PLoS ONE: NuMA Overekspression i Epithelial æggestokkene Cancer

Abstrakt

Meget aneuploide tumorer er almindelige i epitelial ovariecancer (EOC). Vi undersøgte, om NuMA ekspression var forbundet med dette fænomen.

Numa proteinniveauer i normale væv og tumorvæv, ovarian cellelinjer og primære kulturer af maligne celler afledt fra æggestokkene ascitesvæsker blev analyseret ved Affymetrix microarray analyse, immunoblotting, immunhistokemi (IHC) og immunofluorescens (IF), med resultater korrelerede på tilknyttede kliniske data. Aneuploidi status i primære kulturer blev bestemt ved FACS-analyse. Salg

Affymetrix microarray data viste, at NuMA blev overudtrykt i tumorvæv, primære kulturer og cellelinier sammenlignet med normale ovarievæv. IHC afslørede lav til svag NuMA ekspression i normale væv. Ekspression blev opreguleret i tumorer, med en signifikant sammenhæng med sygdom stadium i mucinøse EOC undertyper (p = 0,009), lymfekirtelinvolvering (p = 0,03) og patienternes alder (p = 0,04). Yderligere analyse diskontinuerlige data viste, at høje Numa niveauer i tumorer faldt med bedømmelse (p = 0,02), men steg med sygdom etape (p = 0,04) i serøs EOC. NuMA udtryk faldt i slutningen af ​​sygdom stadie 4 endometrioide EOCs. Høje NUMA niveauer faldt med øget tumor invasion i alle undertyper (p = 0,03). IF af primære kulturer viste at høje Numa-niveauer ved mitosespindelen poler væsentligt var forbundet med en nedsat andel af celler i cytokinese (p = 0,05), øget binucleation (p = 0,021) og multinukleation (p = 0,007), og aneuploidi (p = . 0,008)

NuMA er stærkt udtrykt i EOC tumorer og høje Numa niveauer korrelerer med stigninger i mitotiske defekter og aneuploidi i primære kulturer

Henvisning:. Brüning-Richardson A, Bond J, Alsiary R , Richardson J, Cairns DA, McCormac L, et al. (2012) NuMA Overekspression i Epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 7 (6): e38945. doi: 10,1371 /journal.pone.0038945

Redaktør: J.Christopher stater, University of Louisville, USA

Modtaget: Januar 26, 2012; Accepteret: 14 maj 2012; Udgivet 14. juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Brüning-Richardson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde og Dr. Brüning-Richardson blev finansieret af Yorkshire Cancer Research [L328]. The University of Leeds understøtter Dr. Bond, Dr. Burns, Dr. Hall og Dr. Morrison. Dr. Bell er støttet af Breast Cancer Campaign [2007NovPR53], Dr. Alsiary af et stipendium fra den saudiarabiske Ministeriet for Videregående Uddannelser, Dr. Cairns af Medical Research Council UK [G0802416], Dr. McCormac af oncolytiske midler Biotech Inc, (Calgary, Canada) og Dr. Wilkinson og Dr. Hutson af Leeds universitetshospitaler NHS Trust. Dr. Bond, Dr. Burns, Dr. Wilkinson, Dr. Morrison og Dr. Bell holde midler fra Yorkshire Cancer Research, GDH fra Cancer Research UK, og Dr. Burns og Dr. Wilkinson fra Wellbeing af kvinder. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

238 kDa nukleare mitotiske apparat (NuMA) protein er en komponent i interfasen kernen og den mitotiske spindelpol matrix [1]. NuMA har funktioner i spindel samling gennem sin tilknytning til mikrotubuli motorer [2], [3] og i spindel positionering under asymmetrisk celledeling [4]. Der er foreslået et yderligere interfase rolle som et nukleart stillads protein [4] – [6]. NuMA udtrykkes ubikvitært [6], [7]. De nukleare og spindel pole lokaliseringer af NuMA er godt karakteriseret i normale væv [8], [9] og i tumorvæv ved immunhistokemi (IHC) i det humane protein Atlas. Den rolle, som mitotiske proteiner såsom NuMA kunne spille i kræft er for nylig blevet et emne af fornyet interesse, da det har vist sig, at aneuploidi er et fælles træk af tumorer, der kan drive deres progression [10], [11].

EOC er en kompleks sygdom, der er vanskelige at behandle i forbindelse med sene, recidiv efter behandling og høje kemo-resistens. Biologi EOC er dårligt forstået og forbedringer af diagnose og behandling er meget ønskeligt [12]. Ovariecarcinomer er ofte kendetegnet ved karyotyper med svær aneuploidi grund kromosomal ustabilitet (CIN) og triploidization [13]. Det er blevet foreslået, at aneuploidi er en funktion af tidlige afvigelser i EOC [14]. Aneuploid tumorer reagerer mindre positivt på behandling end diploide tumorer, hvilket fører til lavere overlevelsesrater [15].

NUMA1

gen maps til kromosom 11q13 [16], en region almindeligt forstærket i ovariecancer [17]. Men så vidt vi ved ingen publikationer har knyttet NuMA udtryk for aneuploidi i EOC. Vi analyserede NUMA niveauer i primære kulturer af maligne celler, der stammer fra æggestokkene ascitesvæsker, i deres tilknyttede tumorvæv, i væv fra ubeslægtede primære tumorer i æggestokkene og i normalt ovarievæv hjælp Affymetrix array analyse, slot blotting, IHC og immunofluorescens (IF). NuMA ekspression blev fundet at være opreguleret i tumorprøver sammenlignet med normale kontroller. HVIS analyse af primære kulturer identificeret en sammenhæng mellem øgede mængder af NuMA på spindel poler og satser for binucleation og multinukleation, mens FACS analyse viste en positiv sammenhæng mellem øget NuMA udtryk og aneuploidi. Denne undersøgelse viser for første gang, at NuMA udtryk er opreguleret i EOC, og at dette er forbundet med den aneuploidi set i denne kræft.

Resultater

Affymetrix Microarray Analyse

Undersøgelse af Affymetrix microarray data fra et panel af æggestokkene cancercellelinjer primære kulturer og tumorvæv viste, at NuMA var konsekvent overudtrykkes på transskriptionsniveau i sammenligning med normale ovarievæv. Kun to ascitiske prøver havde lavere ekspressionsniveauer sammenlignet med en intern normal kontrol (N) (figur 1A). Denne indledende arbejde antydede, at yderligere undersøgelse af NuMA udtryk i EOCs var berettiget.

A. Affymetrix data, der viser NuMA overekspression i 6 æggestokkene cellelinier (JAMA-2, Iove (yderligere udødeliggjort æggestokkene epitelial cellelinje), SKOV-3, TR175, OVCA-433 (ud) og 1847 (alle grå søjler, betegnet CL) , 38 prøver af primære celler dyrket fra ascitesvæsken (sorte bjælker, der er udpeget – A, herunder nogle prøver med på hinanden følgende samlinger eller passager) og 4 primære kulturer etableret fra tumorvæv (betegnet T1 til – T4) A1, A2 og A4 er. tumorvæv (T1, T2, T4) i forbindelse ascites prøver. intensitetsværdier opnået for prøverne blev normaliseret til en intern kontrol (normal epitelial ovarievæv (N)) og genekspressionsniveauer er vist som forholdet mellem intensitetsniveauer /styre intensitetsniveau som log10 værdi. B. Numa niveauer i cellelysater. et repræsentativt eksempel på en lysater analyseret for NuMA udtryk ved slot blot Sort * indikerer æggestokkene cellelinier (1847, TR175, JAMA-2), brun asterix den neuroblastomcellelinje SH- SY5Y, pink asterix colon adenocarcinom cellelinie SW480, blå asterix den cervikale cancercellelinie HeLa, og gul asterix brystkræft MCF7. Alle andre prøver er lysater fra æggestokkene primære kulturer. C. Histogram sammenligne Numa niveauer i æggestokkene cellelinjer, en primær cellelinie afledt fra en godartet gynækologisk lidelse (1153-A1) og primære kulturer efter normalisering mod α-tubulin. D. afdeling normal (N) i æggestokkene epitel og stroma væv og matches ovariecancer (Ca) ved x10 og x40 forstørrelse efter NuMA immunfarvning. Pile viser epitelceller. Lav til medium niveau af nuklear NuMA farvning kan ses i de normale epitelceller, med højere niveauer af nukleare NuMA farvning i æggestokkene kræft epitelceller. E. Analyse af en lille æggestokkene TMA viser, at NuMA farvningsintensitet stiger med kvalitet i æggestokkene tumorvæv.

Slot Blotting

I alt 35 prøver blev analyseret af slot blotting. Denne kohorte bestod af 7 etablerede cellelinjer (JAMA-2, TR175, 1847, SW480, MCF-7, HeLa og SH-SY5Y), en godartet prøve (1153-A1) og 25 primære kulturer. Lysater hidrørende fra 2 ovarie tumorvæv dyrkes i vævskultur (BE4163-T1 og AQ70880-T1) var også inkluderet. Et repræsentativt eksempel på en slot-blot-billede af nogle af prøverne er vist i figur 1B. Normalisering mod en intern α-tubulin kontrol bekræftede, at der var forskel på Numa proteinniveauer mellem de testede prøver (figur 1C). Blandt cellelinjerne 1847 havde den højeste NuMA ekspressionsniveauet, efterfulgt af TR175 og JAMA-2. Den godartede prøve 1153-A1 havde en mellemlang NuMA niveau, mens der var variation blandt de primære ascites kulturer med 3 (1141-A1, 1134-A1 og AE6792-A1), der udtrykker de højeste Numa niveauer af alle prøver. Ingen signifikant sammenhæng mellem NuMA immunoblotting resultater og de tilknyttede kliniske data blev set. Beroligende, Numa protein niveauer i almindelighed svarede godt med RNA ekspressionsniveauerne set i de primære kulturer og æggestokkene cellelinjer undersøgt af Affymetrix microarray analyse.

Immunhistokemi

Immunfarvning viste, at NuMA udtryk i hele sektioner af normale ovarievæv var variabel, lige fra meget lav til svage niveauer i stromale og epiteliale cellekerner (n = 7) (figur 1D). For de 5 tilfælde af normalt væv med tilhørende tumorvæv blev en klar stigning i NuMA ekspression i 40% (2/5) af tumorprøver identificeret. Op til 95% af kerner i primære tumorer vises medium til stærk NuMA farvning (Figur S1a-d). NuMA blev også observeret ved spindelen poler af mitotiske tumorceller (fig S1B, pil). Analyse af en lille internt genereret æggestokkræft TMA afslørede, at 95% af tumor cellekerner var positivt farvet for NuMA i 24 af 25 kerner. Slående, analyse af data efter anvendelse af et pointsystem, der opdelt prøver i lav NuMA (alle negative, meget svage og svage scores) og høje Numa niveauer (medium og high scores) viste, at høje Numa niveauer kun blev påvist i grad 3 tumorer (33%, figur 1E). Farvning af et større æggestokkene TMA bekræftede lav og høj NuMA ekspression blandt kernerne (figur 2). Indledende analyse af de samlede data, uanset kræft undertype viste, at høje Numa niveauer steget med tumor bedømmelse (fra 20,3% til grad 1 tumorer til 24,1% for grad 3 tumorer,

s

= 0,0016) og sygdom etape (en stige fra 19,6% for fase 1 til 33,3% for fase 4,

s

= 0,0077) (data ikke vist). Analyse af kontinuerte data for tumor kvalitet og sygdom etape, som omfattede inddeling i kræftformer for der var til rådighed (serøs, mucinøs og endometrioide) nok data, viste, at NuMA udtryk korreleret med stigende kvalitet i mucinøs undertype (

s

= 0,009) (figur 3A). En signifikant sammenhæng med lymfeknude involvering (

s

= 0,03) (figur 3B) og alder (

s

= 0,04) (Figur 3C) blev set i alle undertyper. Yderligere analyse af resultaterne som diskontinuerte data (lav NuMA vs høj NuMA) afslørede yderligere statistisk signifikante associationer. Andelen af ​​prøver med høje Numa niveauer faldt med bedømmelse (

s

= 0,02) (Figur 3D) og steg i slutningen af ​​sygdom etape i serøs EOC (

s

= 0,04) (Figur 3E) . I mucinøse EOCs, Numa niveauer steg med bedømmelse (

s

= 0,005) (figur 3F). I den sene endometrioide EOCs, NuMA ekspression faldt (figur 3G) og høj NuMA faldt med en stigning i tumorinvasion status (

s

= 0,03) (alle undertyper) (figur 3H). Lav NuMA ekspression blev observeret i hele prøven befolkning på 13 klare celle EOCs uanset sygdom scenen.

Lave og høje Numa farvede mønstre observeret i borekerner fra serøs, mucinous, endometrie og klare celle karcinomer i stor skala i æggestokkene TMA. Forstørrelse x10.

A. Statistisk analyse af det store ovariecancer TMA viser NuMA ekspression stiger med sygdom fase i mucinøs subtype. B. NuMA ekspression er forbundet med lymfekirtelinvolvering (T3cN1MO) (alle undertyper). C. NuMA ekspression er forbundet med patientens alder (alle undertyper). D. Høje niveauer af NuMA falde med tumor lønklasse i serøs undertype. E. High NUMA niveauer er forbundet med stadium 4 sygdom i serøse EOCs. F. High NUMA niveauerne stiger med tumor klasse i mucinous EOCs. G. High NUMA niveauet falder med sygdom etape i endometrioide EOC. H. Høj NUMA niveauet falder med tumor invasion status (T1 til T3) (alle undertyper).

Immunofluorescens Analyser

HVIS analyse afsløret eksistensen af ​​en interfase nukleare NuMA farvning mønster i alle cellelinier, en primær kultur tilpasset som en cellelinie (GYNA0089) og 23 primære kulturer (figur 4A, B). I mitose blev NuMA findes på spindel poler (Figur 4C) i alle cellelinjer og primære kulturer undersøgt. Tilstrækkeligt antal mitotiske celler til yderligere analyse blev identificeret i 16 primære kulturer. I disse prøver blev delende celler undersøgt for mitotisk stadieinddeling og tilstedeværelsen af ​​specifikke mitotiske defekter. Endelig blev en undersøgelse af interfase indikatorer for aneuploidi udført i alle prøver.

A. Eksempler på interfase kerner med lav (a-d) og høj (e-h) Numa niveauer, og mitotiske spindler med lav (i-l) og høj (m-p) Numa niveauer ved spindel poler. Grøn – NuMA, rød – a-tubulin, blå – DAPI. Scale bar = 5 um. B. Histogram sammenligne Numa nuklear fluorescens farvningsintensiteter i fire ovariale cellelinier, en cellelinje etableret ud fra en primær kultur (GYNA0089) og 23 primære kulturer afledt fra ascitesvæske. C. Histogram sammenligne Numa farvningsintensiteter på spindel poler i delmængden af ​​cellelinier og kulturer, hvor et tilstrækkeligt antal mitotiske celler var til analyse.

farvningsintensiteter afveg blandt prøverne (Figur 4). Det blev bemærket, at nogle prøver blev sammensat af celler med lavt niveau NuMA farvning i interfase kerner og ved mitosespindelen poler (figur 4A, a-d og i-l; 4B, C) og nogle prøver bestod af celler med høj NuMA farvning intensiteter (figur 4A, e-h og m-p; Figur 4B og C). Vi bemærkede også, at hver prøve adskilte sig med hensyn til andelen af ​​celler i hver mitotiske fase, og at de udviste en bred vifte af mitotiske defekter. Disse omfattede metafase defekter, såsom trepolet og multipolære spindler (figur 5A, a-d) og spindel forskydning (figur 5A, e); anafase defekter såsom tilbagestående kromosomer og kromosomale bridging (figur 5B, a-c); og cytokinetic defekter herunder kromatid brodannelse og generering af ujævnt dimensionerede datterceller (figur 5C, a-d). Binucleation, multinukleation og tilstedeværelsen af ​​mikrokerner var almindelige mangler i interfaseceller (figur 5D, a-c). De i figur 5E eksempler var de mest almindelige mitotiske fejl observeret.

A. Mitotiske fejl observeret ved metafase inkluderet (a) asymmetriske bipolære spindler (b) flere spindel poler, (c) tripolær spindler, (d) bipolære spindler med flere spindel poler (e) celler med fejlplacerede og misvisende spindler (celle periferi skitseret). B. Mitotiske defekter observeret ved anafase inkluderet tilbagestående kromosomer og anafase bridging (en -c). C. Mitotiske defekter observeret under telofase og cytokinese inkluderet (a) unormale spindler, (b) unormal cytokinese med mikrokerner dannelse, (c), kromatid bridging og (d) dannelse af ujævnt mellemstore datterceller. D. Eksempler på (a) binucleation, (b) multinukleation og (c) mikrokerner i primære kulturer. Grøn – NuMA, rød – a-tubulin, blå – DAPI i alle paneler. Scale bar i A og B = 5 um. Scale bar i C og D = 10 um. E. Pie illustrerer den samlede hyppighed af mitotiske defekter observeret i de primære kulturer.

En sammenligning af Numa farvningsprofiler at Mitotiske data blev udført. Høje niveauer af NuMA i interfase kerner blev signifikant associeret med en lille andel af celler i telofase (

s

= 0,012) og en høj andel af celler viser en løs metafaseplade (

s =

0,032 ) (figur 6A og B). Høje niveauer af NuMA på mitosespindelen poler signifikant korreleret med høje binucleation (

s =

0,021) og multinukleation (

s =

0,007) (Figur 6C og D) og igen med løs metafase plader (

s =

0,041) (figur 6E). Lave niveauer af NuMA på spindel poler signifikant korreleret med en høj andel af celler i cytokinese (

s =

0,05) (Figur 6F). Interessant, mellemliggende niveauer af NuMA på spindlen poler signifikant korreleret med lave fejlprocenter i cytokinese. (

s =

0,01) (Figur 6G). For yderligere at verificere de observerede i vores immunofluorescensanalyse af de primære kulturer vi immunofarvede hele sektioner af fast tumor væv fra de 23 patienter, hvis ascitiske væsker blev anvendt til at generere kulturerne data. Dette bekræftede, at faste tumorer udviser høje niveauer af NuMA farvning genereret primære ascitiske kulturer, hvor cellerne viste høj Numa ekspressionsniveauer (Figur S1 a-d). For at sikre, at den observerede interfase og mitose defekter var også et fælles træk for de tilknyttede tumorvæv vi analyseret 23 tumor sektioner til rådighed for os ved NuMA immunfarvning og H E IHC farvning. Vi bemærkede, at de samme interfase og mitotiske defekter var til stede i disse tumorer som i ascites prøver. Repræsentative billeder og en sammenfatning af de observerede blandt prøverne defekter er vist i figur S2A-D. Endvidere blev cellekulturer med stor mitotisk indeks sig at udvise høj mitotisk aktivitet i den tilknyttede tumorvæv (figur S3). Endelig har vi undersøgt sammenhængen mellem Numa ekspressionsniveauerne i primære kulturer og patient overlevelse. Dette antydede, at patienter med moderat til stærk NuMA immunofarvning på spindlen poler i primære kulturer har en lavere overlevelsesprocent end patienter med svag NuMA immunfarvning, selvom dette foreløbige data ikke nåede statistisk signifikans (fig S4), måske på grund af lav prøvestørrelse.

Stærk nukleare NuMA udtryk var forbundet med (a) den laveste andel af telofase celler og (B) den højeste andel af celler med en diffus metafaseplade. Stærk NuMA spindel pole mærkning var forbundet med høje (C) binucleation, (D) multinukleation, (E) en diffus metafaseplade og (F) den laveste andel af celler i cytokinese. (G) Mellemprodukt spindelpol-farvning var forbundet med den laveste andel af celler, der udviser en cytokinese defekt. (H) FACS-analyse viste, at kun celler med høje niveauer af NuMA var aneuploid.

FACS

FACS-analyse viste, at kun celler fra primære kulturer med høj Numa spindelpol farvningsintensiteter var aneuploid (Figur 6H), en statistisk signifikant observation (

s =

0,008).

diskussion

I dette studie vi havde til formål at undersøge

NuMA1

udtryk i EOC og relatere dette til aneuploidi findes i denne kræfttype. En indledende Oncomine søgning viste, at NuMA ekspression er opreguleret i EOC. Vores pilot data genereret af Affymetrix profilering foreslog også, at

NuMA1

udtryk blev opreguleret i kræft i æggestokkene. Vi bekræftede denne observation på proteinniveauet ved IHC, at bemærke, at den nukleare NuMA var til stede ved lave niveauer i kerner af normal ovarie stroma og epithel mens æggestokkene primære tumorer havde forhøjede Numa niveauer. Høje niveauer af NuMA var forbundet med tumorklassificering, sygdomsstadie, og lymfeknudeinvolvering og omvendt til tumorinvasion. Men NuMA udtryk afveg blandt de fire store EOC undertyper. Betragtninger NUMA niveauer faldt med tumor kvalitet og øget med sygdom etape i serøs undertype, steg med tumor lønklasse i mucinøs undertype og faldt med sygdom fase i endometrioide undertype. I den klare celle undertype blev kun observeret lave niveauer af NuMA. Disse forskelle vil sandsynligvis afspejle den molekylære heterogenitet EOCs. For nylig har EOCs reklassificeret i henhold til deres molekylære funktioner i type I (lav kvalitet serøs, lav kvalitet endometrioide, alle mucinøse og klare celle karcinomer) og type II (høj kvalitet serøse og endometrioide karcinomer) med mutationer primært i

KRAS

og

PTEN

i type i og mutationer i

TP53

i type II [25], [26]. NUMA niveauer i vores undersøgelse var højest i type I EOCs (lav kvalitet serøse og mucinøse kræft), hvilket tyder på NuMA overekspression kunne være en tidlig begivenhed i carcinogenese.

Maligne celler afledt ascitesvæsker er blevet anvendt i fortiden for at generere et væld af oplysninger om immunologi og sygdomsbehandling i EOC og det er blevet foreslået, at deres anvendelse kunne supplere konventionelle diagnostiske procedurer [27]. Her IF undersøgelse af de primære kulturer tilladt en roman og detaljeret undersøgelse af tegn på aneuploidi gennem identifikation af både specifikke mitotiske fejl og interfasen konsekvenser af sådanne defekter. Interessant, fandt vi, at høje Numa niveauer på spindel poler var forbundet med høje niveauer af binucleation og multinukleation. Udviklingen af ​​tetraploidy som følge af mislykkedes cytokinese udgør en potentiel tidlig hændelse i udviklingen af ​​kromosomal ustabilitet (CIN) og til sidst aneuploide karyotyper i tumorceller [10]. De mitotiske mangler, at vi observeret i vores primære kulturer, såsom multipolære spindler og defekter i cytokinese, kunne forklare forekomsten af ​​binucleated og flerkernede celler i disse prøver. Konsistent med dette har vi også fundet en statistisk signifikant korrelation mellem aneuploidi og høje niveauer af NuMA på spindlen poler i vores kulturer.

Efter at have fastslået, at NuMA proteinniveauer opreguleres i EOC og at dette er forbundet med aneuploidi, det næste skridt vil være at bestemme den funktionelle medvirken af ​​NuMA i udviklingen af ​​denne aneuploidi. Arbejde fra andre forskere har vist, at betingede udtryk for NuMA i en mus myeloide celle line resultater i aneuploidi og apoptose [28]. Det blev foreslået, at NuMA overekspression alene ikke er tilstrækkeligt til at drive malign transformation i leukæmiceller, men at den kan bidrage til kromosomalt ustabilitet, hvilket tillader genetiske hændelser fremmer cellecyklusprogression eller beskyttelse mod apoptose at forekomme. En sådan begivenhed kunne være erhvervelsen af ​​p53 mutationer, såsom dem observeret i høj kvalitet serøse carcinomer [29]. Alternativt NuMA interagerer med motoren protein dynein under mitose og det er blevet foreslået, at mætning af dynein aktivitet ved NuMA overekspression kunne antagonisere veje at kræftceller bruge til at løse problemer såsom multipolære spindler. Disse opstår typisk på grund af tilstedeværelsen af ​​overtallige centrosomer, fører til en stigning i genomisk ustabilitet drevet af defekter i mitose [30]. Denne hypotese kan gælde for EOC siden de biologiske konsekvenser af multipolære celledelinger er i overensstemmelse med de observerede i vores immunofluorescens arbejde resultater. Centrosomal amplifikation er også blevet bemærket tidligere i EOC-celler og er blevet forbundet med aneuploidi og dårlig patient resultat i serøs EOC. Dette fænomen synes at være forårsaget af overekspression af Aurora-A, et medlem af serin /threonin-kinase familien involveret i mitotiske hændelser [31], [32].

Tumorantigenet acrosin bindende protein (ACRBP) /OY-TES-1, er blevet vist at interagere med NuMA. En co-afhængige forhold med en rolle i paclitaxel modstand i EOC er blevet foreslået [33]. NuMA overekspression blev foreslået at forårsage mitotiske perturbationer nødvendige for plasticitet præneoplastiske genom, med co-udviklende overekspression af ACRBP som tumorer fremskridt kørsel erhvervelse af egenskaber til en normalisering af disse tidlige perturbationer, som ellers kunne være uheldig for cancercelleproliferation ved at fremme mitotisk katastrofe. Den samme undersøgelse viste også, at de fleste aggressive sygdom blandt en kohorte af EOC patienter var forbundet med kombineret høje niveauer af ACRBP og NuMA. Muligheden for, at NuMA overekspression virker synergistisk med Aurora-A og ACRBP overekspression at fremme aneuploidi, dårlig overlevelse og kemoresistens i EOC er spændende og værdig yderligere undersøgelse. Som en del af dette, er vores foreløbige data tyder på, at NuMA ekspressionsniveauerne forbundet med overlevelse i EOC vil blive undersøgt yderligere i en større prøve indstillet til at afgøre, om dette fænomen er statistisk signifikant.

Som konklusion, vores data viser for første gang, at NuMA er overudtrykt i EOC og at høje Numa niveauer korrelerer med øget mitotiske defekter og aneuploidi i ascites kulturer afledt fra patienter med tumorer i æggestokkene.

Materialer og Metoder

cellelinjer og primære kulturer af maligne celler afledt fra æggestokkene ascitesvæsker

cellelinjer der anvendes i dette projekt omfattede fire æggestokkene kræft cellelinier (JAMA-2, SKOV-3, TR175 og 1847), en neuroblastomcellelinje (SH-SY5Y) , en colonadenocarcinomcellelinje (SW480), en cervikal cancer cellelinje (HeLa) og en brystcancer-cellelinie (MCF7). Cellelinjer blev opnået fra Cancer Research UK, ECACC og ATCC Cell Biology Collection. Primære kulturer af celler afledt fra æggestokkene ascitesvæsker (GYNA0089), ovariale tumorvæv (BE4163-T1 og AQ70880-T1) eller godartede tumorer (1153-A1) blev etableret som tidligere beskrevet [18]. Patientinformation og kliniske data for de ovariale ascitesvæsker er tidligere blevet beskrevet [18].

Normalt æggestokkene og Tumor Tissue

Patologiske prøver af formalinfikserede, paraffinindlejrede væv, der består af sektioner af normal ovarie væv og primære tumorer (herunder tumorer, der produceres ascites hvorfra primære kulturer var forberedt) blev opnået fra St. James ‘Universitetshospital Histopatologi Archive, Leeds. Syv normale væv var til rådighed, hvoraf 5 havde også forbundet tumorprøver. opnåedes alt 23 tumorvæv matchende primære kulturer afledt af maligne celler. Yderligere 25 ubeslægtede primære ovarietumorer med tilhørende kliniske data blev identificeret og anvendt til at skabe et internt mini tissue microarray (TMA). TMA består af 9 serøse adenokarcinomer, 6 endometrioide carcinomer, 2 mucinøse, 2 blandet mullerian, 5 blandet serøs og endometrioide, og en adenocarcinom. En høj tæthed ovariecancer TMA bestående af 280 tilfælde af ovarie adenocarcinom (serøs, mucinøs og endometrioide), 13 klar celle karcinom, en overgangsordning celle karcinom, 20 tilstødende normale væv og 8 normale væv i to eksemplarer, med scenen og kvalitet oplysninger blev indhentet fra Tissue Array Networks (OV6161, Tissue Array Network). Ledsagende kliniske data inkluderet patientens alder, lymfeknude involvering, tumor invasion og metastase.

Patient data

Associerede kliniske oplysninger om patienter, for hvem primære kulturer af maligne celler, der stammer fra æggestokkene ascitesvæsker blev etableret, blev beskrevet tidligere [18].

Affymetrix Profilering

data til æggestokkene cellelinjer, primære kulturer og tilhørende tumorprøver blev hentet fra en genekspression microarray analyse, genereret med GeneChip HG-U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix), som var normaliseret ved anvendelse MAS 5,0 som tidligere beskrevet [18].

Antistoffer Salg

NuMA monoklonale antistof Ab-2 (klon 107-7, Calbiochem) blev anvendt i hele denne undersøgelse . Dette har tidligere været udbredt anvendt til Western blotting, immunfluorescens og IHC [19], [20]. For IF undersøgelser rotte-anti-α-tubulin-antistof (1/500, MCA77G, Serotec) blev anvendt til at identificere mikrotubuli og 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI 5 pg /ml, Sigma-Aldrich) anvendt til at farve DNA .

Slot blotting

Slot blotting af cellelysater blev udført som tidligere beskrevet [18]. 0,01 mg prøve blev lagt i hver brønd og NuMA monoklonale antistof Ab-2 blev anvendt ved et 1/400 fortynding.

TMA Construction

For at oprette en in-house æggestokkene TMA en protokol beskrevet af Abd El-Rehim

et al

[21] blev fulgt. Manuelle væv arrayer slag med en diameter på 0,6 mm (Beecher Instruments, Inc) blev brugt til at skabe kernerne.

Immunhistokemi

Slides indeholder hele sektioner eller TMA kerner blev blokeret med 3% H

2O

2 i methanol efter de-voksning og rehydrering. Antigen-genvinding blev udført ved tryk tilberedning slides i 2 minutter i antigen demaskering Solution (lav pH, Vector Laboratories). Efter tre 5 minutters vask i TBS-Tween-20 (0,2%) blev objektglassene blokeret i 10 minutter med 10 × casein (Vector Laboratories) fortyndet 1:02 i destilleret vand. Efter tre 5 minutters vask med TBS-Tween 20 objektglassene indeholdende hele sektioner blev anbragt i Shandon sequenzer enheder henviser objektglas indeholdende TMA snit blev lagt fladt inde i en befugtet inkubation kammer til inkubation med det primære antistof. NuMA antistof Ab-2 fortyndet i antistofopløsning (Zymed) blev påført på 1/300 for hele sektioner og 1/100 for TMA lysbilleder. Objektglas blev inkuberet natten over ved 4 ° C. Efter tre vaske med 5 minutter hver med TBS-Tween-20 blev objektglassene inkuberet i 100 pi HRP kanin /mus REAL ™ EnVision ™ (DAKO) i 30 minutter i sequenzer enheder eller inkubation kammer. Efter tre endelige vaske med TBS i 5 minutter blev fremkalderopløsning (DAB + chromagen /substrat-buffer, DAKO) tilsat i op til 10 minutter, indtil farveudvikling var fuldstændig. Farvning blev intensiveret i 0,5% CuSO4 (i 0,9% saltvand) i 5 minutter. Efter modfarvning i hæmatoxylin i 2 minutter, blev sektionerne dehydreret og monteret i DPX (Sigma). TMA billeder blev scannet og analyseret ved hjælp af Aperio ImageScope Viewer software. Slides indeholder hele sektioner blev set med et Olympus BX61 mikroskop med Colourview kamera og CellP® software. En mærkning scoringssystem, der anvendes to scoring kriterier, blev udnyttet [22]. Først blev antallet af farvede kerner tælles og udtrykt som en procentdel af det samlede antal kerner i vævssnittet eller kerne. For det andet blev den fremherskende nukleare udtryk intensitet scoret som 0 – ingen farvning, 1 – spor, 2- svag, 3- medium og 4 stærke. Det endelige resultat blev beregnet som procentdelen af ​​farvede kerner multipliceret med den fremherskende udtryk intensitet.