.

I vores undersøgelse, vi sammenlignet miRNA udtryk i prøver fra CRC patienter ved hjælp af en microRNA microarray og observeret signifikant opregulering af mIR-130b udtrykt i CRC prøver. For at få indsigt på rollerne for miR-130b i CRC, undersøgte vi effekten af ​​miR-130b i CRC celler og CRC prøver. Vores data antydet, at integrin β1 er et target-gen af ​​miR-130b og nedregulering af integrin β1 af miR-130b fører til forringet migration og invasion af CRC celler.

Eksperimentelle procedurer

Klinisk eksemplarer

Tyktarmskræft og tilstødende kontrol vævsprøver blev opnået fra 33 patienter i Beijing Hospital, Sundhedsministeriet (Beijing, Kina) efter kirurgisk resektion. Tumor væv og tilstødende normale væv blev nedfrosset i flydende nitrogen efter resektion. Ingen patienter i den aktuelle undersøgelse fik kemoterapi eller strålebehandling før operationen. Alle patienter skal have skriftligt informeret samtykke til brug af deres væv, i henhold til Helsinki-deklarationen. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af den etiske komité i Beijing Institute of Geriatri, Sundhedsministeriet.

MicroRNA microarray analyse

Små RNA blev isoleret fra tumorvæv og tilstødende normale væv. kvalitetskontrol, mærkning, hybridisering og scanningsprocedurer De blev udført af CapitalBio (Beijing, Kina), ved hjælp af Affymetrix s GeneChip miRNA-chip V1.0. Differentielt udtrykte gener mellem tumorvæv og tilstødende normalt væv blev analyseret under anvendelse SAM software 3.02. MiRNA, der opfyldte kriterierne i q-værdi (%) ≤5 og fold forandring ≥2 eller fold ændring ≤0.05 mellem grupperne blev anset for at være signifikant forskellig. Varme kort blev udført under anvendelse Cluster 3,0 pakke software. De data, der præsenteres i denne undersøgelse er deponeret i National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) og er tilgængelige via GEO tiltrædelsen nummer GSE53592.

Cell kultur

humane kolorektale cancer cellelinjer SW-480 og SW-620 blev købt fra Cell Resource center, IBMs, WEBCAMS /PUMS og bestået i mindre end 6 måneder. Celler blev dyrket i RPMI-1640 (Gibco, Paisley, UK) med 10% FBS (Gibco, Paisley, UK) og 2 mmol /l L-glutamin (Gibco, Paisley, UK), 100 U /ml penicillin (Gibco, Paisley, UK), og 100 pg /ml streptomycin-sulfat (Gibco, Paisley, UK).

Pri-miR-130 B kloning, lentivirus produktion og transduktion

Den menneskelige primære microRNA 130b gen (PRI-mIR-130b) blev amplificeret ved PCR fra humant genomisk DNA ved anvendelse af følgende primere: fremadrettet 5′-ATATTCTCGAGGGGGATCTCCC-3 ‘og bagudrettet 5′-ATATCGGATCCTCTTACCCCAG-3’, og derefter subklonet ind i pLVX-IRES-Hyg-vektoren ( TaKaRa, Dalian, Kina) til at generere pLVX-miR-130b. Viruspartiklerne blev høstet 48 timer efter transfektion af pLVX-MIR-130b i HEK-293T celler under anvendelse af Lenti-HT emballagemix (Takara, Dalian, Kina). De SW480-celler blev inficeret med det høstede rekombinant lentivirus i nærvær af 6 ug /ml Polybrene (Sigma, St. Louis, USA). De SW480 celler blev holdt i komplet vækstmedium i nærvær af 1 mg /ml Hygromycin (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). PCR-amplikon af PRI-MIR-130b blev også subklonet ind i pWPI lentiviral vector (Addgene, Cambridge, MA, USA) til at generere pWPI-MIR-130b. Den tomme pWPI vektor, der koder for grønt fluorescerende protein (GFP), blev anvendt som kontrol. Viruspartiklerne blev høstet som beskrevet tidligere. De SW620 celler, der stabilt udtrykker GFP blev selekteret ved fluorescens-aktiveret celle-sortering (FACS), med anvendelse af en Vantage SE Diva cellesorterer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

RNA revers transkription og kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) assays

Den samlede RNA, herunder små RNA’er blev ekstraheret fra kliniske prøver eller fra CRC celler med et Mirvana MicroRNA Isolation Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) og underkastes revers transkription. QRT-PCR blev udført ved anvendelse med SYBR Premix Ex Taq mix (Takara, Dalian, Kina) ifølge producentens instruktioner, og prøverne blev kørt på en iQ5 Flerfarvet Real-time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, USA) . Termiske reaktionscykler af 95 ° C i 30 s og 45 gentagelser af 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 20 s blev anvendt. De anvendte primere var som følger: HSA-MIR-130b fremadrettet 5′-GCCGCCAGTGCAATGATGAA-3 ‘HSA-MIR-130b bagside 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′; U6 fremadrettet 5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3 ‘; U6 bagside 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3 ‘

Luciferase reporter assay

fuld længde 3′-utranslateret region (3′-UTR) fragmenter af integrin β1-genet blev amplificeret ved PCR fra human genomisk DNA under anvendelse af primere fremadrettet 5′-GTACTGCCCGTGCAAATCCCACAAC-3 ‘og bagudrettet 5’-TGCTTTTCCTCAACTTCTTTAATC-3, og blev klonet ind i en pMD18-T-vektor (Takara, Dalian, Kina).

Sac

I-

Sal

I-fordøjede produkter blev klonet ind i en pmirGlo Dual-luciferase miRNA Target ekspressionsvektor (Promega, Madison, USA) for at danne 3′-UTR-luciferase reporter vektor . De SW480-celler blev cotransficeret i 24-brønds plader under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) med 3′-UTR-luciferase reporter vektor og de angivne miRNA. Fireogtyve timer efter transfektion ildflue og Renilla luciferase-aktiviteter blev målt fortløbende ved anvendelse dual-luciferase assay (Promega, Madison, USA), ifølge fabrikantens protokoller. Negativ kontrol-vektor blev genereret ved kloning af samme 3′-UTR af integrin β1-gen i omvendt orientering. Aktiviteten af ​​prøverne blev målt i en GloMax 20/20 Luminometer (Promega, Madison, USA). Ildflue luciferase-aktivitet blev normaliseret ved Renilla luciferaseaktivitet for transfektionseffektivitet.

Cell transfektion

plasmid, der anvendes til ekspression af integrin β1 mangler 3′-UTR (β1-ORF) blev beskrevet tidligere [17]. Vi bruges pWPI vektor som en kontrol. HSA-miR-130b efterligner, HSA-miR-130b-hæmmer (anti-miR-130b), kontrol efterligner og siRNA mod integrin β1 [18] blev syntetiseret af Ribobio (Guangzhou, Kina). Sekvenserne var som følger: HSA-MIR-130b efterligner, 5′-CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU-3 ‘; HSA-MIR-130b inhibitor, 5’-AUGCCCUUUCAUCAUUGCACUG-3 ‘; integrin β1 siRNA, (sense) 5’-GGAACAGCAGAGAAGCUCA-3 ‘[18]; De SW480-celler blev transficeret under anvendelse RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, USA) eller Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) ifølge producentens anvisninger.

cellemigrationsassay og invasion assay

Cellemigration assay blev vurderet ved anvendelse transwell kamre (8-um, BD Bioscience, San Jose, USA). 5 × 10

5-celler blev anbragt i det øvre kammer af hver indsats, og 500 pi komplet medium blev tilsat til bunden godt. De celler, der ikke migrerede blev fjernet fra de øvre overflader af filtrene ved hjælp af vatpinde, og de celler, der var migreret til de nedre overflader af filtrene blev fikseret med 4% paraformaldehyd-opløsning og farvet med 0,1% krystalviolet. Billeder af tre tilfældige felter blev erobret fra hver membran, og antallet af migrerende celler blev talt. Lignende skær overtrukket med matrigel blev anvendt til at bestemme den invasive potentiale.

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev bestemt ved anvendelse af et tetrazolium-forbindelse [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium, indre salt (MTS) (CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay) (Promega, Madison, USA), ifølge fabrikantens protokol . Kort fortalt, på de angivne tidspunkter, er assays udført ved tilsætning af CellTiter 96 Aqueous One Solution-reagens direkte til dyrkningsbrønde, inkubering i 2 timer og derefter registrering af absorbansen ved 490 nm med en 96-brønds plade-læser.

Western blotting

Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran (Millipore, Billerica, USA). Membranen blev blokeret med 5% fedtfri mælk og inkuberet med muse-anti-integrin β1 (1/2500, BD Biosciences, San Jose, USA), muse-anti-E-cadherin (1/2000, BD Biosciences, San Jose, USA), kanin-anti-caspase 3 (1/1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), kanin-anti-caspase 8 (1/800, Millipore, Billerica, USA) eller muse-anti-GAPDH (1/10000, Sigma , St. Louis, USA) antistoffer.

Statistisk analyse

data præsenteres som gennemsnit ± sD Den statistiske signifikans mellem grupperne blev vurderet ved Students

t

-test. En værdi på

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikans

Resultater

Påvisning af øget miRNA-130b niveauer i CRC prøver

Ved hjælp af en microarray analyse, kendetegnet vi miRNA udtryk i kolorektal cancer (CRC) væv og marcherede tilstødende normale væv høstet fra 3 patienter (P1, P2, og P3). Karakteriseringen af ​​CRC patienter er beskrevet i tabel 1. Vi testede differentierede miRNA udtrykker ved hjælp af SAM-pakken. De 31 markant opreguleres miRNA (fig. 1A) probe sæt (fold≥2) blev identificeret i CRC prøver. Og de 17 betydeligt nedreguleret miRNA blev vist i tabel S1. I microarray udlæsninger, bemærkede vi, at miR-130b er en af ​​markant opreguleres miRNA. Et stigende antal undersøgelser har rapporteret miR-130b som tumor-relaterede miRNA og miR-130b spiller en vigtig rolle under onkogenese [4]. For bedre at forstå de potentielle funktioner i CRC, vi først brugt QRT-PCR for at bekræfte miR-130b udtryk i de 3 CRC patienter (fig. 1B). I overensstemmelse med microarray udlæsninger i fig. 1A, de QRT-PCR-resultater viste forøget ekspression af MIR-130b i de 3 CRC tumorvæv (fig. 1B). Vi derefter genereret lentiviral vektor, der udtrykker primær microRNA 130b (Lenti-PRI-MIR-130b) (fig. 1C øverste felt), og fremstillet SW-480-celler med stabil overekspression af MIR-130b (Lenti-MIR-130 B-celler) og den respektive kontrol (Lenti-vektor-celler). Vi fandt, at niveauerne af den modne miR-130b er steget betydeligt i de fire kolonier af Lenti-miR-130 B celler sammenlignet med Lenti-vektor-celler (fig. 1C nederste panel).

A

, Heat map diagram over de 31 væsentligt forhøjede miRNA i kolorektal cancer væv sammenlignet med matchede tilstødende kontrol væv fra 3 patienter (P1, P2 og P3). De tilstødende kontrol væv betegnes N1, N2 og N3. Tumorerne omhandlede T1, T2 og T3. MiRNA er vist i rækker. Prøver er vist i kolonner. Rød i farve bar indikerer højere udtryk og blå indikerer lavere udtryk. MIR-130b (

Red Arrow

) er en af ​​markant opreguleres miRNA.

B

, Relative udtryk for miR-130b (normaliseret til U6) i tumorer end tilstødende kontrol væv (T /N) fra P1, P2, og P3, bestemt ved QRT-PCR (gennemsnit ± sd; n = 3).

C

,

Overpanel

: Skematisk diagram af en lentiviral pLVX-IRES-Hyg vektor, der indeholder den primære microRNA 130b (Lenti-miR-130b).

Underpanel

: Relative udtryk for miR-130b (normaliseret til U6) i SW480 celler, der stabilt udtrykker miR-130b (Lenti-miR-130b) eller kontrol (Lenti-kontrol), undersøgt ved QRT-PCR ( middelværdi ± standardafvigelse, n = 3). De fire kolonier af Lenti-miR-130 B celler omtales 1,2,3,4.

MIR-130b nedsætter migration og invasion af CRC celler

Vi næste undersøgt, hvordan miR-130b kan fungere inde kolorektal cancer celler. De Lenti-vektor celler og Lenti-miR-130 B-celler blev anvendt til at analysere virkningerne af miR-130b på CRC celler. Cellerne blev først udsat for migration assay og invasion assay, hhv. Vi observerede, MIR-130b signifikant inhiberer migrationen af ​​de Lenti-MIR-130B-celler (Fig. 2A). Vi derefter undersøgt virkningen af ​​MIR-130b på invasivitet af cellerne under anvendelse af matrigel invasion assay system. I overensstemmelse med resultatet af migration assay invasiviteten signifikant reduceret i Lenti-MIR-130b celler (Fig. 2B). Interessant, er der ingen signifikant forskel i proliferation mellem Lenti-vektor-celler og Lenti-MIR-130b-celler (fig. 2C). Desuden har vi ikke observere de åbenlyse forskellige ekspressionsniveauerne af apoptotisk caspases- caspase 3 og caspase 8 mellem Lenti-vektor celler og Lenti-miR-130b-celler (Fig. 2D). Alle disse resultater antydede, at overekspression af MIR-130B resulterer i forringet cellemotilitet af CRC-celler, men det har ingen virkning på proliferation og apoptose af CRC-celler.

A, B

, Transwell migration (

A

) og invasion (

B

) analyser af Lenti-kontrol celler og Lenti-miR-130 B-celler (skala bar = 100 um, gennemsnit ± sd, n = 4; * ,

P

0,05, **,

P

0,01). Repræsentative billeder af migrerede celler (

A

) og invaderede celler (

B

) er vist.

C

, Spredning af Lenti-kontrol celler og Lenti-miR-130 B-celler målt ved MTS assay løbet tredages tidsforløbet (gennemsnit ± standardafvigelse .; n = 4).

D

, Western blot-analyser af caspase-3 og caspase-8-ekspression i Lenti-kontrolceller og Lenti-MIR-130B-celler fra tre uafhængige forsøg. GAPDH anvendt som lastning kontrol.

MIR-130b undertrykker integrin β1 udtryk via sin 3′-UTR

Vi yderligere undersøgt den mekanisme, hvormed miR-130b påvirker motilitet CRC celler . Vores tidligere undersøgelser havde vist, at post-translationel modifikation spiller en vigtig rolle i integrin-medieret migration [17], [19], [20]. Integriner er en familie af celleadhæsionsmolekyler, der omfatter 18α og 8p underenheder, der kombinerer til mindst 24 heterodimerer. Vigtigere, det cytoplasmatiske domæne af integrin β1 transducerer tovejskommunikation signaler fra inde i cellen ved at regulere kropsbygning og ligand affiniteter det ekstracellulære domæne (inside-out signaler), mens mediere nedstrøms signalering og interaktioner med cytoskelettet (uden-i signalering) [ ,,,0],21] – [23]. Så integrin β1 er et centralt regulator involveret i metastaser

in vitro

in vivo

[24] – [27]. I denne undersøgelse fandt vi, at ektopisk ekspression af MIR-130b i SW480 celler resulterer i et fald i den endogene integrin β1 proteinniveau af fire Lenti-MIR-130B kolonier ved omtrentlig 50%, sammenlignet med den af ​​de Lenti-vektor-celler ( fig. 3A). Den konsekvente resultat blev observeret i SW-620-celler med overekspression af MIR-130b (fig. 3B). Men der er ingen ændring i ekspressionsniveauet af E-cadherin (fig. 3C), som er en central molekylær involveret i EMT. Og som nævnt før, EMT er det første skridt i metastaser. Vi undersøgte også ekspressionen af ​​integrin β1 i de 3 par prøver underkastet mikroarrayet er vist i fig. 1A. I overensstemmelse med oplysningerne i fig. 3A og fig. 3C, er integrin β1 proteinekspression faldet i de tumorvæv sammenlignet med de tilsvarende hosliggende normale væv (fig. 3D (a)), hvorimod der ikke blev detekteret nogen tydelig ændring af ekspressionen af ​​E-cadherin (fig. 3D (b)) . Det er bemærkelsesværdigt, at den formindskede niveau af integrin β1 protein blev påvist i overekspression MIR-130b CRC celler (Lenti-MIR-130B-celler) og CRC prøver samt. Derfor søgte vi at undersøge, om miR-130b kan regulere integrin β1

En

,

Overpanel

:. Western blot analyser af integrin β1 protein-ekspression i Lenti-kontrol celler og Lenti-mIR-130b celler (SW480 celler) fra tre uafhængige forsøg.

Underpanel

: Densitometri analyse af de Western blot data normaliseret med GAPDH (gennemsnit ± standardafvigelse .; n = 3; *,

P

0,05).

B Hotel (

en

), Relative udtryk for miR-130b (normaliseret til U6) i SW620 celler inficeret med Lenti-kontrol virus eller Lenti-miR-130 B-virus, undersøgt ved QRT-PCR (gennemsnit ± sd; n = 3). (

b

),

Overpanel

: Western blot analyser af integrin β1 udtryk i Lenti-kontrol og Lenti-miR-130 B-celler (SW620 celler) fra tre uafhængige forsøg.

Underpanel

: Densitometri analyse af de Western blot data normaliseret med GAPDH (gennemsnit ± standardafvigelse .; n = 3; *,

P

0,05).

C

, Protein udtryk for E-cadherin analyseret ved immunoblot i Lenti-kontrol celler og Lenti-miR-130 B celler fra tre uafhængige forsøg. De fire kolonier af Lenti-MIR-130b celler (SW480 celler) omtales 1,2,3,4. GAPDH anvendt som indlæsning kontrol.

D

, Ekspressionsniveauerne for integrin β1 (

en

) og E-cadherin (

b

) blev bestemt ved Western blot-analyser ved hjælp af de matchede de tilstødende kontrol væv ( N) tumorer (T) fra patienter de 3 kolorektal cancer (Patient 1, Patient 2, og Patient 3). Hvert assay blev uafhængigt gentaget tre gange. GAPDH anvendt som lastning kontrol.

For det første at undersøge, om miR-130b var i stand til at interagere med 3′-UTR af integrin β1, gennemførte vi en luciferase reporter analyser i SW480 celler. Den komplette 3′-UTR af integrin β1-gen blev klonet ind i pmirGlo Dual-luciferase reporter vektor. De SW-480-celler blev co-transficeret med pmirGlo vektor indeholdende 3′-UTR af integrin p1 og MIR-130B efterligner (fig. 4A), viste resultatet væsentligt lavere ekspression af luciferase sammenlignet med cellerne transficeret med den samme reporter vektor og kontrol microRNA efterligner (NC) (fig. 4a). Virkningen af ​​MIR-130b på luciferase ekspression blev elimineret, når den 3′-UTR af integrin β1 blev klonet i omvendt orientering (3′-ITGB1-rev) (fig. 4A). Dernæst at bekræfte reguleringen af ​​miR-130b til integrin β1 i CRC celler, testede vi integrin β1 proteinniveauet i cellerne transficeret med miR-130b efterligner og miR-130b inhibitor (Anti-miR-130b) henholdsvis (fig. 4B ). Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​integrin β1 undertrykkes efter transfektion med MIR-130b efterligner (fig. 4B (a)). Knockdown endogen MIR-130b med MIR-130b inhibitor øger integrin β1-ekspression (fig. 4B (b)). Tilsammen vores data antydet, at integrin β1 er et målgen af ​​MIR-130b.

A

, Den komplette 3′-UTR af integrin β1-genet (3′-ITGB1) var klonet i pmirGlo Dual-luciferase reporter vektor og co-transficeret med MIR-130b efterligner (MIR-130b) og styre mir efterligner (NC) ind i SW480 celler. En kontrolgruppe vektor blev genereret ved kloning af samme 3′-UTR af integrin β1-gen i omvendt orientering (3′-ITGB1-rev). Ildflue luciferase-aktiviteten blev målt og normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet (middel ± standardafvigelse .; n = 3; *, P 0,05).

B

, Western blot analyser af integrin β1 udtryk i SW480 celler transficeret med NC, miR-130B efterligner (

panel en

) og miR-hæmmer kontrol (Anti-NC) eller miR-130b inhibitor (Anti-miR-130b) (

panel b

) fra tre uafhængige forsøg. Densitometri analyse af Western blot data normaliseret med GAPDH (gennemsnit ± sd, n = 3; *,

P

0,05)

MIR-130b hæmmer celle migration og invasion. gennem nedregulering af ekspressionen af ​​integrin β1

for yderligere at undersøge, at undertrykkelse af integrin β1 af miR-130B resultater i forringet motilitet af Lenti-miR-130 B celler, vi udførte en integrin β1 redning eksperiment ved hjælp af Lenti- mIR-130B-celler. Vi anvendte en ekspressionskonstruktion, der koder for integrin β1 åben læseramme (β1-ORF), der mangler 3′-UTR [17], som giver et mRNA, der er resistent over for miRNA-medieret suppression. Vi observerede en klar stigning i integrin β1-ekspression i Lenti-MIR-130b celler transficeret med β1-ORF, sammenlignet med cellerne med kontrolvektor (fig. 5A). Desuden viste celle migration assays, at ektopisk ekspression af integrin β1-ORF var i stand til delvis udvinding af motilitet af Lenti-MIR-130B-celler med 76% (fig. 5B og 5C).

En

,

Venstre panel

: Western blot analyser af integrin β1 udtryk i Lenti-kontrol celler, Lenti-miR-130 B celler, Lenti-miR-130 B-celler transficeret med kontrol vektor eller β1-ORF vektor fra tre uafhængige forsøg.

Right panel

: Densitometri analyse af de Western blot data normaliseret med GAPDH (gennemsnit ± standardafvigelse .; n = 3; *,

P

0,05).

B, C

, Transwell migration analyser af cellerne (skala bar = 100 um, gennemsnit ± standardafvigelse .; n = 3; *,

P

0,05). Repræsentative billeder af migrerede celler er vist. Lenti-MIR-130b + styrevektor: De Lenti-MIR-130b celler transficeret med kontrolvektor. Lenti-MIR-130b + β1-ORF: De Lenti-MIR-130B-celler transficeret med β1-ORF vektor. ORF:. Åben læseramme

Vi efterfølgende hæmmet integrin β1 udtryk ved hjælp af en specifik siRNA [18] i SW-480-celler (figur 6A.). Vi fandt, at cellemigrering (fig. 6B) og invasion (fig. 6C) er bemærkelsesværdigt faldt gennem inhibering integrin β1-ekspression med en specifik siRNA. Derfor er faldet i cellemotilitet opnås ved undertrykkelse af integrin β1-ekspression. Samlet set viser disse resultater viste, at MIR-130b undertrykker cellemigrering og invasion, i det mindste delvist, ved nedregulering af integrin β1 i CRC-celler.

A

, Western blot-analyser vurderet proteinet niveau af integrin β1 i SW480-celler transficeret med et siRNA mod integrin β1 (p1 siRNA) eller negativ kontrol siRNA (Scramble) ved 20 nM og 50 nM. Hvert assay blev uafhængigt gentaget tre gange.

B, C

, Transwell migration (

B

) og invasion (

C

) analyser af SW480-celler transficeret med β1 siRNA eller Scramble på 50 nM (skala bar = 100 um, gennemsnit ± sd, n = 3; **,

P

0,01). Repræsentative billeder af migrerede celler (

B

) og invaderede celler (

C

) er vist.

Inverse korrelation mellem miR-130b og integrin β1 udtryk i CRC prøver

for yderligere at teste sammenhængen mellem integrin β1 og miR-130b, vi udvidet vores analyse i en kohorte af 33 matchede-par af kliniske tilstødende normal (N) og kolorektal tumorvæv (T). Vi analyserede ekspressionen af ​​MIR-130b ved QRT-PCR og ekspressionsniveauet af integrin β1 ved Western blot. Som vist i fig. 7, ved at sammenligne tumorer til normale væv, blev en omvendt korrelation mellem miR-130b og integrin β1 udtryk fundet i 23 ud af 33 (69,7%) par af kliniske prøver. Af de 23 par, viste 12 par den forøgede MIR-130b og den formindskede integrin β1; 11 par demonstrerede faldt MIR-130b og den forhøjede integrin β1.

Ekspressionen af ​​MIR-130b blev målt ved QRT-PCR, ekspressionen af ​​integrin β1 blev målt ved Western blot-analyse i en kohorte af 33 matchede -pairs af tilstødende normal (N) og tumor (T) væv. Den relative udtryk forholdet mellem miR-130b (normaliseret til U6) i T over N (T /N) var repræsenteret som en fold forskel (kolonner i mørkegrå). Den relative ekspression forhold mellem integrin β1 (normaliseret til GAPDH) i T over N (T /N) blev repræsenteret som en fold forskel (kolonner i lysegrå). middelværdi ± standardafvigelse. Hver assay blev uafhængigt gentaget tre gange.

Diskussion

MicroRNA 130b (miR-130b) er betydeligt dysreguleret i mange humane tumor-typer. Imidlertid er den rolle, miR-130b i CRC ikke godt forstået. I denne undersøgelse undersøgte vi den microRNA ekspression i kolorektal cancer (CRC) under anvendelse microRNA microarray profilering af tumorer og tilstødende normale vævsprøver. Vi identificerede 48 betydeligt differentielt udtrykte miRNA forbundet med CRC. MIR-130b er en af ​​de opreguleres miRNA. Disse data blev yderligere bekræftet ved QRT-PCR. For at teste de potentielle roller forøget ekspression af miR-130b i CRC, vi udførte funktionelle assays efter konstruere CRC cellelinje med stabil overekspression af miR-130b. Vores data viser, at MIR-130b udøver en signifikant inhiberende virkning på motilitet af CRC-celler (fig. 2), men ikke har nogen virkning på celleproliferation og apoptose. Det er blevet rapporteret, at i

TAp63

knockout musemodel, nedregulering af MIR-130b ved tabet af TAp63 resulterer i en stigning i tumormetastase [28]. Undertrykkelsen af ​​miR-130b af en p53 mutant resulterer i styrkelsen af ​​ZEB1-afhængige EMT og celleinvasion i endometriecancer celler [29]. Alle disse data antydede anti-metastatisk rolle MIR-130b. Derudover nedregulering af MIR-130b giver en multiresistent fænotype i ovariecancerceller [30]. en anden rapport har imidlertid antydet, at overekspression af miR-130b i CD133 (+) liver tumor-initierende celler øger deres selvfornyelse kapacitet og kemoresistens [31]. Disse resultater antyder, MIR-130b kan have en dobbelt funktion som en tumorsuppressor eller et onkogen, som afhænger af kræft type og cellulære kontekst.

I denne undersøgelse identificerede vi, at integrin β1 er et hidtil ukendt mål for miR-130b. Et lavere niveau af integrin β1 protein blev observeret på grund af overekspression af MIR-130b i CRC prøver (fig. 3D) og i CRC-celler (fig. 3A og 3B) samt. Luciferase reporter assay viste, at MIR-130b binder til 3′-UTR af integrin β1 og undertrykker dets ekspression (fig. 4). En stigning i MIR-130b af MIR-130b efterligner transfektion fører til reduceret ekspression af integrin β1, mens knockdown MIR-130b med MIR-130b inhibitor resulterer i øget integrin β1-ekspression. Endvidere er nedsat motilitet af MIR-130b overekspression celler reddet dels af ekspressionen af ​​integrin β1 mangler 3′-UTR (fig. 5). Derudover knockdown af integrin β1 giver også anledning til et fald i celle migration og invasion (fig. 6). Disse data viste, at MIR-130b undertrykker cellemigration og invasion af CRC-celler, i det mindste delvist, ved nedregulering af integrin β1. Desuden blev negativ korrelation mellem MIR-130B ekspression og integrin β1-ekspression fundet i 23 ud af 33 par (69,7%) af CRC kliniske prøver. Inhiberingen af ​​migrering og invasion af CRC-celler gennem direkte målretning af integrin β1 er i overensstemmelse med anti-metastatisk rolle foreslås for MIR-130b [28], [29]. En stor mængde eksperimentelle beviser støttede en vigtig rolle for integrin β1 under tumor induktion og invasivitet [32] – [36].