PLoS ONE: Mekanismer for GOLPH3 associeret med udviklingen af ​​mavekræft: en foreløbig undersøgelse

Abstrakt

Study Design

For at undersøge de specifikke mekanismer, hvormed Golgi phosphoprotein 3 (GOLPH3) påvirker udviklingen af ​​mavekræft og til at udforske dens kliniske betydning.

fremgangsmåder

Immunhistokemisk analyse blev anvendt til at evaluere de korrelationer mellem GOLPH3, phosphoryleret mTOR (p-mTOR), phosphoryleret Akt (p-Akt), phosphoryleret p70S6 (p-p70S6), phosphorylerede 4E-BP1 (p-4E -BP1) og de klinisk-patologiske træk ved gastrisk cancer. MRNA ekspressionsniveauer af GOLPH3, mTOR, Akt, p70S6 og 4E-BP1 i gastrisk cancer, carcinom-tilstødende og parret normalt væv blev analyseret under anvendelse af RT-PCR. Western blotting blev anvendt til at bestemme protein ekspression af GOLPH3, p-mTOR, p-Akt, p-p70S6 og p-4E-BP1 i væv.

Resultater Salg

Høj ekspression proteinniveauer af GOLPH3, p-AKT, p-mTOR, p70S6 blev p-4E-BP1 positivt forbundet med histologisk bedømmelse (

s

0,05), dybde invasion (

s

0,05 ), fjernmetastaser (

s

0,05) og lymfeknude involvering (

s

0,05). Sammenlignet med carcinoma-tilstødende og parrede normale væv, de mRNA ekspressionsniveauer for GOLPH3, AKT, mTOR, p70S6 og 4EBP1 i gastrisk kræft væv var væsentligt højere. Protein ekspressionsniveauer af GOLPH3, p-AKT, p-mTOR, p-p70S6 og p-4E-BP1 i gastrisk cancer væv var også signifikant højere end i carcinoma-tilstødende og parrede normale væv. blev observeret en stærk positiv korrelation mellem GOLPH3, p-mTOR, p-p70S6 og p-4EBP1 udtryk (

r

= 0,410, 0,303 og 0,276 henholdsvis

s

0,05), men ingen signifikant korrelation mellem ekspressionen af ​​GOLPH3 og p-Akt blev observeret.

konklusioner

GOPLH3 ekspressionsniveauet er stærkt korreleret med Akt /mTOR-signalering i humane gastrisk kræft prøver. GOLPH3 kombineret med Akt /mTOR signalering aktivering kan spille en vigtig rolle i udviklingen, differentiering, invasion og metastase af mavekræft

Henvisning:. Peng J, Fang Y, Tao Y, Li K, Su T, Nong Y, et al. (2014) Mekanismer for GOLPH3 associeret med udviklingen af ​​mavekræft: en forundersøgelse. PLoS ONE 9 (10): e107362. doi: 10,1371 /journal.pone.0107362

Redaktør: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan

Modtaget: Juni 13, 2014, Accepteret: August 7, 2014; Udgivet: 6 okt 2014

Copyright: © 2014 Peng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. er tilgængelige fra manuskriptet og tallene Alle data

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Research Foundation of Guangxi Sundhed Passende teknologi og udvikling Project (Grant nummer: S201415-01). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selvom globale statistikker viser, at mavekræft (GC) er den fjerde mest almindelige kræftform hos mænd og den femte mest almindelige kræftform hos kvinder, dødeligheden fra mavekræft andenpladsen kun overgået af lungekræft [1]. Den globale forekomst af mavekræft har været faldende siden Anden Verdenskrig [2]. Men i udviklingslande, herunder Kina, sygelighed og dødelighed af mavekræft har fortsat høj. Gastrisk kræftbehandling er forbedret i de seneste år, men de fleste patienter er stadig diagnosticeret med fremskreden mavekræft ofte herunder invasion og fjernmetastaser, hvilket fører til en utilfredsstillende behandlingseffekt sats. Fordi mavekræft udgør en væsentlig trussel mod menneskers sundhed og liv, er det afgørende at forstå patogenesen af ​​mavekræft i processen med tumorigenese, invasion og metastase til at guide tidlig diagnose og behandling.

Det er almindeligt accepteret, at tumordannelse involverer fejlagtig regulering af talrige onkogener, tumorsuppressorgener og metastase-relaterede gener Golgi phosphoprotein 3 (GOLPH3), som også er kendt som GPP34, GMx33 eller MIDAS, er en 34-kD membranprotein, som oprindeligt blev identificeret i musen Golgi apparatet ved proteomanalyse [3]. GOLPH3 hører til Golgi matrixprotein familie, som er stærkt bevaret fra gær til mennesker [4]. Efter GOLPH3 er blevet translatorisk modificeret, er det dynamisk forbundet til den negative Golgi matrix, hurtigt transporteres gennem trans-Golgi netværket (TGN) til cytoplasmaet, og fordeles i plasma membran vesikler og endokrine celler [4]. Flere undersøgelser har vist, at GOLPH3 er involveret i anterograd og retrograd Golgi trafficking, receptor genanvendelse, og glycosylering fra Golgi apparatet til plasmamembranen; GOLPH3 spiller også en rolle i cytoskeletale interaktioner og vedligeholdelse af Golgi strukturen [4] – [7]. Scott et al. først identificeret den onkogene rolle GOLPH3 ved at afsløre sin vigtige rolle i tumor celledifferentiering og proliferation og dens tilstedeværelse i mange faste cancere [8]. Interessant, har nogle undersøgelser antydet, at GOLPH3 regulerer kræftceller ved at øge pattedyr mål for rapamycin (mTOR) aktivitet. mTOR er en serin /threoninproteinkinase og en nøgle integrator af phosphatidyl-inositol-3-kinase (RTK-PI3K) baner vides at regulere cellevækst, proliferation og overlevelse i humane cancerceller [9] – [10]. Mange undersøgelser undersøger i øjeblikket forholdet mellem GOLPH3 og flere solide kræftformer Men der er tilstrækkelige beviser til at understøtte den hypotese, at GOLPH3 udtryk er forbundet med menneske mavekræft progression og prognose, og det mekanistiske grundlag af hvilke GOLPH3 påvirker tumorigenese, invasion og metastase af mavekræft stadig uklar. I denne undersøgelse undersøgte vi kliniske betydninger af GOLPH3 og AKT /mTOR signalering i mavekræft. I mellemtiden har vi opdagede forholdet mellem GOPLPH3 og Akt /mTOR signalering i mavekræft at afsløre potentielle rolle GOLPH3 i reguleringen mTOR-medieret mavekræft tumorigenese, invasion og metastase.

Materialer og metoder

Etisk erklæring

Alle procedurer studie blev gennemgået og godkendt af Institutional Ethics Review Board af First Affiliated Hospital i Guangxi Medical University og gennemføres i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Informeret samtykke blev fritaget af bestyrelsen på grund af de friske prøver blev håndteret og anonymiseret efter etiske og juridiske standarder.

Vævsprøver og kliniske data udvælgelse

De friske vævsprøver blev indsamlet fra firs patienter med mavekræft, der gennemgik kirurgisk behandling på First Affiliated Hospital i Guangxi Medical University i perioden fra januar 2012 til januar 2013. kræft og carcinoma-tilstødende væv (3 cm afstand fra kræft) og parrede normale væv blev opnået fra hver patient , og patienten blev diagnosticeret uafhængigt af to erfarne patologer i henhold til amerikanske Blandede kræft kriterier [11]. Fuldstændige oprindelige kliniske data var tilgængelige for patienter diagnosticeret med mavekræft. Gruppen omfattede 36 hunner og 44 hanner, med en gennemsnitsalder på 55,4 ± 13,1 år (spændvidde 27-75 år). Yderligere patientkarakteristika er vist i tabel 1, tabel 2 og tabel 3. Patienter, der får kemoterapi eller strålebehandling før kirurgi eller som havde en historie af andre tumorer blev udelukket. I de følgende undersøgelser, en del af prøven taget under kirurgi blev straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevares derefter ved -80 ° C, og en portion blev fastsat til 10% pufret formalin i 24 timer og indlejres i paraffin.

Immunhistokemi

paraffinindstøbte prøver blev opdelt i 3-um-tykke sektioner fra kræft, carcinoma-tilstødende, og parret normale vævsprøver og monteret på glas lysbilleder. Snittene blev oprindeligt bagt ved 65 ° C i 2 timer. Derefter blev snittene afparaffineret i 100% xylen og rehydreret i en faldende ethanol serie (100%, 90%, 80% og 70% ethanol) og destilleret vand i overensstemmelse med standardprotokoller. Derefter blev snittene dyppet i citrat antigene hentning puffer, opvarmet i en autoklave, og fik lov til at afkøle til stuetemperatur. Når alle dele blev vasket i PBS tre gange i fem minutter blev 3% hydrogenperoxid tilsat for at blokere endogen peroxidase-aktivitet og ikke-specifik antigenbinding ved stuetemperatur i 20 min. Efter vask igen med PBS blev snittene inkuberet med et specifikt antistof i et fugtigt kammer natten over ved 4 ° C. De følgende primære antistoffer blev anvendt: GOLPH3 antistof ved 1:100, p-mTOR antistof ved 1:200, p-Akt antistof ved 1:200, p-p70S6 antistof ved 1:100, og p-4E-BP1 antistof ved 1 :200. For den negative kontrol blev det primære antistof erstattet med PBS, og blev udført de resterende trin som tidligere beskrevet. Prøverne blev derefter vasket med PBS, og en polymer-forstærkende middel blev tilsat til afsnittene ved stuetemperatur i 20 min. Efter vask blev vævssnittene behandlet med HRP-mærkede gede-anti-kanin IgG, biotinyleret anti-kanin immunoglobulin, og streptavidin-peroxidase-kompleks reagens i 30 min. Snittene blev derefter visualiseret i frisk 3-3 ‘diaminobenzidin opløsning, hematoxylin kontrastfarve, og 0,1% saltsyre (til støtte farveseparation). Endelig blev objektglassene monteret i neutral tyggegummi og analyseret med en lys-felt mikroskop.

Graden af ​​immunfarvning af hvert vævssnit blev vurderet uafhængigt af to erfarne patologer, der var blind for patienternes kliniske data. Protein- ekspressionsniveauer blev evalueret under anvendelse af en semikvantitativ pointsystem baseret på den samlede procentdel af positivt farvede tumorceller og farvningsintensitet. Procentdelen af ​​positivt farvede celler blev scoret efter følgende kriterier: 0 (≤5% positive tumorceller farves), 1 (6-25% positive tumorceller farves), 2 (26-50% positive tumorceller farves), 3 (≥51% positive tumorceller farvet). Den farvningsintensitet blev scoret med en skala fra 0 til 3 som følger: 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning = lysegul), 2 (moderat farvning = gulbrun), 3 (kraftig farvning = brun). Til analysen samlede scores 4 blev defineret som lav ekspression, og scorer ≥ 4 blev defineret som høj ekspression

revers transkription polymerasekædereaktion

Totalt RNA blev ekstraheret fra friske væv under anvendelse. TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. RT-PCR-primere anvendt i undersøgelsen blev udformet og syntetiseret ved Shanghai Sangon Biological Engineering Technology Services Co. Ltd. β-Actin blev anvendt som en intern reference. Oplysninger om primersekvenserne anvendt i undersøgelsen er vist i tabel 4. RT-PCR blev udført under anvendelse af en totrins-metode. Et mikrogram af total RNA blev revers-transkriberet til cDNA ved 37 ° C i 60 min og 85 ° C i 5 s. PCR blev derefter udført ifølge de følgende betingelser: opvarmning til 95 ° C i 5 minutter; 40 cykler denaturering i 30 sekunder ved 95 ° C, annealing ved 60 ° C i 30 s og ekstension i 30 s ved 72 ° C; og endelig forlængelse ved 72 ° C i 7 min før reaktionen blev opbevaret ved 4 ° C. Syv mikrogram af det endelige PCR-produkt blev fyldt på en 2% agarosegel til elektroforese og billeddannelse analyse under ultraviolet lys. Den Mængde One-software-programmet (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) blev anvendt til at måle bånd og β-actin grå værdi af PCR-produkterne.

Western blotting

De kræft, carcinoma-tilstødende og parrede normale vævsprøver blev vejet og formalet i små stykker i flydende nitrogen. Pre-kølet PBS blev anvendt til at vaske prøverne, som derpå blev centrifugeret ved 5000 rpm ved 4 ° C i 5 min. Efter vask tre gange med PBS blev forkølet phosphat lysepuffer og PMSF tilsat. Prøven blev sonikeret ved 180 W ved 4 ° C i 5 min og centrifugeret ved 1.000 rpm ved 4 ° C i 5 minutter; supernatanten blev derefter straks fjernet, og proteinkoncentrationen blev kvantificeret ved Bradford assay under anvendelse af et kommercielt kit indkøbt fra Bio-Rad Laboratories. Supernatanterne blev blandet med ladningsbuffer og koges ved 100 ° C i 5 min for at denaturere proteinerne. Lige mængder af hver prøve blev fyldt i brøndene på en 4-12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel, elektroforeret og overført til en polyvinylidenfluoridmembran. Membranen blev blokeret med 5% BSA buffer i 1 time med omrystning og derefter inkuberet ved 4 ° C natten over med de individuelle primære antistoffer fortyndet i TBST. De følgende primære antistoffer blev anvendt: polyklonalt kanin-anti-human GOLPH3 (1:1000, Abcam plc, Cambridge, UK), polyklonale kanin-anti-human p-p70S6 (Thr389) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, USA), polyklonale kanin-anti-human p-Akt (Ser473) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, USA), monoklonalt kanin anti-human p-mTOR (Ser2448) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, USA) og monoklonale kanin anti-human p-Akt (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, USA). Membranen blev derefter vasket med TBST fem gange i fem minutter hver, og peberrodsperoxidase-konjugeret gede anti-kanin IgG sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology, SC-2004) blev tilsat før inkubation ved stuetemperatur i 1,5 time med omrystning. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Efter vask med TBST tre gange i fem minutter blev interessante bånd detekteret ved anvendelse af ECL prime Western blotting kit (Shanghai Pufei Biotechnology, Shanghai, Kina), og mængden One analyse software (Bio-Rad, CA, USA) blev anvendt at evaluere densitometridata.

statistiske analyser

Alle de statistiske analyser blev udført ved hjælp af statistiske pakke for Social Sciences, udgave 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). RT-PCR og Western blotting Resultaterne præsenteres som gennemsnit ± SE. En envejs ANOVA efterfulgt af LSD multiple-range test blev anvendt til at analysere forskellene mellem grupperne. Forbindelserne mellem GOLPH3 og p-mTOR, p-Akt, p-4E-BP, og p-p70S6 ekspressionsniveauer blev estimeret ved anvendelse af Pearsons korrelationskoefficient. Sammenhængen mellem proteinekspression og klinisk-patologiske variabler blev analyseret ved anvendelse af chi i anden-test. P 0,05 (to-halet) blev anvendt som den grad af statistisk signifikans

Resultater

Forhold mellem de klinisk-patologiske variabler og protein udtryk niveauer ved immunhistokemi

immunhistokemisk detektion. viste, at GOLPH3, p-Akt, og p-4E-BP1 var mest udbredt i cytoplasmaet, og phosphoryleret m-TOR (p-mTOR) var også til stede i kernen på et lavt niveau. Imidlertid blev p-p70S6 farvning kun observeret i cytoplasmaet. GOLPH3 og phosphorylerede Akt /mTOR pathway proteiner blev mere stærkt udtrykt i gastrisk cancer gruppen end i para-carcinom væv og parrede normale mucosa-grupper (figur 1, tabel 5). Desuden blev forholdet mellem den klinisk-patologiske variabler og proteinekspression undersøgt og er opsummeret i tabel 1, tabel 2 og tabel 3. En statistisk analyse viste, at den positive ekspression på GOLPH3 i gastrisk cancer gruppe stærkt korreleret med histologisk bedømmelse (

s

= 0,011), dybde invasion (

s

= 0,007), fjernmetastaser (

s

= 0,002), og lymfeknude involvering (

s

0,004), mens det ikke i væsentlig grad korrelerer med alder eller køn (

s

= 0,801 og 0,833 henholdsvis). Interessant, blev de høje ekspressionsniveauer af p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 observeret at være i overensstemmelse med høje GOLPH3 udtryk

A:. Den mavekræft gruppe B: karcinom -adjacent væv gruppe C: Den parrede normalt væv gruppe. Repræsentative vævssnit fra gastrisk cancer (n = 80), den carcinom-tilstødende væv (n = 80) og den parrede normalt væv (n = 80). Immunhistokemi resultater viste, at GOLPH3 blev p-Akt, p-mTOR og p-4E-BP1 mest udtrykt i kernen, blev p-p70S6 mest udtrykt i cytoplasmaet. Den GOLPH3, phosphoryleret Akt-mTOR signalvejen, p-4E-BP1 og p-p70S6 var stærkt udtrykt i mavekræft grupper.

mRNA ekspressionen af ​​GOLPH3 og mTOR signalvej gener ved RT-PCR

Vi ekstraheret RNA fra mavekræft, para-carcinom væv, og matchede normale vævsprøver fra firs patienter med gastrisk cancer. Ekspressionsniveauerne af GOLPH3 og mTOR-signalvejen-relaterede gener, herunder Akt, mTOR, eukaryot translationsinitiering faktor 4E bindende protein 1 (4E-BP1), og p70 ribosomal protein S6 kinase (p70S6), blev vurderet i de tre grupper af RT -PCR. Ekspressionsniveauerne af disse gener i gastrisk karcinom var højere end i carcinoma-tilstødende væv og betydeligt højere end i parrede normale gastriske væv. Den gennemsnitlige densitet og ekspression fordeling af GOPLH3, mTOR, Akt, 4E-BP1 og p70S6 er vist i figur 2. En statistisk analyse viste, at ekspressionsniveauerne af GOLPH3 og mTOR-signalvejen gener var signifikant forskellige i forskellige gastriske væv (

s

0,05)

kræft:. Den mavekræft (n = 80); paracancerous: Den paracancerous væv (n = 80); normal: Den parrede normale maveslimhinden (n = 80). A, B, C, D og E: mRNA niveauer af GOPLH3, Akt, mTOR, 4E-BP1, p70S6 i de forskellige målt ved RT-PCR, hhv. F, G, H, I og J: Densitometrisk kvantificering af GOLPH3, Akt, mTOR, 4E-BP1 og p70S6 mRNA-ekspression i forskellige væv, hhv. MRNA-ekspression var signifikant forskellige med hinanden og toppede på cancer. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± SE. *

s

0,05 versus kræft,

#

s

. 0,05 versus paracancerous

Protein udtryk for GOLPH3 og mTOR signalvej relaterede proteiner ved Western blotting

Western blotting-analyse viste, at GOLPH3, p-mTOR, blev p-Akt1, p-4EB-P1 og p-p70S6 også til udtryk i den mavekræft, carcinom-tilstødende, og parret normal gastrisk mucosa grupper. Interessant nok blev en gradvis stigning observeret i middelværdierne for de førnævnte protein udtryk niveauer fra den parrede normale maveslimhinden gruppe til mavekræft gruppen (figur 3), og der var en signifikant forskel mellem grupperne (

p

0,05)

A:. de protein niveauer af GOPLH3, p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 i de forskellige målt ved western blotting. B, C, D, E og F: GOPLH3, p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 proteinniveauer i forskellige væv, henholdsvis. cancer: Den mavekræft (n = 80); paracancerous: Den paracancerous væv (n = 80); normal: Den parrede normale maveslimhinden (n = 80). Dataene er præsenteret som gennemsnit ± SE. *

s

0,05 versus kræft,

#

s

. 0,05 versus paracancerous

Korrelationer mellem ekspressionen af ​​GOLPH3 og signalering signalering pathway-relaterede proteiner

Pearsons korrelationsanalyse viste en stærk korrelation mellem GOLPH3 ekspression og af signalvejen (tabel 6). En statistisk analyse viste, at Pearson produkt moment korrelationskoefficienter var alle positive i gastrisk cancer gruppen. Interessant nok blev GOLPH3 udtryk stærkt forbundet med p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 (

r

= 0,410, 0,203 og 0,128 henholdsvis

s

0,05) udtryk , og en positiv sammenhæng mellem GOLPH3 og p-Akt var næsten signifikant (

s

= 0,054). I mellemtiden blev observeret stærke korrelationer mellem ekspressionen af ​​p-4E-BP1 og de ovennævnte proteiner med undtagelse af p-mTOR. Phosphoryleret mTOR udtryk blev også positivt korreleret med p-Akt udtryk (

r

= 0,521,

s

= 0,027). Phosphoryleret p70S6 udtryk blev også korreleret med ekspression af p-Akt (

r

= 0,274,

s

0,001) og p-mTOR (

r

= 0,451,

s

= 0,007).

diskussion

Selvom forekomsten af ​​mavekræft er faldet i de seneste år [2], er det stadig en alvorlig trussel mod menneskers sundhed . De fleste gastrisk kræftpatienter er diagnosticeret i fremskredne stadier og har tendens til at præsentere med tumor invasion og metastase. Gennem det seneste årti er der opnået nogen store forbedringer med hensyn til tidlig diagnosticering og behandling af mavekræft. En forståelse af den molekylære biologi underliggende mavekræft mangler stadig. Siden 2009 har GOLPH3 fået stor opmærksomhed som et onkogen. Dette protein er lokaliseret til den cytoplasmatiske side af trans-Golgi og har været tæt forbundet med tumorigenicitet [3], [8]. Store undersøgelser har fundet, at GOLPH3 overekspression forekommer i adskillige humane cancere, herunder epitel ovariecancer, renalcellecarcinom, glioblastoma multiforme, esophageal pladecellecarcinom, og mundtlige tungen kræft [12] – [16]. Tyder på, at GOLPH3 er involveret i tumorigenese og korrelerer med dårlig prognose. Desuden er en undersøgelse rapporterede, at GOLPH3 overekspression er associeret med dårligt klinisk resultat i gastriske cancere [17]. Imidlertid er de præcise mekanismer bag denne relation er uklare, og den nøjagtige molekylære mekanisme, ved hvilken GOLPH3 er involveret i gastrisk cancer tumorigenese, invasion og metastase er dårligt forstået. For at undersøge potentialet molekylære mekanisme, hvormed GOLPH3 er involveret i gastrisk kræft, vi først brugt immunhistokemi at lokalisere GOLPH3 udtryk i forskellige gastriske væv. Vi fandt, at GOLPH3 var primært lokaliseret til cytoplasmaet, og det blev udtrykt i gastrisk cancer, para-carcinom og parrede normale gastriske væv. Interessant, satserne for høj GOLPH3 udtryk var 75,00% (60 ud af 80) i gastrisk cancer væv, 43,75% (35 ud af 80) i carcinoma-tilstødende væv og 12.50% (10 ud af 80) i normale væv, henholdsvis ( tabel 5). Desuden GOLPH3 over-ekspression blev observeret i gastrisk cancer væv og var stærkt relateret til gastrisk cancer invasion og metastase. Vores resultater foreslog, at høj GOLPH3 udtryk var signifikant relateret til histologisk bedømmelse (

s

= 0,015), dybde invasion (

s

0,001), lymfeknude metastaser (

p

0,001), og fjernmetastaser (

s

= 0,006) i gastrisk cancer væv (tabel 1). Derudover blev Western blotting og RT-PCR udført for at vurdere GOLPH3 ekspression på proteinniveauet og mRNA-niveauer. Interessant, var resultaterne ligner dem observeret i immunhistokemi analyse. Ovennævnte resultater viser, at øget GOLPH3 ekspression er tæt forbundet med forekomsten af ​​mavekræft, og GOLPH3 kan være involveret i gastrisk cancer invasion og metastase.

For nylig har et stigende antal signaltransduktionsveje blevet rapporteret til være involveret i tumorinvasion og metastase. Mammalian target of rapamycin (mTOR), som er en serin /threonin-kinase nedstrøms for phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt-signalvejen og inkluderer mTORC1 (mTOR /RAPTOR) og mTORC2 (mTOR /Rictor), regulerer proteinsyntese, celle proliferation, cellemetabolisme og differentiering [18], [19]. Aktiveret mTORC1 sekventielt direkte aktiverer mål nedstrøms, herunder p70S6 kinase (S6K) og eukaryote initieringsfaktor 4E-bindende protein 1 (4E-BP1), og mTORC2 er blevet vist at spille en kritisk rolle i Akt-phosphorylering ved Ser473, hvilket resulterer i fuld aktivering af Akt [20], [21]. Selvom Akt direkte aktiverer mTOR /RAPTOR, kan den også direkte eller indirekte aktivere p70S6 kinase /4EBP1 pathway denne vej ved phosphorylering tumor suppressor TSC2 [22]. Akt /mTOR pathway har vist sig at være hyppigt aktiveres i forskellige maligne tumorer, herunder brystcancer, urotelial karcinom, ovariecancer, pancreascancer neuroendokrine tumorer, human medulloblastom, melanoma, endometriecancer og hepatocellulært carcinom; derfor denne vej repræsenterer en mulig terapeutisk mål i mange cancere [23] – [30]. I vores undersøgelse, RT-PCR og Western blotting viste, at mRNA og protein ekspressionsniveauer af p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 i gastrisk cancer gruppen var signifikant højere end i para-carcinom væv og parrede normale gastriske vævsgrupper (figur 2, figur 3). For at bestemme om ekspressionsniveauerne af p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 var forbundet med kritiske klinisk-patologiske karakteristika, udførte vi yderligere analyser. I denne undersøgelse 81,25% af de 80 patienter med gastrisk cancer havde høj p-mTOR ekspression, 77.50% havde høj p-4E-BP-ekspression, 76,25% havde høj p-p70S6 ekspression, og kun 75,00% havde høj p-Akt ekspression (tabel 5). Overraskende viste en immunhistokemisk analyse, at ekspressionsniveauerne af disse protein udtryk signifikant var forbundet med dybden af ​​invasion, lymfeknude og fjernt metastase, og histologisk bedømmelse, men var ikke forbundet med køn eller alder (tabel 1, tabel 2 og tabel 3) . Disse resultater antyder, at Akt /mTOR pathway aktiveres i gastrisk cancer og kan spille en vigtig rolle i gastrisk cancer tumorigenese, invasion og metastase.

For nylig Scott et al. afslørede, at GOLPH3 kan fremme celletransformation og tumorvækst med konstitutivt aktivere mTOR signalvejen i melanomceller og at GOLPH3 stimulerer mTOR signalvejen via mTORC1 og mTORC2 komplekser og dermed fremme tumorcellevækst og proliferation [8]. Det er dog uklart, om dette fænomen forekommer også i gastrisk cancer væv. Så vidt vi ved, vores undersøgelse er den første til at udforske patogenesen af ​​GOLPH3 fremmet tumorigenese, invasion og metastase af mavekræft. Vores data viser en signifikant positiv sammenhæng mellem ekspression af GOLPH3 og p-mTOR, p-4E-BP1, og p-p70S6 (

r

= 0,410, 0,203 og 0,128 henholdsvis

p

0,05). Men sammenhængen mellem ekspressionen af ​​GOLPH3 og p-Akt var ikke signifikant (

r

= 0,258,

s

0,05) (tabel 6). Især blev signifikant højere GOLPH3 ekspression ledsaget af høj ekspression af p-mTOR, p-4E-BP1, og p-p70S6 i gastrisk cancer væv, og dette forhold var signifikant associeret med dybden af ​​invasion, histologisk bedømmelse og lymfeknuder og fjernt metastase. Vores resultater viste forskellige relationer mellem GOLPH3 og Akt /mTOR signalering proteiner, og den positive sammenhæng mellem GOLPH3 og p-Akt var næsten signifikant. De specifikke årsager til dette forhold mellem GOLPH3 og p-Akt er uklare og bør undersøges nærmere. Vi spekulere, at prøvens størrelse kan have været for lille. Derudover kan GOLPH3 primært aktivere Akt /mTOR-signalvejen via det aktiverede mTORC1 komplekset snarere end mTORC2 kompleks, hvilket resulterer i p70S6 og 4E-BP1 phosphorylering og dermed påvirke mavekræft. Disse resultater indikerer, at GOLPH3 kan være involveret i gastrisk cancer tumorigenese, invasion og metastase via unormal aktivering af Akt /mTOR-signalvejen.

Som konklusion denne undersøgelse påvises høje ekspressionsniveauer af GOLPH3, p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 og p-p70S6 i gastrisk cancer gruppe kraftigt som korrelerede med histologisk kvalitet, dybde af invasion, fjernmetastaser, og lymfekirtelinvolvering ved klinisk-patologisk variabler analyse og immunhistokemi. Desuden er ekspressionen af ​​GOPLH3 stærkt korreleret med aktiveringen af ​​Akt /mTOR signalvejen i humane gastriske cancer prøver. Baseret på disse resultater, vi spekulere, at GOLPH3 kan være påvirket progression og metastase af mavekræft gennem aktivering af Akt /mTOR-signalvejen. Desuden foreslår vi, at hæmning af ekspressionen af ​​gener i GOLPH3 og mTOR-signalvejen kan repræsentere en hidtil ukendt mål for gastrisk cancerterapi. Endelig invasion og migration mekanismer GOLPH3 i mavekræft stadig brug for yderligere undersøgelser.