PLoS ONE: Den Indflydelse af Tissue Iskæmi Time på RNA Integritet og patient-afledte Xenografter (PDX) Anslag af transplantatet Rate i en ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) Biobank

Abstrakt

Introduktion

Bio-depoter er uvurderlige ressourcer til at gennemføre translationel kræftforskning og kliniske programmer. De repræsenterer en af ​​de mest effektive værktøjer til biomolekylære studier af klinisk kommenterede kohorter, men prøver af høj kvalitet er forpligtet til at generere pålidelige molekylære aflæsning og funktionelle studier. Formålet med vores undersøgelse var at definere effekten af ​​kræft væv iskæmi tid på RNA og DNA kvalitet, og til generering af Patient-afledte Xenografter (PDXs).

Metoder

One-hundrede femogtredive lungekræft prøver blev udvalgt blandt vores Institutionelle

biobank

prøver. Foreninger mellem forskellige varme (kirurgisk) og kold (ex-vivo) iskæmi tidsintervaller og RNA kvalitet eller PDXs engraftment satser blev vurderet. RNA kvalitet blev bestemt ved RNA integritet nummer (Rins) værdier. Friske levedygtige fragmenter væv blev implanteret subkutant i NSG mus og serielt transplanteret

Resultater

RNA med et RIN . 7 blev påvist i 51% af prøven (70/135), med værdier for RIN betydeligt lavere (OR 0,08, P = 0,01) i prøver bevaret i mere end 3 timer før nedfrysning. Højere kvalitet DNA-prøver havde en samtidig høj RIN. Treogtres primære tumorer (41 adenocarcinom) blev implanteret med en samlet indpodning på 33%. Både langvarig varme ( 2 timer) og ex-vivo iskæmi tid ( 10 timer). Var forbundet til en lavere engraftment sats (OR 0,09 P = 0,01 og OR 0,04 P = 0,008, henholdsvis)

Konklusion

RNA kvalitet og PDXs transplantation sats blev negativt påvirket af langvarig iskæmi gange. Korrekt væv indsamling og behandling reducerer dumpeprocent. Samlet set NSCLC biobank repræsenterer et innovativt modalitet, som med held kan udføres i rutinemæssige kliniske omgivelser, hvor strenge standardprocedurer vedtaget

Henvisning:. Guerrera F, Tabbò ​​F, Bessone L, Maletta F, Gaudiano M, Ercole E, et al. (2016) Den Indflydelse af Tissue Iskæmi Time på RNA Integritet og patient-afledte Xenografter (PDX) Anslag af transplantatet Rate i en ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) Biobank. PLoS ONE 11 (1): e0145100. doi: 10,1371 /journal.pone.0145100

Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ‘, ITALIEN

Modtaget: Juli 4, 2015; Accepteret: November 28, 2015; Udgivet: 5 jan 2016

Copyright: © 2016 Guerrera et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er stadig den hyppigste årsag til kræftdødsfald [1]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den mest almindelige undertype, og den kliniske-patologiske mellemstation betragtes som den gyldne standard for at definere patienternes prognose. Ikke desto mindre er korrekt definition af kliniske resultater i hvert enkelt patient er stadig problematisk [2]. Selvom I det sidste årti nye terapeutiske tilgange, herunder molekylære behandlinger, er der blevet indført en omfattende molekylær-klinisk karakterisering for den enkelte fortsat anvendelse kun en brøkdel af patienterne og begrænset til sygesikring udbyder politikker. Endelig, selv i de bedste indstillinger, er resultaterne stadig yderst dystre.

Der er en overvældende enighed om, at for at fremme vores kliniske succes, er absolut nødvendigt et detaljeret kort over de patogenetiske mekanismer kørsel lungekræft. For at opnå patientens specifikke og omfattende fingeraftryk integration af flere analytiske modaliteter (fx genomisk, transkriptom, proteomisk) og egnede prøver (fx vævsprøver, plasma) [3] er påkrævet. I sidste ende, forventes den viden, der vil dukke op til at blive hurtigt omsættes til personlige behandlingsprotokoller. Offentlige bio-depoter af molekylært karakteriserede og klinisk kommenterede prøver menes at repræsentere et meget værdifuldt værktøj til projektering og udførelse af innovative og mere vellykkede behandlinger.

Når bio-repository indsats er forbundet til patienten-Afledte Xenografter, deres værdier stige enormt. Faktisk PDX modeller repræsenterer forkant i translationel forskning [4], og når forbundet til Næste generations sekventering (NGS) analyser giver en uovertruffen værktøj. Da satsen for PDX indpodning er forbundet med flere variable, herunder arten af ​​tumorerne, stadium af sygdommen, og kvaliteten af ​​væv prøveudtagning en hurtig erhvervelse væv og en korrekt håndtering af friske prøver er absolut kritisk.

Toward herpå overførsel af kirurgiske prøver fra operationsstuen (OR) til den kirurgiske patologi teater kræver en skarp organisation, stand til at gennemføre strenge Standard Operating Procedure (SOP) i en integreret tværfaglig netværk [5]. Da en rettidig overførsel begrænser ex-vivo iskæmi tid, bør afsættes en betydelig indsats for at forbedre dette kritiske skridt begunstige den bedste bevarelse af de patologiske eksemplar. Vores formål var at definere virkningerne af cancervæv iskæmitid om kvaliteten af ​​lungekræft prøver opbevaret i vores bio-repository og hvordan dette kan påvirke molekylær high-throughput analyser og udvikling af nye prækliniske in vivo modeller.

Her beskriver vi en protokol for væv samling, der forestiller den umiddelbare bevarelse af de kirurgiske prøve ved hjælp af et vakuum forsegling metode inden for OR facilitet, efterfulgt af prøve transport ved 4 ° C til kirurgisk patologi.

Metoder

A. Patient Kohorte Beskrivelse

Vi analyserede retrospektivt lungekræft prøver indsamlet fra 135 patienter, som gennemgik kirurgisk resektion 2010-2012 med indledende helbredende hensigt. Patienter behandlet med præoperative protokoller (

jeg

.

e

. Kemoterapi, strålebehandling), blev inkluderet. Inden for biorepository matchede normale lungevæv, mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) blev serum- og spytprøver erhvervet.

B. Informeret samtykke

En dedikeret informeret samtykke vedrørende opbevaring af humane prøver, blev almindelig brug i forskning og molekylære analyser udvikles. Der er lagt særlig vægt på følgende spørgsmål:

Formålet med undersøgelsen

Frivillig deltagelse

Indsamling af kliniske og demografiske data

Privatliv og fortrolighed

Fordele og risici ved deltagelse

Re-kontakt for opfølgning informations- og forskningsresultater tilbage

Tilbagetrækning af samtykke

Sekundær forskningsprojekt

Sample ejerskab og intellektuel ejendomsret

Bio-prøver og bio-væske opbevaring

for hver patient indskrevet i biobank protokollen, skriftligt informeret samtykke blev indsamlet i præoperativ omgivelser ved deltager kirurg af Thoraxkirurgisk afdeling og patienten blev indspillet i biobanken Registry. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board af Azienda Ospedaliera Universitaria, Citta ‘della Salute e della Scienza di Torino.

C. Indsamling Protocol

Spyt prøver blev indsamlet præoperativt med Oragene • DNA (OG-500) til langtidsopbevaring. Blodprøver (10 cc) blev perioperativt erhvervet i BD Vacutainer rør (2 hepariniseret og 2 ikke-hepariniserede rør) og forarbejdet. PBMC’er, plasma og serum, blev høstet og hensigtsmæssigt lagres. Vævsbanken holdet blev advaret dagen før operationen.

Prøverne blev bevaret og overført til patologi laboratorium ved hjælp af vakuum pakning og køling (VPAC) procedure [6, 7]. Kort fortalt i OR, eksplanteret kirurgiske prøver blev straks placeret i beta-ray steriliseret plastposer og vakuum-forseglet ved hjælp af TissueSAFE maskinen (Mod VAC 10, af Milestone, Bergamo, Italien. Www.milestonemedsrl.com), som standardprocedure i vores institution [8]. Prøver blev derefter bevaret og bragt til patologilaboratorier, i afkølet (ved 4 ° C) plastkasse, og yderligere opbevaret ved 4 ° C før bearbejdning.

Rutinemæssige histo-patologiske procedurer blev integreret med biobank protokol (S1 fig). Hver prøve blev orienteret, målt, og beskrevet, er klar over, at samlingen ikke vil påvirke den patologiske diagnose. Derefter blev tumormasser udskåret og samplet. Samtidig blev den normale lungevæv taget fra en distal uengagerede område (S2 Fig). Tissue fragmenter blev opbevaret i forskellige medier: i OCT (Sukura Finetek, Torrance, CA) for frosset væv skæring, RNA

senere

® Stabilisering Solution (Life Technologies) til RNA ekstraktion og snap-frosne og derefter holdt i -80 ° køleskab. Endelig var små vævsfragmenter (2x2x2 mm) anbringes i en frysemedium (59% RPMI, 30% FBS, 10% DMSO, 1% pen-strep) og derefter opbevaret i flydende nitrogen. Repræsentative diagnostiske prøver gennemgik rutinemæssige histopatologiske behandlingsprocedurer. Relaterede patient informationer (oplagring og kryopræservering gange og kliniske, befolkningsudviklingen og histopatologiske data) blev opbevaret i biobanken Registry.

D. DNA /RNA-ekstraktion og kvalitetsvurdering

Genomisk DNA blev ekstraheret med standard phenol-chloroform ekstraktion metode [9].

Vævsprøver blev homogeniseret i Trizol og RNA blev ekstraheret som for producentens instruktioner. For at fjerne enhver genomisk DNA-kontaminering, når til stede, blev RNA-prøver udsat for deoxyribonuclease behandling og re-ekstraheret ved anvendelse af phenol-chloroform metoden [10].

Den samlede DNA og RNA blev kvantificeret med NanoDrop 2000c (Thermoscientific) instrument og absorbansen forholdene ved 260 nm /280 nm og 260 nm /230 nm blev registreret. Totale RNA’er (1 pi) blev analyseret i en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) under anvendelse af RNA Nano LabChips (Caliper Technologies Corporation, Hopkinton, MA). RNA integritet nummer (RIN) værdier blev etableret som empiriske målinger af RNA integritet.

E. cDNA-syntese og QRT-PCR

Totalt RNA blev revers-transkriberet før realtids-PCR-amplifikation. 1 ng samlet RNA blev behandlet med DNAseI rekombinant, RNase-fri (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og revers-transkriberet under anvendelse af Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. RT-qPCR blev udført med et termisk iCycler (Bio-Rad) ved anvendelse af iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) ifølge producentens anvisninger. PCR cycling var som følger: 95 ° C i 5 minutter efterfulgt af 40 cyklusser ved 94 ° C i 10 sekunder og derefter 60 ° C eller 62 ° C i 30 sekunder. For at bekræfte amplifikation specificitet, blev PCR-produkter udsat for analysen af ​​smeltekurve, linearitet, og hældningen af ​​standardkurve under anvendelse CFX software (Bio-Rad). Alle PCR-assays blev udført tredobbelt

mRNA ekspressionsniveauer blev evalueret for 3 forskellige husholdningsgener:. GAPDH, actin og HUPO. Primer sæt blev designet ved hjælp Primer3 (S1 tabel).

F. Multiplex PCR

DNA integritet blev estimeret ved en multiplex-PCR med et sæt af 5 par oligoprimere designet til at amplificere forskellige DNA-mål (100, 200, 300, 400 og 600 bp) (S2 tabellen) [11]. Primere blev tilsat i 1: 1: 1: 2-forhold til at opnå PCR-produkter med samme intensitet efter agarosegel separation. DNA-amplifikation blev udført som følger: præaktivering 7 min ved 95 ° C (1 cyklus) efterfulgt af 40 cykler: denaturering 45 sekunder ved 95 ° C, annealing 50 sekunder ved 60 ° C, forlængelse 1,30 min ved 72 ° C med endelig forlængelsescyklus på 15 minutter ved 72 ° C. PCR-produkter blev separeret ved agarosegelelektroforese (2% agarose i TBE-buffer 1%).

G. Patient Afledte Xenografter (PDX)

NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ (NSG) mus blev venligst stillet til rådighed af L. Shultz fra The Jackson Laboratory og opdrættet i Molecular Biotechnology Center (MBC) Animal Resource, under streng specifikke og opportunistisk patogen fri (SOPF) betingelser.

dyret protokol for denne undersøgelse blev revideret og godkendt af Animal udvalg fra University of Torino.

Kort fortalt PDXs blev etableret ved hjælp af friske eller frosne patologiske væv fragmenter, når tilstrækkeligt materiale var til rådighed for rutinemæssige diagnostiske og molekylære analyser. Tumor-implantatet prøver blev skåret i flere 2x2x2 mm stykker (flere stykker /specimen) i komplette medier. Seks- til otte uger gamle NSG blev først bedøvet (Rompun 0.05μl /g e Zoletil 1.6μg /g i.m.), og deres dorsale region blev steriliseret (70% ethanol). En hud snit (0,3 cm) blev efterfølgende foretaget langs ryggens midtlinie retronuchal regionen og en lille lomme blev skabt ved stump dissektion. Flere tumor-implantatet vævsfragmenter (2-4) blev overført til hver subkutan lomme ved stump-endede pincet. De skårne kanter blev forseglet med et enkelt metal klip. Musene blev regelmæssigt kontrolleres, indtil de blev vagt. Implanterede dyr blev opstaldet i grupper af samme køn. Implant vækst blev vurderet ved palpering, og når der kræves tumormasser blev høstet ( 1,5 cm

3). Modtager dyr blev kontrolleret regelmæssigt og aflivet på tidligt tegn på nød. Ved høst blev musene aflivet i en CO2 kammer og tumorgrafts opsamledes til histologisk evaluering, molekylære undersøgelser, re-podning, eller lynfrosset i flydende nitrogen.

H. Undersøgelse Resultater og statistiske analyser

kategoriske data præsenteres som nummer (procent,%), er løbende data præsenteret af deres median (interkvartile område, IQR).

RIN blev beregnet i alle prøver som surrogat for vævskonservering. En RIN på ≥7 blev fastsat som en cutoff at udføre RNA microarray udtryk arrays og RNAseq analyser.

PDX transplantation blev betragtet som en succes, når tumorer blev genereret efter mindst to passager og deres patologiske funktioner blev bekræftet ved histologi og immunhistokemi. Pearson chi-square test og Fishers eksakte test, når det er passende, blev anvendt til at vurdere forskellene i de podet og ikke-inkorporerede grupper: tumor dimension, histologi tumor grading, patologisk TNM stage, resektion status, tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) , tilstedeværelse af mikrovaskulære invasion og kirurgisk varighed blev bestemt.

indflydelsen af ​​væv iskæmi gange på RIN kvalitet og PDX transplantation succes var de primære endepunkter af undersøgelsen.

varm iskæmi

tid var tænkt som den samlede kirurgiske varighed og

ex-vivo (kold) iskæmi tid

blev defineret som tidsrammen mellem anskaffelse af enheder i den kirurgiske teater og tidspunktet for deres kryopræservering

Som et andet endepunkt, vi evaluerede RNA ekspressionsniveauerne og genomisk DNA integritet i en tilfældigt valgt delmængde af prøver (

prøve

kommando i STATA):. vi valgt 3 prøver med lav kvalitet RIN og 3 med høj kvalitet RIN blandt hver iskæmi tid klasser. Gene-ekspression resultater blev vurderet som absolut udtryk i form af Kvantificering cyklusser (Cq mener). Forskelle mellem grupper blev undersøgt ved Wilcoxon-Mann-Whitney-test. blev også analyseret Året indkøb

I forbindelse med vores forskning, vi grupperet tilfælde i fire klasser i henhold til tidligere vivo iskæmi gange:. ≤1 timer, 1-2 timer, 3-5 timer, 6 -9 timer og ≥10 timer.

Sammenhængen mellem RNA kvalitet (RIN af ≥7) eller PDX engraftment satser og individualiseret grupper blev vurderet ved hjælp af logistisk regressionsmodel. For at undgå mulige forstyrrende påvirkninger, blev en justeret multivariat logistisk regressionsmodel, herunder følgende kirurgiske og patologiske variabler udført: histologiske undertyper (adenocarcinom som reference), tumor grading (G1 som reference), patologisk TNM stadie (fase I som reference) og kirurgi varighed (timer, som kontinuerlig).

Odds ratio (OR) og de tilsvarende konfidensinterval 95% (95% CIS) blev leveret for hver model. Alle statistiske analyser blev vurderet ved hjælp af STATA (version 12.1).

Resultater

A. Klinisk og patologisk funktioner

I alt 135 lungekræft prøver blev undersøgt. Tabel 1 opsummerer deres kliniske, kirurgiske og patologiske egenskaber. Median alder ved operation var 69 år (IQR 64-75), patienter var oftere mænd (92, 68%) og rygere (106, 81%). Median kirurgisk varighed (IQR 1-3) og median ex vivo iskæmitid (IQR 1-6) var både på 2 timer. Median tumorstørrelse var 3 cm (IQR 2-5) og tumor patologisk TNM faser var som følger: stadium IA 32 (23%), IB 13 (10%), IIA 21 (15%), IIB 13 (10%), IIIA 37 (27%) IIIB 1 (1%), IV 18 (13%). Adenocarcinom var den mest almindelige histologiske subtype (89, 66%) efterfulgt af pladecellecarcinom (31, 23%), storcellet carcinom (7, 5%), carcinoid (4, 3%), sarcomatoid (2, 2%) , adenosquamøst (1, 1%) og småcellet (1, 1%). Ifølge Travis adenocarcinom klassifikation [12], observerede vi 44 (55%) acinære adenocarcinom, 21 (26%) fast, 10 papillær, 3 mucinous, 2 lepidic og 9 NOS. Ninety-fem (70%) patienter blev forelagt lobectomy, 14 (10%) til bilobectomy, 13 (10%) til pneumonectomy og 13 til sub-lobar resektion; positive resektionsmarginer blev observeret i 13 tilfælde (10%, 10 R1 og tre R2).

B. RIN Kvalitet

En RIN ≥7 blev observeret i 51% af prøven (70/135): Den procentdel af prøver med en høj RNA kvalitet i henhold til de forskellige ex-vivo iskæmi tid er illustreret i fig 1A. Repræsentative elektroferogrammer viser RNA integritet foranstaltninger af 12 repræsentative prøver (Fig 2, nederste panel) opnået ved opsparede frisk frosset lungecancer prøver.

A- Procentdel af prøver, der er egnede til genekspression arrays (RNA integritet nummer [RIN ] på ≥7) ved forskellige ex-vivo gange indkøb (tid fra kirurgisk fjernelse til kryopræservering) for ≤1 timer, 1-2 timer, 3-4 timer, 5-9 timer og ≥10 timer. B- Forholdet mellem ex-vivo gange indkøb ( 1 og 1-2 timer, fra excision til kryopræservering) og egnethed til genekspression arrays (RNA integritet nummer [RIN] på ≥7) og tidsperioder 2010, 2011, og 2012 .

repræsentative elektroferogrammer (Agilent 2100 Bioanalyzer) viser RNA integritet målt ved RNA-integritet nummer (RIN) på 12 repræsentative prøver (nederst).

Brug en multivariat justeret model vi viste, at prøver opbevaret efter forskellige intervaller vise et fald på RIN værdi snart efter 2 timers ex vivo iskæmitid (kold iskæmi): 3-4 timer (eller 0,08, P = 0,044), 5-9 timer (eller 0,15, P = 0,011) og ≥10 timer (eller 0,25, P = 0,022) (tabel 2). Omvendt kirurgisk tid (varm iskæmi) ikke påvirke RNA kvalitet.

Multivariat logistisk regressionsanalyse på 135 NSCLC prøver.

Ingen forskel i andelen af ​​prøver med høj kvalitet RNA blev påvist i overensstemmelse med års opbevaring, histologi og tumor klasse: fig 1B viser procentdelen af ​​tumor prøver med RIN på ≥7 og ex-vivo indkøb tid, ifølge biobanker indkøb. Omvendt blev en høj pTNM scene er forbundet med lave RIN værdier ( 7, P 0,05).

C. mRNA Expression Level

udvalgtes Otteogtyve sager tilfældigt at vurdere mRNA kvalitet ved at evaluere ekspressionsniveauer af housekeeping-gener. Som vist i figur 3A, CQ værdier opnået er mellem 18 og 37. Cq med mere end 25 cykler er blevet observeret i prøver med RIN 4, mens der i prøver med RIN værdier inden 4-10, kan disse gener effektivt detekteres med færre cykler (20 til 25 cykler). Prøver med lavere udtryk blev fortrinsvis observeret i gruppen med ≥ 3 timers ex vivo iskæmi tid.

A- CQ ekspressionsniveauer for husholdning gener i tilfældigt udvalgte 28 prøver er repræsentative for hele tiden kategorier. B- Gelelektroforese af 28 genomisk DNA amplificeret med multiplex-PCR amplifikation ved forskellige antal af uædle paires (100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 600 bp).

D. Høj molekylvægt (HMW) Genomisk DNA Integrity

De samme 28 prøver anvendt til RNA-bestemmelse blev også vurderet for deres genomiske DNA integritet (figur 3B). Tilstedeværelsen af ​​bånd ved hver størrelse blev anvendt som et surrogat for kvaliteten af ​​DNA’et, overvejer amplifikation gennem 600 bp som den højeste kvalitet DNA værdi. Prøver med lavere RIN for hver tidsramme grupper havde også dårlig DNA kvalitet. Observeret DNA kvalitet synes at være ens i alle områder af ex-vivo iskæmi tid.

E. PDX Anslag af transplantatet

Sixty-tre primære tumorer (41 adenocarcinom, 18 pladecellekræft, 3 store celle karcinom og 1 sarcomatoid karcinom) blev implanteret, med en samlet total engraftment på 33% (21/63).

Tumorer med større dimensioner ( 3 cm, 23/25 vs 16/38, p 0,001) og en højere patologisk stadium (III-IV, 15/25 vs 13/38, p = 0,048) var oftere implanteret. Pladecellekræft (12/25 vs 6/38, P = 0,017) og tumor med resektion marginer involvering (R1-R2, 4/25 vs. 1/38, P = 0,064) også oftere indpodet. Blandt adenocarcinom blev fast histologi forbundet med vellykket transplantation (6/11 vs. 7/27, P = 0,09). Omvendt høj tumor grading (G3; 12/25 vs. 15/38), positiv TIL (16/17 vs. 30/34) og tilstedeværelse af mikrovaskulære invasion (4/23 vs. 13/38) havde lignende frekvens i podet og ikke-podet grupper.

Multivariate justerede model viste sammenhængen mellem både langvarig ex-vivo iskæmi (kold iskæmi længere end 10 timer), udvidet kirurgisk tid (varm iskæmi længere end 2 timer) med en lavere engraftment sats (P = 0,047 og P = 0,008 henholdsvis tabel 3)

Multivariat logistisk regressionsanalyse på 63 NSCLC sager

Omvendt pladecellehistologi (OR 8,55;.. P = M 0,01) og høj tumor scenen var forbundet med den engraftment succes (OR 8,06; P = 0,053)

Vi undersøgte frosne tumorprøver PDX transplantation sats yderligere.. Af de 21 PDX linjer frembragt, valgte vi 8 tumorer og vi implanteres de tilsvarende primære frosne prøver høstet på operationsstedet tidspunkt. Fire af de otte prøver (50%) effektivt voksede, generere en PDX linje sammenlignes med den friske-afledte én.

Diskussion

Formålet med vores undersøgelse var at vurdere den samlede væv kvalitet lungekræft prøver opbevaret i vores bio-repository. Vi har også til formål at afgrænse indflydelse iskæmi tid på lungekræft prøver og hvordan iskæmi kan påvirke molekylær high-throughput analyser og realiseringen af ​​prækliniske in vivo modeller.

Resultatet af vores undersøgelse tyder på, at (1) RIN værdien væsentligt påvirket af ex-vivo iskæmi tid, tumor sortering og pTNM fase; (2) Patient-Derived Xenografter indpodning-rate succes er også forbundet med lav ex vivo iskæmi-tid, lav kirurgisk varighed (varm iskæmi tid) og skællede-celle histologi; (3) mRNA husholdning gener ekspressionsniveauerne og high-molekylær-vægt (HMW) genomisk DNA integritet er relateret med RIN score og kan bruges som reproducerbare biomarkører for vævskonservering.

Ved at implementere Standard Operating Procedures (SOP) vi var i stand til at kryopræservere 135 primære lungekræft prøver med det mål at generere en stor høj kvalitet biorepository, og uden at kompromittere histopatologisk diagnose. Hvert trin i denne proces er kritisk: dette belyse den rolle, der spilles af en organiseret hold og en korrekt visitation evaluering af prøven i Patologi værelset. Det VPAC systemet, allerede vist sig at bevare prøver integritet, blev vedtaget som gold standard procedure for at opnå levende væv [6-8]. Men mens der i brystkræft væv RNA, DNA og proteiner kan optimalt bevares for 24 [7, 13], her viste vi, at lungevæv er langt mere fornuftigt at denne gang. . Dette kan tyde på, at ex-vivo iskæmi kan påvirke cellernes levedygtighed og molekylære resultater afhængigt af oprindelsen af ​​væv

Der er en generel accept på betydningen af ​​at anvende intakt RNA i genekspression analyse og RIN af 7 kan godtages som afskæringsværdi for prøver egnethed [14,15]. I vores repository, 51% af prøverne viste RIN 7, med en gunstig udvikling gennem årene. Dette resultat ligger i mellem dem rapporteret for prostatakræft (60-81% [16]), coloncancer (80% [17]) og dem der er beskrevet i pancreascancer (40% [14]). Mulige forklaringer på disse forskelle kan skyldes heterogenitet cellulære indhold, ulig nedbrydning af forskellige væv, inter-operatør variabilitet mv Selvom flere faktorer kan påvirke augmented nedbrydning af RNA, den antagelse, at ex-vivo iskæmi-tid er strengt forbundet med graden af ​​RNA-nedbrydning forekommer rimelig. Her blev et fald i RNA kvalitet observeret fra 3 timer efter kirurgisk resektion. Dette resultat er i overensstemmelse med en tidligere rapport om kursus nedbrydning i lungevæv: forfatterne fundet nedsat nukleinsyre stabilitet fra 5 timer efter kirurgi [18]. Tilsvarende begrænset ex vivo iskæmitid syntes at korrelere med optimal RNA integritet i colon cancer (6-16 timer) [17], brystcancer (3 timer) [19], prostatacancer (2 timer) [16, 20], og i bugspytkirtlen kræftvæv. Lang kirurgisk tid påvirkede ikke RNA integritet, som det ville forventes, hvis vævsiskæmi var den eneste forklaring på RIN falde. Desuden mRNA ekspressionsniveauerne og HMW genomisk DNA integritet syntes at være delvist forbundet med RIN score, men viste reduktion mindre kvalitet, når korreleret med ex-vivo iskæmi tid. Dette kan redde en stor del af den 49% af prøverne med lavere RIN ( 7%), da de kan anvendes til klassiske molekylære teknikker. I vores undersøgelse var høje pTNM stadier også forbundet med en reduceret RIN score. En mulig forklaring kunne være den kirurgiske manipulation og den efterfølgende RNase udgivelse som postuleret formular Bertilsson og Harveer om prostatakræft [20].

Patient-afledte xenopatients betragtes i dag, meget pålidelige prækliniske musemodeller. Etableringen af ​​dette værktøj kræver avancerede forskningsfaciliteter og indfører tekniske og logistiske udfordringer, og er for nylig blevet evalueret som en grundlæggende kilde til biologisk materiale og terapeutisk relevante informationer [21, 22]. Brugen af ​​friske og frosne primær tumor prøver stammer fra en

Biobank

ressource demonstrerede gennemførligheden af ​​denne fremgangsmåde, især når der sættes forskellige indsatser sammen i en velintegreret netværk. Vores gruppe drager fordel af direkte implantation i mus, subkutant, af friske eller frosne væv fragmenter afledt fra kirurgisk resektion patienter. Den engraftment på 33%, selv væsentligt sammenlignelige med dem, der allerede bekræftet (25% -35%) af andre grupper i en subkutan indstillingen [23-25], resulterede lidt lavere end forventet i betragtning af den store tilbøjelighed NSG model til transplantation. Men vi observeret en ganske høj procentdel (29%) af indpodede adenocarcinomer, der resulterer sædvanligvis mindre tilbøjelig til implantation sammenlignet med pladecelletumorer. Iskæmi tid indflydelse på transplantation sats vist, at en langvarig kirurgisk (varm) iskæmi periode negativt er forbundet med succes transplantation [25] i stedet for total (varm og kold) tid. Andre karakteristika påvirker engraftment rate: tumor dimension ( 3 cm), patologisk stadium (III-IV) og pladecellehistologi have en indvirkning på transplantation sats, hvilket tyder på, at også iboende biologiske egenskaber tumoren spille roller i fastlæggelsen af ​​PDX succes generation. Det samme gælder for PDX generation fra frosne tumorprøver. Evnen til re-generere 50% af PDX linje fra kryopræserverede materialer tyder på, at forskellige elementer kan påvirke væv biologi; dog fremhæve muligheden for at gå tilbage med tilbagevirkende kraft i vævet biobank og hente specifikke molekylære definerede tumorer for at generere passende PDX line nyttig til

ad hoc

prækliniske screeninger.

Til dato, ingen undersøgelser der er gennemført sammenligning af forskellige væv bevare metoder. Men i betragtning af dens evne til at bevare cellemorfologi, epitop integritet og nukleinsyrer stabilitet, vi brugte VPAC systemet til væv opbevaring, spekulere en positiv indflydelse også på PDX transplantation sats.

Samlet disse data indikerer, at generation af en lungekræft biorepository er en mulig tilgang og kræver komplekse netværk indsats integrerer forskellige biomedicinske kompetencer. Således veldesignede protokoller er fundamental for korrekt og effektiv

Biobanker

. Patologer, onkologer, thorax kirurger, sygeplejersker, biologer, teknikere, epidemiologer og medicinske statistikere skal samarbejde i en fælles operativ arbejdsgang for at sikre ikke blot prøver af høj kvalitet, men også passende behandling protokol, korrekt opbevaring, dataindsamling, epidemiologiske analyser effektivt koordinerede projekter .

Vores tilgang giver biorepository af en dyrebar samling af prøver til omfattende undersøgelse på NSCLC. Især kan en høj kvalitet RNA og DNA anvendes til næste generation Sequencing teknikker, såsom RNAseq, Whole Exome Sequencing og Whole Genome Sequencing, men også nukleinsyrer med lavere kvalitet kan reddes for standard genekspression teknikker (dvs. kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktioner). Endelig tilgængeligheden af ​​friske og frosne tumorprøver udgør en uvurderlig ressource for at generere Patient-afledte xenografter (PDX) linjer [26].

Konklusion

Den molekylære lagdeling af NSCLC i seneste æra af “præcision medicin” har understreget vigtigheden af ​​at opretholde serier af høj kvalitet prøver høje integreret med klinisk-patologiske data. Disse repositories kan undersøges ved næste generation sekventering og er obligatoriske for generering af stabile prækliniske modeller.

Her rapporterer vi en reproducerbar og pålidelig metode til at generere en vævsbank for NSCLC, og vi beviser på den kritiske værdi af enheder ‘kvalitet til efterfølgende undersøgelser. Faktisk blev RNA kvalitet og PDX transplantation rate negativt påvirket af langvarig iskæmi tid, og dermed en korrekt, overvåges og veltilrettelagt væv samling kan reducere dumpeprocent.

Samlet set NSCLC biobank repræsenterer en innovativ modalitet, der kan held henrettet i en rutinemæssig klinisk miljø inden for alle institutionerne, men kræver valideret standardprocedurer.