PLoS ONE: Mutation Analyse af RAD51C og RAD51D gener i High-Risk Kræft i æggestokkene Patienter og familier fra Tjekkiet

Abstrakt

Nylige undersøgelser har tillagt, at

RAD51C

RAD51D

gener, som koder for de væsentlige proteiner involveret i homolog rekombination, er ovariecancer (OC) modtagelighed gener, der kan forklare genetiske risici i højrisikopatienter. Vi udførte en mutation analyse i 171 høj risiko

BRCA1

BRCA2

negative OC patienter, for at vurdere hyppigheden af ​​arvelige

RAD51C

RAD51D

varianter i tjekkiske befolkning. Analysen involveret direkte sekventering, høj opløsning smeltning og multipel ligering-afhængig probe analyse. Vi identificerede to (1,2%) og tre (1,8%) inaktivering germlinie mutationer i begge respektive gener, hvoraf to (c.379_380insG, p.P127Rfs * 28 i

RAD51C

og c.879delG, p.C294Vfs * 16 i

RAD51D

) var roman. Interessant, en vejledende familie kræft historie var ikke til stede i fire luftfartsselskaber. Desuden aldre på de OC diagnoser på identificerede mutation luftfartsselskaber var væsentligt lavere end rapporteret i tidligere undersøgelser (fire luftfartsselskaber var yngre end 45 år). Endvidere har vi beskrev også sjældne missense varianter, to i

RAD51C

og en i

RAD51D

hvis klinisk betydning skal verificeres. Fjerner mutationer og sjældne missense varianter konstateret i OC patienter blev ikke påvist i 1226 kontrolprøver. Selvom den kumulative hyppighed af

RAD51C

RAD51D

beskærer mutationer i vores patienter blev lavere end for de

BRCA1

og

BRCA2

gener, kan det forklare OC modtagelighed i ca. 3% af OC højrisikopatienter. Derfor er en

RAD51C

RAD51D

analyse bør gennemføres i den omfattende multi-gen test for højrisiko-OC patienter, herunder tidlig debut OC patienter uden en familie kræft historie.

Henvisning: Janatova M, Soukupova J, Stribrna J, Kleiblova P, Vocka M, Boudova P, et al. (2015) Mutation Analyse af

RAD51C

RAD51D

Gener i High-Risk Kræft i æggestokkene Patienter og familier fra Tjekkiet. PLoS ONE 10 (6): e0127711. doi: 10,1371 /journal.pone.0127711

Academic Redaktør: Klaus Brusgaard, Odense Universitetshospital, DANMARK

Modtaget: Januar 23, 2015; Accepteret: 17. april, 2015; Udgivet: 9 Jun 2015

Copyright: © 2015 Janatova et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af intern Grant Agency, Sundhedsministeriet, Tjekkiet, NT13343, (https://www.mzcr.cz/Cizinci/) ; PP, karlsuniversitetet, PRVOUK-P27 /LF1 /1, (https://www.cuni.cz/UKEN-1.html); MJ, karlsuniversitetet, SVV-UK 3362-2014, (https://www.cuni.cz/UKEN-1.html); PB. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene (OC) er det den mest dødbringende gynækologiske malignitet, selvom det kun udgør 3% af de kvindelige kræftformer verdensplan. Dens ugunstig prognose relateret til en høj procentdel af sen-fase diagnose rangerer OC til fjerde plads blandt de mest almindelige kræftform-relaterede dødsårsag i kvindelige befolkning [1]. Dens forekomst i Tjekkiet er 23 /100.000 personer og dødelighed udgør 15 /100.000 personer [2].

Den vigtigste risikofaktor er en familie OC historie. Det er blevet antaget, at arvelig disposition udgør mindst 10% af OC tilfælde [3]. Derfor identifikation af kvinden bærer de patogene mutationer i OC-modtagelighed gener er en vigtig opgave muliggør skræddersyet forebyggelse OC i højrisiko-population. De fleste af arvelige OC (HOC) tilfælde er også forbundet med en øget risiko for brystkræft (BC) og de hyppigste patogene mutationer i arvelig bryst- og /eller æggestokkene (HBOC) kræft familier påvirker

BRCA1

gen og i mindre grad også

BRCA2

[4]. Begge gener spiller en vigtig rolle i reparation af DNA dobbelt-strenget pauser (DDSB). For nylig blev yderligere gener beskrevet som forbundet med HOC, blandt dem den

RAD51

paraloger

RAD51C

RAD51D

.

Begge gener koder for proteiner involveret i genomstabilitet vedligeholdelse og de deltager i den homologe rekombination-medieret DDSB reparation [5,6]. Indledende undersøgelser rapporteret

RAD51C

gen (MIM: 602.774) som en anden Fanconi anæmi (FA) genet betegnet som

FANCO

fordi dens biallele germlinie mutationer blev fundet hos en patient med FA-lignende fænotype svarende til komplementeringsgruppe O [7]. Pionerarbejde Meindl et al. viste, at

RAD51C

er en OC modtagelighed gen med en mutation frekvens på 1,3% i HBOC patienter [8]. Siden da har yderligere undersøgelser vist sig rollen som

RAD51C

gen i OC udvikling i op til 2,5% af HBOC familier højrisiko-[9,10,11,12] herunder sjældne store genomiske rearrangementer [13] .

En undersøgelse foretaget af Loveday et al. rapporterede, at germline mutationer i

RAD51D

gen (MIM: 602.954) giver følsomhed over for OC i 0,9% af HBOC familier (overvejende med mere end ét tilfælde af OC) og anslået den relative risiko (RR) på 6,3 for OC og 1,32 for BC [14]. Flere andre undersøgelser har bekræftet sin rolle i OC modtagelighed [15,16,17,18]

Mens individuelt sjældne, alle de moderate-penetrans gener sammen kan bidrage til en betydelig del af OC risiko.; Men deres frekvenser varierer i forskellige populationer [19]. Formålet med vores undersøgelse var at bestemme hyppigheden af ​​germlinie mutationer i

RAD51C

RAD51D

blandt højrisiko OC tjekkiske patienter negativt testet for

BRCA1

BRCA2

mutationer.

Metoder

Patienter

Vi analyserede 171 DNA-prøver (opnået fra perifert blod) fra

BRCA1

BRCA2

negative OC patienter indsamlet på vores institut mellem 2000 og 2013. De tilhørte enten en familiær gruppe (N = 62) eller en gruppe uden familie kræft historie (N = 109; tabel 1) [20]. Kontrolgruppen bestod af anonyme DNA prøver fra 1.226 personer, herunder 756 ikke-kræft enkeltpersoner og 470 bloddonorer, som beskrevet tidligere [21,22].

Alle patienter og kontroller var af centraleuropæisk afstamning af tjekkisk oprindelse fra Prag-regionen. Undersøgelsen blev godkendt af Etisk Komité General Universitetshospital i Prag og alle deltagere gav deres skriftligt informeret samtykke ved brug af lagrede DNA /RNA-prøver til forskningsformål.

Mutation analyse

Alle individuelle kodende exoner (med intron-exon grænser) adskilt af store intron regioner i

RAD51C

gen blev PCR-forstærket (primere er anført i S1 tabel) og analyseret af en høj opløsning smeltning (HRM) analyse på Light Cycler 480 (Roche) under anvendelse af en HOT FirePol EvaGreen HRM Mix (Solis Biodyne) ifølge producentens instruktioner.

Varianter i prøver med en afvigende smelteprofil blev bekræftet ved direkte sekventering af separate PCR-reaktioner ved anvendelse af BigDye v3.1 på ABI3130 (Applied Biosystems).

Alle kodende exoner (herunder intron-exon grænser) denne form fire exoniske klynger af

RAD51D

gen blev opformeret ved PCR og analyseret ved direkte sekventering (PCR og sekventering primere er anført i S1 tabel).

Alle exons med de identificerede mutationer blev screenet i 1.226 kontrolprøver af en HRM analyse og variant prøver blev bekræftet ved sekventering.

Påvisning af store genomiske rearrangementer (LGRs)

P260-A1 Kit blev brugt til en multiplex ligation-afhængig sonde forstærkning (MLPA) analyse i

RAD51C

efter fabrikantens protokol. De forstærkede produkter blev separeret på ABI3130 og analyseret af MRC Coffalyser software (MRC Holland). Den MLPA kit til

RAD51D

analyse var ikke fra nogen leverandør på tidspunktet for analysen.

cDNA analyse

For at bestemme virkningen af ​​intronisk variant c. 1026 + 5_1026 + 7delGTA flankerende at intron-exon grænse i

RAD51C

vi udført en cDNA-analyse. Det totale RNA isoleret fra venøst ​​blod blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af SuperScript III revers transkriptase (Life Technologies) ved at følge fabrikantens protokol. PCR-fragment, der spænder over den involverede region blev amplificeret (primere er i S1 tabel). PCR produkt, der indeholder vildtype og afvigende fragmenter blev sekventeret for at karakterisere afvigende splejsning variant.

I silico

analyse

patogenicitet af missense varianter blev vurderet ved hjælp af SIFT , PolyPhen, Juster GVGD, og ​​CADD score værktøjer som tidligere beskrevet [21,22]. Frekvensen af ​​identificerede varianter blev konstateret i NHLBI Exome Sequencing Project (ESP; https://esp.gs.washington.edu/drupal/). Og 1000 genomer (https://www.1000genomes.org/) databaser

Resultater

Patogene mutationer, der fører til trunkering af proteinprodukter blev identificeret i fem ud af 171 (3%) med høj risiko OC patienter, to (1,2%) i

RAD51C

og tre ( 1,8%) i

RAD51D

(tabel 2). To patogene ændringer var roman. Ingen LGR blev fundet i

RAD51C

gen, men vi kunne ikke udelukke en tilstedeværelse af LGRs i

RAD51D

gen, der ikke blev analyseret, fordi MLPA kit var utilgængelig i den tid af analysen. Ingen af ​​de identificerede ændringer blev fundet i 1.226 kontroller ikke-kræft. Den alder, diagnose og familiens historie af kræft i mutationerne befragtere er vist i tabel 2.

En roman c.379_380insG (p.P127Rfs * 28) variant i

RAD51C

blev fundet i en ung OC patient, der døde 12 måneder efter en diagnose af mucinøs adenocarcinom. En anden

RAD51C

beskærer variant var en splejsning-site ændring, c.1026 + 5_1026 + 7delGTA, identificeret i en patient, som udviklede endometrie karcinom syv år efter en diagnose af æggestokkene serøs adenocarcinom. Den patogene potentiale af denne ændring blev demonstreret af cDNA analyse, der afslørede afvigende exon 8 skipping, der resulterede i ramme-shift og for tidlig terminering af translation produkt (p.R322Sfs * 22, fig 1). Denne variant er tidligere rapporteret én gang i en kontrol og en patient, henholdsvis ved Loveday

et al

. og i en undersøgelse af Golmard

et al

. [10,11].

elektroforese (til venstre) af PCR-produkter amplificeret med primere placeret i exon 5 og 3’UTR-sekvensen (S1 Table) viser to produkter i en patient No.1273 sammenlignet med en vildtype skrive (C) prøve kontrol. Sekventering kromatogram af patientens PCR-produkt viser tilstedeværelse af afvigende splejset mRNA med exon 8 springe

beskrevet gentagne i vores undersøgelse kun beskærer mutation var c.694C . T (p.R232 *) i

RAD51D

, der findes i to uafhængige unge OC patienter med serøs adenokarcinom og ingen familie kræft historie. Den tidligere diagnosticeret patient døde af formidling OC 10 år efter diagnosen. Denne variant er tidligere beskrevet i spanske og amerikanske HBOC patienter [18,16]. En roman

RAD51D

mutation, c.879delG (p.C294Vfs * 16), blev fundet i en OC patient med en datter, der lider af BC og OC dobbelthed.

Udover de beskærer varianter, vi fundet tre sjældne missense varianter (tabel 2). Den c.641G A (p.R214H) mutation i

RAD51C

blev for nylig identificeret i en BC kvinde af afrikansk oprindelse [12] og beskrives som en lav variant risiko baseret på hendes familie historie, der er i overensstemmelse med software forudsigelser. Den anden sjældne missense variant c.947A G (p.H316R) var roman; Men begge disse ændringer i

RAD51C

blev forudsagt som ikke-sygdomsfremkaldende. Den eneste sjældne variant- c.629C T (p.A210V) -i

RAD51D

blev beskrevet tidligere [18] og blev forudsagt som patogene (tabel 2)

Andet opdaget sekvens varianter. præsenteret i et dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) eller HGMD (https://portal.biobase-international.com/hgmd/pro/start.php) databaser som polymorfier er angivet i S3 tabel.

diskussion

Vi identificerede kønscellelinie beskærer mutationer i

RAD51C

RAD51D

gener i 1,2% og 1,8% af analyserede høj- risiko individer, henholdsvis, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [23,24]. Vores undersøgelse giver yderligere beviser for, at begge gener giver en begrænset, men klinisk bemærkelsesværdig andel af OC modtagelighed.

Første undersøgelser rapporteret skadelige beskærer mutationer i

RAD51C

og

RAD51D

gener overvejende i HBOC familier med to eller flere OC sager [8,14]. Vi fandt imidlertid flertallet (fire ud af fem klart skadelige mutationer, tabel 2) i en undergruppe af 109

BRCA1

BRCA2

negative OC patienter uden BC eller OC familiens historie. Dette er i overensstemmelse med senere undersøgelser som identificerede

RAD51C

RAD51D

mutationer i en umarkeret population af OC patienter [25,16]. Disse resultater tyder på, at omfattende genetisk testning af

RAD51C

RAD51D

gener i OC patienter bør ikke kun begrænset til OC højrisikopatienter med en tilsyneladende familiens historie, og en analyse af alle OC patienter bør overvejes uanset til familien kræft historie og alder debut [26].

de gennemsnitlige alderen OC debut for kvinder med

RAD51C

og

RAD51D

mutationer offentliggjort i tidligere undersøgelser var 60 år for

RAD51C

(revideret i [23]) og 56,6 år for

RAD51D

(S4 tabel). Sopik

et al

. foreslået den forebyggende operation for at blive udskudt til efter naturlig menopause. Ikke desto mindre, i vores undersøgelse de gennemsnitlige alderen OC debut i bærere af beskærer varianter var 26,0 år for

RAD51C Hotel (25 og 27 år, henholdsvis) og 48,7 år for

RAD51D

(37, 43 og 66 år, henholdsvis). Mens et lille antal mutation luftfartsselskaber kunne påvirke denne observation, vi formoder, at det faktum, at fire af fem bærere af sygdomsfremkaldende mutationer i

RAD51C

og

RAD51D

gener var præmenopausale kvinder yngre end 45 år kunne være af klinisk betydning. Derfor er det nødvendigt at estimere de kliniske anbefalinger til yderligere undersøgelser af luftfartsselskaber i begge gener risikoreducerende bilateral salpingo-ooforektomi (RR-BSO), og indtil da, skal der tages den tidligste debut af OC i familien i betragtning. For nylig, Baker et al. rapporterede RR-BSO i en 39 år gammel kvindelig BC patient bærer

RAD51D

mutation fra familie med flere BC (men ingen OC) sager [24].

I vores undersøgelse, kun én proband, transporterer den patogene

RAD51C

mutation, vises familie kræft historie, der omfattede OC og BC sager. Da tidligere undersøgelser rapporteret nogen øget risiko for BC for de luftfartsselskaber, senere undersøgelser beskrevet nogle

RAD51C

RAD51D

beskærer mutationer i BC kun familier [13,27,28,18,24]. Selv om disse mutationer synes at være meget sjældne i BC patienter, de er sandsynligvis ansvarlig for visse BC disposition. De stamtavler mutationsbærere omfatte andre kræfttilfælde (endometrie, leukæmi, thyreoidea), hvis association med mutationerne skal analyseres nærmere i detaljer.

Vi identificerede også tre sjældne missense ændringer i begge gener (Tabel 2, S2 Tabel). Kun c.629C T, p.A210V sjældne missense variant i

RAD51D

gen blev forudsagt til at være skadelig konsekvent i alle brugte software forudsigelsesværktøjer. Dog kan dens patogenicitet ikke bekræftes uden yderligere adskillelse og /eller funktionelle analyser. Desværre var vi ikke i stand til at udføre en co-segregering analyse i andre familiemedlemmer slægtninge.

penetrans for mutationer i moderate penetrans gener er ikke let at vurdere [29]. Oprindeligt Meindl et al. rapporterede en komplet adskillelse af

RAD51C

mutationer i HBOC familier [8]. Yderligere undersøgelser anslået den relative risiko (RR) for OC for mutation luftfartsselskaber i

RAD51C

(RR = 5,9) og

RAD51D

(RR = 6,3) [10,14]. Pelttari

et al

. opdaget en odds ratio (OR) for finske grundlægger mutationer i hvert gen i en markeret befolkning til at være 6,3 og 7,1 henholdsvis [30,15]. Disse data tyder på, at OC risikoen overstiger tærsklen for moderate penetrans gener i

RAD51C

RAD51D

mutationer luftfartsselskaber og begge gener har klinisk betydning for diagnosticering og forebyggende skridt for de luftfartsselskaber, der involverer både OC og BC forvaltning. Yderligere undersøgelser og metaanalyser af offentliggjorte data fra forskellige befolkningsgrupper verden over er forpligtet til at estimere penetrans i

RAD51C

RAD51D

mutationsbærere overbevisende.

Den kliniske anvendelighed af identifikation af

RAD51C

RAD51D

mutation luftfartsselskaber er ikke begrænset til forudsigelse af kun modtagelighed kræft. Begge proteiner er involveret i DNA-skader signalering og DDSB reparation funktionelt samvirker med BRCA1 og BRCA2 i processer homolog rekombination (HR). En fejl i denne reparation vej, der kunne forventes i kræftpatienter transporterer germlinie patogene mutationer i

RAD51C

RAD51D

sensibiliserer kræftceller til PARP-inhibitorer; derfor, patienter transporterer kønscellelinie

RAD51C

RAD51D

mutationer kan drage fordel af denne behandling [14].

Som konklusion, vi beskrev nye patogene varianter i

RAD51C

og

RAD51D

og viste, at beskærer mutationer i begge gener kunne findes i 3% af tjekkiske OC højrisikopatienter. Vores resultater indikerer, at den begyndende OC i mutationsbærere kunne være yngre end forventet. Vi foreslår, at bør gennemføres mutation analyse af

RAD51C

RAD51D

ind i den omfattende multi-gen panel test i OC højrisiko patienter. yderligere undersøgelser i forskellige befolkningsgrupper, kan imidlertid bidrage til at forbedre estimaterne for den kliniske effekt for kimlinie mutation luftfartsselskaber og tillade bestemmelse af passende screening, opfølgning, eller forebyggelse strategier.

Støtte Information

S1 Table . . PCR primer sekvenser

Oversigt over PCR primere, der anvendes til sekventering, cDNA og HRM analyser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0127711.s001

(DOCX)

S2 Table.

I silico

forudsigelse for missense varianter.

Forudsigelse analyse af identificerede sjældne missense varianter i

RAD51C

RAD51D

gener og hyppigheden af ​​disse varianter i exome sekventering . og 1000 genomer projekter

doi: 10,1371 /journal.pone.0127711.s002

(DOCX)

S3 Table.

RAD51C

RAD51D

sekvens varianter

tidligere beskrevne ændringer (polymorfier, introniske varianter) findes i vores undersøgelse

doi:.. 10,1371 /journal.pone.0127711.s003

(DOCX)

S4 Table. Karakteristik af patienter bærer

RAD51D

patogene mutation

Ages af debut af 21 OC patienter og 15 patienter BC transporterer

RAD51D

mutationer i undersøgelser hidtil offentliggjorte

doi:.. 10,1371 /journal.pone.0127711.s004 Hotel (DOCX)

Tak

Dedikeret til mindet om vores kollega og ven, Petr Pohlreich, som gik bort, da manuskriptet blev skrevet.

Vi vil gerne takke Marie Epsteinova og Marketa Dostalova for deres fremragende teknisk support og patienterne og deres familier for bidrag i denne undersøgelse.