PLoS ONE: B7-H1 Expression er associeret med dårlig prognose i kolorektal karcinom og regulerer spredning og invasion af HCT116 Colorectal Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund og formål

Undersøgelsen af ​​B7-H1 udtryk i kolorektale cancerceller er på et tidligt stadium. Det er uklart, om B7-H1 udtryk kan have diagnostisk eller prognostisk værdi i kolorektal cancer. Derudover hvordan B7-H1 er forbundet med de kliniske træk ved colorectalt carcinom er ikke kendt. For at undersøge sammenhængen mellem B7-H1 og kolorektal cancer, vi analyserede B7-H1 udtryk og dets effekt i kliniske prøver og HCT116 celler.

Metoder

Paraffin-indlejrede prøver fra 143 støtteberettiget patienter blev anvendt til at undersøge ekspressionen af ​​CD274 ved immunhistokemi. Vi undersøgte også, om B7-H1 selv kan være relateret til celleproliferation, apoptose, migration og invasion i tyktarmskræft HCT116 celler.

Resultater

Vores resultater viser, at B7-H1 blev stærkt udtrykt i kolorektal carcinom og var signifikant associeret med celledifferentiering status og TNM (Tumor Knude Metastase) fase. Patienter med positiv B7-H1 udtryk viste en tendens til kortere overlevelsestid. Ved hjælp af multivariat analyse, viser vi, at positive B7-H1 udtryk er en uafhængig prædiktor for colorectal carcinom prognose. Vores resultater viser, at B7-H1 silencing med siRNA inhiberer celleproliferation, migration og invasion. Endvidere blev celle apoptose også forøget med B7-H1 hæmning.

Konklusioner

Positiv B7-H1 udtryk er en uafhængig prædiktor for colorectal carcinom prognose. Desuden kan knockdown af B7-H1 inhibere celleproliferation, migration og invasion

Henvisning:. Shi S-J, Wang L-J, Wang G-D, Guo Z-Y, Wei M, Meng Y-L, et al. (2013) B7-H1 Expression er associeret med dårlig prognose i kolorektal karcinom og regulerer spredning og invasion af HCT116 Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 8 (10): e76012. doi: 10,1371 /journal.pone.0076012

Redaktør: John Souglakos, University Hospital of Heraklion og Laboratoriet for Tumor Cell Biology, School of Medicine, University of Crete, Grækenland

Modtaget: Juni 7, 2013; Accepteret: August 19, 2013; Udgivet: 4 okt 2013

Copyright: © 2013 shi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (No.30873004, 30.973.000 og 81.171.924) og Natural Science Foundation of Shan xi provinsen (No.2011JM4006). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal karcinom er den tredje hyppigst diagnosticeret malignitet i verden og den femte hyppigste dødsårsag blandt kræftpatienter i Kina [1]. På grund af en mangel på effektive diagnostiske markører, de fleste kolorektal cancer patienter har fjernmetastaser (fase IV) ved diagnose. Den mest effektive kolorektal cancer behandling er kirurgi. manglen på præcise prognose markører gør det imidlertid vanskeligt at forudsige patientens overlevelsestid efter operationen. Således er nye og effektive markører for diagnose og prognose kræves i klinikken.

co-stimulerende molekyle B7 homolog 1 (B7-H1 eller CD274) er et nyligt identificeret ligand for co-hæmmende receptor programmeret død -1 (PD-1 eller CD279) [2,3]. B7-H1 udtrykkes på T-celler, B-celler, makrofager og dendritiske celler. Ekspressionen af ​​B7-H1 kan yderligere opreguleres ved aktivering eller tilstedeværelse af IFN-γ [2-4]. Foruden lymfocytter, har B7-H1 også blevet påvist i lave niveauer på hjertets endotel, mikrovaskulære endotelceller, pancreas-øer og syncytiotropho-blaster i placenta [5,6]. Traditionelt er funktionen af ​​B7-H1 på antigenpræsenterende celler opnås ved binding med PD-1 på T-celle, som menes at spille en vigtig rolle i induktionen og opretholdelsen af ​​immuntolerance [7-9].

Ud over ekspression på lymfocytter og normalt væv, er også blevet fundet afvigende B7-H1 ekspression i forskellige humane maligniteter. Tumortyper herunder pladecellecarcinomer i lungen, esophagus, hoved og hals, og andre typer af carcinomer, såsom ovarie-, blære-, brystcancer, melanoma og gliom også udtrykke B7-H1 [10-16]. Ekspressionen af ​​tumorassocierede B7-H1 er korreleret med dårlig prognose og høj malignitet kvalitet. Blokaden af ​​tumorassocierede B7-H1 er blevet vist at fremme tumorregression in vivo i flere murine tumor transplantater [10,12,17,18]. PD-1-ekspression opreguleres på tumorinfiltrerende lymfocytter, og det er blevet foreslået, at B7-H1 udtrykt på cancerceller kan hæmme funktionen af ​​infiltrerende lymfocytter [16]. Det er også blevet påvist, at tumor-associerede B7-H1 kan inducere apoptose af CTL, som efterfølgende resulterede i en flugt fra T-cellemedieret immun-overvågning [8,10]. Tidligere undersøgelse betalt overdreven opmærksomhed til funktionen af ​​tumor-associerede B7-H1, som har virkning som en ligand for PD-1 eller CD80, men forsømte effekten af ​​tumor-associerede B7-H1 selv på tumor celle. Undersøgelsen vedrørende effekten af ​​tumor-associerede B7-H1 på tumor celle er stadig i sin vorden. Således kan tumorassocierede B7-H1 virke sammen med andre negative regulatorer af T-celleaktivering for at dæmpe værtens immunrespons antitumor [19], også med den store mulighed kan tumorassocierede B7-H1 påvirke processen af ​​cancer progression gennem forstyrre funktionen af ​​kræftcelle.

udtryk for B7-H1 i kolorektale karcinomer er inkonsekvent. Dong et al. ikke har kunnet påvise B7-H1-ekspression i normale colon væv, men ekspressionen af ​​B7-H1 blev påvist i en relativt høj andel (10/19) af patienter med tyktarmskræft [10]. Men en anden gruppe identificeres ekspressionen af ​​B7-H1 på mRNA-niveau, men heller ikke påvise overfladeekspression af B7-H1in colon epitelceller fra raske kontroller [20]. Undersøgelsen af ​​B7-H1 udtryk i kolorektale cancerceller er på et tidligt stadium. Det er uklart, om B7-H1 udtryk kan have diagnostisk eller prognostisk værdi i kolorektal cancer. Derudover hvordan B7-H1 er forbundet med de kliniske træk ved colorectalt carcinom er ikke kendt. I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionsprofilen af ​​B7-H1 i 5 normale colonvæv, 143 kolorektal cancer væv og 44 tilstødende væv. Vi evaluerede også den prædiktive værdi af B7-H1 for prognosen i kolorektal cancer patienter og undersøgt, om tumor-associerede B7-H1 selv direkte kunne modulere kolorektal cancer progression snarere end gennem binding til PD-1 på T-celle.

Materialer og metoder

2.1: patienter og opfølgende

som vi beskrev tidligere, blev denne undersøgelse er godkendt af den etiske komité i fjerde Military Medical University og alle de deltagende patienter har givet deres skriftlige informeret samtykke til deres informations- og vævsprøver, der skal lagres i databasen af ​​Xijing Hospital og anvendes til forskning [21]. . Den retrospektive kohorte vi investigatedincluded143 patienter med potentielt resektabel kolorektal karcinom diagnosticeret i perioden februar 2006 til december 2007. Patienterne blev indsamlet fra Institut for Gastrointestinal Surgery, Xijing Hospital, Fjerde Military Medical University. Kriterierne for rekruttering udelukkelse i denne undersøgelse er følgende: modtagelse adjuverende kemoterapi før operation, diagnose af gastrointestinal stromale tumor eller lymfom, diagnose med yderligere kræftformer, og patienter, der nægter samtykke. De kliniske prøver blev hentet fra vævet arkivet i Patologisk Institut, Xijing Hospital, Fjerde Military Medical University. Den opfølgende oplysninger af alle deltagere blev opdateret hver 3. måned via telefon. Den samlede overlevelse blev defineret som den forløbne tid fra operation til døden. Oplysninger om død af patienter blev konstateret fra deres familie

2.2:. Immunhistokemisk (IHC) farvning og evaluering

Paraffin-indlejrede sektioner af normale og tumorvæv blev farvet for B7-H1 udtryk. Den immunhistokemisk farvning for B7-H1 blev udført som tidligere rapporteret med mindre ændringer [22]. Kort fortalt blev objektglassene deparaffiniseret i xylen og rehydreret i en gradueret alkoholserie før endogen peroxidase-aktivitet blev blokeret med 3% H

2O

2. Alle uspecifik proteinbinding blev blokeret ved hjælp af pre-immun kaninserum. Det primære antistof til B7-H1 (Abcam, ab58810) blev fortyndet henhold til den anbefalede koncentration (5 ug /ml), og sektionerne blev inkuberet natten over i et fugtigt kammer ved 4 ° C. Snittene blev vasket 3 gange med PBS, og derefter et biotinyleret sekundært antistof blev tilsat og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Signalet visualisering blev udført under anvendelse DAB kromogen for 2 til 3 min. Den negative farvning kontrol blev fremstillet ved at erstatte det primære antistof med præ-immunt kaninserum. B7-H1-farvning blev scoret uafhængigt af to patologer blindede til de kliniske karakteristika af patienterne. Pointsystemet anvendt i klassificering B7-H1-ekspression blev beskrevet tidligere [23]. Tumorer med stærk og moderat immunfarvning intensitet blev klassificeret som havende positive (+) udtryk, hvorimod tumorer med fraværende og svag immunfarvning blev klassificeret som havende negative (-) udtryk

2.3:. Celledyrkning

Humane tyktarmskræft HCT116 celler blev opnået fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), hvor de blev præget af mycoplasma detektion, DNA -Fingerprinting, isozym afsløring og celle vitalitet afsløring. Denne cellelinje blev straks udvidet og fryses så cellekulturerne kunne genstartes hver 3 til 4 måneder fra den samme batch af frosne hætteglas. HCT116 celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (HyClone, Logan, UT) og dyrket i en fugtig inkubator ved 37 ° C i 5% CO

2

2.4: siRNA transfektion og gen silencing

for at lukke munden på B7-H1 i celler, en lille interfererende RNA (siRNA) blev transficeret ind i cellerne. De siRNA’er duplexerne (5′-GGCUGCACUAAUUGUCUAUTT-3 ‘og 5′-CCAGCACACUGAGAAUCAATT-3′), rettet mod B7-H1-genet. Den negative kontrol duplex (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘) målrettet en uspecifik sekvens. De siRNA’er blev syntetiseret ved Sangon Biotech (Shanghai, Kina). SiRNA-duplexerne (100 nmol /L) blev transficeret ind HCT116 celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. De HCT116 celler blev høstet 48 timer efter transfektion for yderligere analyse. Inhiberingen effektivitet blev identificeret ved western blot (figur S1)

2.5:. RT-qPCR (revers transkription-kvantitativ PCR)

Totalt celle-RNA blev ekstraheret ved anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens protokol. RNA’et blev derefter reverse transkriberet med Revert Aid

TM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Sankt Leon-Rot, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. De reverse transkription-kvantitativ polymerasekædereaktioner (RT-qPCR) blev udført under anvendelse af et CFX96

TM Real-Time PCR systemet (BioRad, Valencia, CA) med SYBR Green reagenser (# DRR041A; Takara Bio, Japan) ifølge producentens anvisninger. RT-qPCR analyse blev udført i et totalt volumen på 20 pi med følgende amplifikationstrin: et indledende denatureringstrin ved 95 ° C i 10 min, hvilket blev efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og forlængelse ved 55 ° C i 30 sek. RT-qPCR genekspression blev normaliseret til humant β-actin. De anvendte primere til real-time PCR i denne undersøgelse var følgende: 5′- TCAATGCCCCATACAACAAA 3 ‘(sense) og 5′-TGCTTGTCCAGATGACTTCG 3′ (antisense) for B7-H1; 5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3 ‘(sense) og 5′-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’ (antisense) for β-actin

2.6:. Western blot-

Celler blev høstet i lysispuffer (50 mM NaCl, 50 mM EDTA, 1% Triton X-100) indeholdende protease inhibitor cocktail (Roche, Indianapolis, IN, USA). Cellelysaterne (30 ug) blev separeret ved anvendelse af 10% SDS-PAGE geler og derefter overført til nitrocellulosemembraner (Millipore, Bedford, MA). Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri mælk fortyndet i PBS i 2 timer ved stuetemperatur før tilsætning af det passende primære antistof. Antistofferne anvendt i denne undersøgelse omfattede anti-B7-H1 (1: 400; Abcam, ab58810) og anti-GAPDH (1: 2.000; Abcam, mAbcam9484). Membranerne blev derefter vasket med PBS indeholdende 0,05% Tween og inkuberet med det passende HRP-konjugeret sekundært antistof (1: 10.000; Abcam) i 1 time ved stuetemperatur. Båndene blev visualiseret ved anvendelse af en chemiluminescens-reagens (New England Nuclear, Boston, MA)

2.7:. MTT assay

Celleproliferation blev analyseret in vitro med tetrazoliumsaltet 3- (4, 5 -dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) reagens. HCT116-celler blev transficeret med specifikke siRNA (si-scramble eller si-B7-H1) i 24 timer, og derefter proliferation blev undersøgt. Kort fortalt blev 2000 celler fra hver gruppe (parental, si-scramble eller si-B7-H1) udpladet i hver brønd i fem plader med 96 brønde i 200 pi medium. Til analyse celleproliferation, 20 pi MTT substrat ved en koncentration på 2,5 mg /ml i PBS blev tilsat til hver brønd. Pladerne blev derefter returneret til en standard væv inkubator i yderligere 4 timer. Mediet blev derefter fjernet, og cellerne blev solubiliseret i 150 pi dimethylsulfoxid til den kolorimetriske analyse (bølgelængde, 490 nm). Én plade blev analyseret umiddelbart efter at cellerne klæbet (ca. 4 timer efter udpladning). Derefter blev én plade per dag undersøgt for de næste 4 dage i træk

2.8:. Flowcytometrisk analyse til påvisning af celle apoptose

HCT116-celler blev transficeret med specifikke siRNA (si-scramble eller Si- B7-H1) i 48 timer, og cellerne blev derefter suspenderet i inkubationspuffer ved en densitet på 1 × 10

6 celler /ml. Cellerne blev inkuberet med Annexin V-FITC og propidiumiodid (BD Bioscience, San Jose, CA) i 15 minutter i mørke ved stuetemperatur. Cell apoptose blev derefter analyseret ved hjælp af et flowcytometer (BD FACS Aria)

2.9:. Migration og invasion assay

Cell migration og invasion kapacitet blev målt in vitro ved hjælp transwell migration assays (Millipore, Billerica , MA). De HCT116 celler blev transficeret med specifikke siRNA (si-scramble eller si-B7-H1) i 48 timer og suspenderet i DMEM med 10 g /l BSA ved en tæthed på 50 celler /ml. Derefter blev cellesuspensioner (200 pi) podet i det øvre kammer med aporous membran belagt med (for transwell invasion assay) eller uden (for migration assay) Matrigel (BD Bioscience, San Diego, CA). At tiltrække cellerne blev 500 pi DMEM med 10% serum tilsat til bundkammeret. Efter at have ladet cellerne til at migrere i 24 timer eller til at invadere i 48 timer blev den gennembrudte celler på filtrene fikseret i tørret methanol og farvet i 4 g /L krystalviolet. Antallet af migrerede eller invasive celler blev bestemt ud fra fem tilfældige felter ved hjælp af et mikroskop (Olympus) ved × 10 forstørrelse

2.10:. Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af IBM SPSS statistisk software ( udgave 20.0). Overlevelseskurver blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden, og fordelinger blev evalueret ved den lange rank test. Cox proportional hazard modeller af faktorer relateret til overlevelse blev brugt til at beregne timer og til at identificere de faktorer, der påvirker overlevelse. Forskellene i egenskaber mellem de 2 grupper blev undersøgt af χ

2 test og Fishers eksakte test. Alle

P

-værdier blev bestemt ud fra 2-sidede test, og statistisk signifikans var baseret på en

P

-værdi på 0,05.

Resultater

3.1: klinisk betydning af positiv B7-H1-ekspression i kolorektal cancer væv

for at bestemme forekomsten og kliniske betydning af B7-H1-ekspression i kolorektal cancer, vi vurderet den B7-H1 proteinniveauet ved immunhistokemi i en retrospektiv kohorte af 143 patienter med tarmkræft efter tumor resektion. Blandt de 143 patienter, 64 patienter (44,8%) viste positive B7-H1-ekspression i cytoplasmaet og membranen (figur 1A). Der var 79 patientprøver uden påviselig B7-H1 ekspression (figur 1C). Derudover kun 5 (11,4%) af 44 tilstødende væv viste positiv B7-H1 ekspression (figur 1B p = 0,006). Som vist i tabel 2, blev celledifferentiering og TNM stadie også forbundet med prognosen for colorectalt carcinom. I multivariat analyse, fandt vi, at positive B7-H1 udtryk var forbundet med en nedsat samlet overlevelse. Den justerede HR var 2,771. (95% CI: 1,048-2,994; p = 0,003), hvilket indikerer, at B7-H1 udtryk kunne være en prognostisk faktor uafhængig af disse justerede clinicopathologic egenskaber (tabel 2)

univariat

Multivariat

HR

95% CI

P Value

HR

95% CI

P Value

B7-H1 expression2.611(1.008-3.576)0.006

*2.771(1.048-2.994)0.003

*Age0.815(0.497-1.335)0.4160.888(0.520-1.516)0.663Sex1.225(0.757-1.983)0.4081.010(0.596-1.714)0.433Tumor location1.199 (0.463-3.104) 0.7090.904 (0.281-2.906) 0.865TNM stage2.345(1.153-2.778)0.010

*1.416(1.179-1.971)0.043

*Differentiation1.956(1.224-2.928)0.030

*3.192(1.126-3.679)0.004

*Table . 2. Cox regressionsanalyse af prognostiske faktorer for samlet overlevelse i patienter med tyktarmskræft (n = 143)

95% CI angiver 95% konfidensinterval * P ≤ 0.05 CSV Hent CSV

3.3: Effektiv knockdown af B7-H1 af siRNA i HCT116 celler

Det er blevet rapporteret, at tumor-associerede B7-H1 kunne fremme T-celle apoptose [10], men der er ingen undersøgelser indikerer en rolle for B7-H1 udtryk på tumorceller. Som et almindeligt anvendt human colorectal cancer cellelinje, har HCT116-celler vist sig at være invasiv og meget motile in vitro [24-26]. Således at undersøge funktionen af ​​B7-H1 i kolorektal cancer cellebiologi, vi brugte siRNAs målrettet B7-H1 til at hæmme B7-H1 udtryk. Vi derefter undersøgt tumor celle karakteristika, herunder celleproliferation, apoptose, migration og invasion. Den effektive knockdown af B7-H1 blev bekræftet ved QRT-PCR, Western blot og flowcytometri-analyse. Sammenlignet med celler transficeret med scrambled siRNA, celler transficeret med siRNA’er til B7-H1 udviste signifikant reduceret B7-H1 ekspression (hvert eksperiment blev udført tre gange, og den typiske resultat er til stede som figur 2A, 2B og 2C).

(A) RT-qPCR analyse for at vise B7-H1 mRNA-niveau. Parental eller HCT116 celler transficeret med røræg siRNA eller siRNA målrettet B7-H1 i 48 h blev høstet og RT-qPCR blev udført; (B) Western blot-analyse til påvisning af B7-H1 proteinniveauet. Parentale eller HCT116-celler transficeret med scrambled siRNA eller siRNA targeting B7-H1 i 48 timer blev høstet og cellelysater blev fremstillet og anvendt til Western blot; (C) Flowcytometrisk analyse og middelkanalfluorescens at vise B7-H1 ekspression på cellemembranen. Parental eller HCT116 celler transficeret med røræg siRNA eller siRNA målrettet B7-H1 i 48 h blev høstet og celleoverfladen farvning blev udført før flowcytometrisk analyse. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD, * P 0,05 versus si-scramble gruppe

3.4:. Effekt af B7-H1 knockdown på celledeling

Efter bekræftelse af knockdown effektivitet af siRNA’er rettet mod B7-H1, vi bestemt effekten af ​​en reduceret B7-H1-niveau på celleproliferation ved hjælp af en MTT-analysen. HCT116 celler, der var transficeret med siRNA targeting B7-H1 udviste signifikant mindre proliferation end de parentale eller krypterede siRNA-transficerede celler (figur 3A). Dette resultat demonstrerede B7-H1 havde en direkte virkning på celleproliferation i HCT116 celler, og at en høj B7-H1 proteinniveauet er korreleret med øget celleproliferation.

(A) MTT analyse til påvisning af celleproliferation. Parentale eller HCT116-celler blev transficeret med scrambled siRNA eller siRNA targeting B7-H1 i 48 timer blev podet i plader med 96 brønde og celleproliferation blev påvist ved MTT. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD, * P 0,05 versus si-kamp gruppe. (B) Flowcytometrisk analyse til påvisning af celle apoptose. Parentale eller HCT116-celler transficeret med scrambled siRNA eller siRNA targeting B7-H1 i 48 timer blev opsamlet og farvet med Annexin-V-FITC og PI inden flowcytometrisk analyse. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD, * P 0,05 versus si-scramble gruppe

3.5:. Effekt af B7-H1 knockdown på celle apoptose

Vi har vist, at B7-H1 ekspressionsniveau er korreleret med celleproliferation. Derfor testede vi, om den inhiberede celleproliferation kan være forårsaget af øget celle apoptose i B7-H1 knockdown celler. HCT116 celler transficeret med scramble siRNA eller siRNA targeting B7-H1 i 48 timer blev analyseret for apoptose. Resultaterne indikerer, at sammenlignet med de parentale eller krypterede siRNA-transficerede celler, celler transficeret med siRNA targeting B7-H1 havde øget apoptose indeks, som beregnes ved tilføjelse af cellerne i de 1 og cellerne i 2 (12,3 ± 5,9% og 17,2% ± 6,2 vs. 1,1 ± 0,4%, P 0,05; 12,3 ± 5,9% og 17,2% vs. 0,9 ± 0,5%, P 0,05; hvert eksperiment blev udført tre gange, og den typiske resultat er til stede som figur 3B). Kollektivt antyder disse resultater, at ekspressionen af ​​B7-H1 i HCT116-celler er vigtig for både celleproliferation og apoptose

3.6:. Virkning af B7-H1 knockdown på cellemigration og invasion

B7 H1-er tidligere blevet vist at regulere cellemigrering og invasion i pancreas carcinomceller [27]. Vores observationer som B7-H1 udtryk spillede en vigtig rolle i HCT116 celledeling og apoptose førte os til at vurdere funktionen af ​​B7-H1 på celle migration og invasion i colon cancerceller. For at teste migration, vi brugte standard Matrigel-med eller uden overtræk transwell kammer assays. Vi fandt, at sammenlignet med de krypterede siRNA-transficerede celler, HCT116 celler transficeret med siRNA’er rettet mod B7-H1 havde nedsat migration og invasion evne (figur 4A-4D), og en reduceret invasiv indeks (invasion celleantal /migration celleantal, figur S2 ). Afslutningsvis vores resultater viser, at B7-H1 ekspression i HCT116 celler er korreleret med celleproliferation, apoptose, migration og invasion.

(A) Boyden kammer assay til påvisning af cellemigrering. Parental eller HCT116 celler transficeret med røræg siRNA eller siRNA målrettet B7-H1 i 48 h blev udsået i Boyden kamre uden Matrigel-belagt membran, og efter yderligere 48 timer blev migrerede celler farves og tælles under et mikroskop (forstørrelse × 10). Repræsentative billeder blev vist. (B) Antal migrerede celler er vist i A. Dataene blev vist som middelværdier ± SD fra fem felter. * P 0,05 versus si-kamp gruppe. (C) Boyden kammer assay til påvisning af celleinvasion. Parentale eller HCT116-celler transficeret med scrambled siRNA eller siRNA targeting B7-H1 i 48 timer blev podet i modificerede Boyden kamre med Matrigel-coated membran, og efter yderligere 24 timer blev invasive celler der bevægede sig gennem Matrigel membranen farves og talt under et mikroskop (forstørrelse x 10). Repræsentative billeder blev vist. (D) Antal invasive celler er vist i C. Dataene blev vist som middelværdier ± SD fra fem felter. * P. 0,05 versus si-scramble gruppe

Diskussion

B7-H1 er stærkt udtrykt i forskellige typer af tumorer. Men sammenhængen mellem B7-H1 udtryk og kolorektal cancer progression er ikke blevet godt undersøgt [20,28]. I denne undersøgelse har vi bekræftet, at kunne detekteres ekspressionen af ​​B7-H1 i både kolorektal cancer og tilstødende væv, men med forskellig hyppighed. Vi gav også tegn på, at positive B7-H1-ekspression korreleret med uønskede kliniske og patologiske funktioner i kolorektal cancer. Endvidere demonstrerede vi, at B7-H1 ekspressionsniveauet var også prædiktiv for sygdomsudvikling og cancer-specifik død. Vores resultater viste patienter med positiveB7-H1 udtryk er normalt på et væsentligt højere risiko for kræft progression, kræft-specifikke død og kortere samlet overlevelse. Denne øgede risiko var uafhængig af køn, alder, tumorstørrelse, tumor placering, differentiering status og TNM stadie. Disse resultater forudsat den første dokumentation for B7-H1 som en indikator for dårlig prognose i kolorektal cancer.

Det mest spændende og uventede fund var vores resultater viste, at B7-H1 selv korreleret med celleproliferation, apoptose, migration og invasion. Selvom nogle forskergrupper har bekræftet, at tumorceller, der udtrykker B7-H1 havde en høj proliferativ indeks [14,27], de fleste grupper en tendens til at tro, B7-H1 forhindre tumor ødelæggelse kun ved at danne “en molekylær skjold [18,29]”, men ikke formning “en mere kraftfuld spyd” [18,30]. Vores fund giver stærke beviser, at B7-H1 kan have onkogene funktion under colon carcinogenese, der kaste et nyt lys på funktionen af ​​B7-H1 i kolorektal udvikling af kræft.

recidivraten for kolorektal cancer er relativt høj. En mulig årsag til tilbagefald er, at den resterende tumor kan unddrage vært immunesurveillance. Tidligere undersøgelser har bekræftet, at høj T-celle-infiltration i kolorektal cancervæv er korreleret med en forbedret 5-års samlet overlevelse. Et højt niveau af T-celle-infiltration kan tjene som en bedre indikator for prognose end konventionel histopatologisk mellemstation [31]. Det har imidlertid også vist, at kolorektal cancer patienter har en udvidet treg befolkning. Det øgede antal Treg celler kan undertrykke CD4

+ T-cellefunktion i afhængighed af tumorassocierede antigener [32]. Det er også blevet rapporteret, at frekvensen af ​​tregs i TDLNs var korreleret med sygdomsstadium [33]. Kolorektal cancer patienter med høj ekspression af Th1 eller cytotoksiske klynge gener har en forlænget sygdomsfri overlevelse. Omvendt høj ekspression af Th17 klynge generne resulterer i en dårlig prognose [34,35]. Forholdet mellem tumor-associeret B7-H1 og funktionen af ​​infiltrerede T-celler i tumoren mikromiljø er blevet godt etableret. Det er også godt accepteret, at tumor-associerede B7-H1 kan hjælpe tumorcellerne unddrage immunovervågning ved at inhibere funktionen af ​​effektor T-celler og forbedre funktionen af ​​tregs i colorektal cancer [36]. Og vores resultater understøtter dette begreb for høj ekspression af B7-H1, som kan lamme værten immunesurveillance er forbundet med dårlig prognose i colorektal cancer.

Men funktionen af ​​B7-H1in undertrykkelsen af ​​tumorimmunitet er stadig ikke fuldt forstået. For eksempel, hvordan B7-H1 regulerer T-cellefunktion og den formodede ikke-PD-1-receptoren, skal identificeres. Identifikationen af ​​B7-1 som ny B7-H1-receptoren gjort spørgsmålet mere komplekst, og kompleksiteten af ​​disse molekylære vekselvirkninger antyder, at B7-H1 eller PD-1 blokade alene ikke kan være tilstrækkelig til at blokere de inhiberende pathways. Og vores resultater gør dette spørgsmål endda blive mere kompliceret. Vores resultater viste, at cellerne med reduceret B7-H1-ekspression havde nedsat celleproliferation, migration og invasion. Derudover reducerer B7-H1expression førte til øget celle apoptose (figur 3 og 4.). Selv om en mere detaljeret mekanisme skal blive opdaget for at forklare vores resultater, disse resultater dokumenterer, at B7-H1 kan være ikke blot en ligand for PD-1 eller en formodet non-PD-1-receptoren, men også fungere som et onkogent molekyle. Tilsammen vores resultater og tidligere litteratur, kan vi få den konklusion, at B7-H1 kan accelerere progressionen af ​​colorektal cancer selvom inhibere funktionen af ​​T-celle og øge graden af ​​malignitet af colorektal cancer-celle, hvorved det er forbundet med dårlig prognose i patienter med tarmkræft.

Vi har også bemærket en nylig litteratur får en modstridende konklusion med vores undersøgelse.