PLoS ONE: Behandling med insulinanalog X10 og IGF-1 øger Vækst af tyktarmskræft Allografts

Abstrakt

Fedme og type 2-diabetes er forbundet med en øget risiko for udvikling af visse former for kræft, herunder tyktarmskræft . Offentliggørelsen af ​​meget kontroversielle epidemiologiske undersøgelser i 2009 rejst den mulighed, at udnytte den insulin analog glargin øges denne risiko yderligere. Det er dog ikke klart, hvordan mitogene virkninger af insulin og insulinanaloger målt

in vitro

korrelerer med tumor vækstfremmende virkninger

in vivo

. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge mulige vækstfremmende virkninger af indfødte human insulin, insulin X10 og IGF-1, som anses for positive kontroller

in vitro

, i en kortsigtet dyremodel af en obesity- og diabetes-relevant cancer. Vi karakteriseret insulin og IGF-1 receptor-ekspression og respons på behandling med insulin, X10 og IGF-1 i den murine coloncancercellelinie (MC38 celler)

in vitro

in vivo

. Endvidere undersøgte vi farmakokinetik og farmakodynamik og overvåget væksten af ​​MC38 celle allotransplantater hos mus med diæt-induceret fedme behandlet med human insulin, X10 og IGF-1. Behandling med X10 og IGF-1 steget markant vækst i MC38 celle allotransplantater i mus med kost-induceret fedme, og vi kan derfor konkludere, at overnationale farmakologiske doser af insulin analog X10, som er super-mitogen

in vitro

og øget forekomst af brystkirtler hos hunrotter i en 12-måneders toksicitet, også øge væksten i tumor allotransplantater i en kortsigtet dyremodel

Henvisning:. Hvid H, Blouin MJ, birma E, Damgaard J, Poulsen F, Fels JJ, et al. (2013) Behandling med insulinanalog X10 og IGF-1 Øger Vækst af tyktarmskræft Allografter. PLoS ONE 8 (11): e79710. doi: 10,1371 /journal.pone.0079710

Redaktør: Josep Bassaganya-Riera, Virginia Tech, USA

Modtaget: 26 juli, 2013; Accepteret: September 24, 2013; Udgivet: November 18, 2013 |

Copyright: © 2013 Hvid et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af en bevilling (TFF-116.128) fra den canadiske Institute of Health Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende interessekonflikter at rapportere: H Hvid, J Damgaard, JJ Fels, F Poulsen, C Fledelius og BF Hansen er medarbejdere i Novo Nordisk og ejer aktier i selskabet. M Pollak er konsulent for Novo Nordisk. For alle resterende forfattere er der ingen interessekonflikter at rapportere. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Fedme og type 2-diabetes er forbundet med en øget risiko for visse kræftformer, såsom bryst-, pankreas- og tyktarmskræft [1] – [5]. Meget kontroversielle epidemiologiske undersøgelser antydet, at terapeutisk brug af insulin analog insulin glargin var forbundet med en øget risiko for udvikling af kræft [6], [7], men ORIGIN retssagen for nylig forudsat stærke beviser for, at dette ikke er tilfældet [8]. Men de epidemiologiske undersøgelser offentliggjort i 2009 og de efterfølgende drøftelser fremhævede betydningen af ​​vurderingen af ​​insulinanaloger præklinisk sikkerhed. Desuden har de beroligende resultater vedrørende glargin mindsker ikke forudgående dokumentation for en sammenhæng mellem type 2 diabetes og øget risiko eller dårligere prognose for visse kræftformer, herunder kræft i tyktarmen, og de mekanismer bag denne forening er stadig et vigtigt emne.

i denne sammenhæng insulinanalogen X10 er en interessant ligand. X10 blev udviklet som et hurtigtvirkende insulin-analog ved substitution af histidin i position B10 med asparaginsyre [9]. Denne enkelt aminosyresubstitution steg bindingsaffiniteten af ​​X10 til IGF-1-receptor (IGF-1R) og insulinreceptor (IR) 3- til 5-fold og 2-fold, henholdsvis [10], [11]. Endvidere har X10 faldet off-rate fra IR sammenlignet med nativ human insulin (HI), hvilket resulterer i vedvarende signalering fra IR [12]. For nylig blev det vist, at X10 resulterer i proportionalt øget aktivering af phosphoryleringssteder i juxta-membran og kinasedomæner af IR end det C-terminale domæne [13]. Disse receptorbinding og -activation egenskaber giver X10 en 3-15 gange højere mitogenisk potentiale end HI

in vitro

[14] og i en 12-måneders kronisk toksicitet undersøgelser overnationale farmakologiske doser af X10 øget forekomst af spontan brysttumorer i Sprague Dawley-rotter [15]. Videreudvikling af X10 til klinisk brug blev derfor afbrudt, men mekanismerne bag den øgede tumorincidens er aldrig blevet fuldt klarlagt (se [16] for en detaljeret gennemgang).

Tidligere dyreforsøg med genetisk eller kost-induceret modeller af fedme eller diabetes har korreleret hyperinsulinæmi med øget dannelse af kemisk inducerede præneoplastiske læsioner i tyktarmen [17], [18], vækst af kemisk inducerede kolon tumorer [19], [20] samt vækst af murine kræft celle allotransplantater [21 ] – [25]. I rotte modeller med kemisk induktion af kræft, behandling med insulin øget vækst af azyoxymethane-induceret kolon tumorer [26] og 7,12-dimethylbenz (a) anthracen-induceret brysttumorer [27]. Det har også vist sig, at konstant infusion af insulin til rotter i 12 timer øget proliferation af kolonepitelceller [28], og supra-farmakologisk doser af HI eller glargine i 18 uger forøgede proliferation af kolonepitelceller og dannelse af præneoplastiske læsioner, men resulterede ikke i tumordannelse [29]. I sikkerhedsundersøgelser, der traditionelt udføres som carcinogenicitetsstudier eller kroniske studier af 6-24 måneders varighed af mus eller rotter [30], blev der ikke øget tumorincidens observeret i Sprague Dawley rotter og NMRI-mus efter behandling med relativt lave doser af toksicitet glargin og HI i op til 24 måneder [31]. Men som nævnt ovenfor, behandling med høje doser af X10 i 12 måneder steg forekomsten af ​​brysttumorer i brysttumor-tilbøjelige Sprague Dawley-rotter [32]. Mens anbefalingerne for sikkerhedsundersøgelser af insulin og insulinanaloger er baseret på godt validerede videnskabelig praksis, der oprindeligt blev udviklet til studier af mutagener, de eksisterende data tyder på, at en tumor vækstfremmende effekt af insulin og insulinanaloger er en mere relevant bekymring, end bekymring for øget tumor initiering, via en øget mutation sats skyldes en øget spredning, som også foreslået tidligere [33]. Omkostningseffektiviteten af ​​screeningsprogrammer for forskellige former for kræft understreger, at det ikke er ualmindeligt for voksne, herunder diabetikere, at have uopdaget præmaligne tidlige kræft [34], [35]. Det er derfor relevant at undersøge, hvordan behandlingen med insulin og insulinanaloger påvirke adfærden hos eksisterende kræft, og for at gøre dette i dyremodeller af diabetes eller fedme kombineret med insulinresistens, da disse faktorer er kendte risikofaktorer for udvikling af kræft.

Formålet med undersøgelsen var at undersøge den mulige tumor vækstfremmende effekt af behandling med HI, X10 og IGF-1 i en muse tyktarmskræft allotransplantater model (MC38 celler) etableret i mus med kost-induceret fedme (DIO) og insulinresistens. Vi har derfor karakteriseret MC38 cellelinje anvendes til allotransplantat studier i vid udstrækning og udførte en række dyreforsøg for at opnå et pålideligt skøn over den mulige tumor vækstfremmende effekt af HI, X10 og IGF-1

in vivo

.

Materialer og metoder

dyreforsøg

for at undersøge effekten af ​​behandling med HI, X10 og IGF-1 på væksten af ​​MC38 tumor allotransplantater vi udførte fem identiske dyreforsøg. Vi fokuserede på forskellige effektmål i disse dyreforsøg og overvåges tumorvækst i alle eksperimenter, se blev udført Tabel 1. dyreforsøg som beskrevet for nylig [36]. Kort fortalt blev C57BL /6 mus købt fra Jackson Laboratories i en alder af 18 uger, hvor musene var blevet opretholdt på et højt fedtindhold kost (gnaver kost med 60 kcal% fedt, D12492, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, USA) da 6 ugers alderen. Til karakterisering af det metaboliske fænotype i DIO-mus (se tabel 2), blev metaboliske parametre også målt i alders-matchede lean mus fodret en diæt, (Rodent kost med 10 kcal% fedt, D12450B, Research Diets) inkluderet i tre af eksperimenterne. Animal pleje og behandlinger blev udført i overensstemmelse med fastlagte retningslinjer og protokoller godkendt af Lady Davis Institute (protokol # 5951) og McGill University Animal Ethics Committee. Mus blev huset en mus i hvert bur med ad libitum adgang til postevand og høj- eller fedtfattig kost henholdsvis hele undersøgelserne. Temperaturen i dyrerum blev holdt ved 20-25 ° C med en lys /mørke-cyklus på 14/10 timer. Mus blev akklimatiseret i 7-10 dage før eksperimentelle procedurer blev indledt. På forsøgsdag 0, 2,0 × 10

5 (eksperiment A) eller 5,0 x 10

5 (alle andre forsøg) MC38-celler, suspenderet i 100 pi phosphatpufret saltvand (PBS), blev injiceret subkutant (sc) i den højre flanke af musene. Efterfølgende blev hver mus injiceret se to gange dagligt med enten vehikel (aqueos opløsning indeholdende 7 mM phosphat, 150 mM glycerol, 22 mM NaCI og 30 mM phenol, pH 7,4), rekombinant human insulin 600 nmol /kg, insulin-analog X10 (insulinanalog B10Asp) (Novo Nordisk A /S, København, Danmark) 600 nmol /kg eller rekombinante humane IGF-1 (INCRELEX IPSEN Pharma GmbH, Ettlingen, Tyskland) 600 nmol /kg. Størrelsen af ​​tumor allotransplantater blev målt tre gange om ugen og volumen ved hjælp af følgende formel: længde × bredde

2 × 0,52. På grundlag af oplysningerne tumorvolumen for hver mus beregnede vi arealet under tumorvækstkurver (tumorvækst AUC). Ved afslutning af eksperimenterne blev mus bedøvet med isofluran. Blod blev opsamlet ved hjertepunktur og umiddelbart efter eutanasi ved cervikal dislokation blev prøver af leveren, tyktarmen, musculus gastrocnemius og MC38 celle tumor allografter dissekeret ud og lynfrosset i flydende nitrogen til senere fremstilling af væv lysat.

Blood glucose og HbA1C

for at overvåge den farmakodynamiske effekt af behandling med HI, X10 og IGF-1, blev blodsukker målt før behandling og 15 min, 1 time, 2,5 timer og 6 timer efter behandling. Blod blev opsamlet ved punktur af vena saphena og blodglucose målt under anvendelse af et OneTouch Ultra glucometer (LifeScan, Inc., Milpitas, CA, USA).

Niveauer af glykosyleret hæmoglobin (HbA1c) i blodet hos DIO- og magre kontrol mus blev målt ved hjælp af Tina-quant Hæmoglobin A1c Gen.3 analyse kit og en Cobas 6000 instrument (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland), i henhold til fabrikantens anvisninger.

Indsamling af plasma prøver og Målinger af C-peptid, human insulin, insulin X10 og human IGF-1

Før blev indledt forsøg blev de systemiske niveauer af muse insulin målt ved anvendelse af en rotte /mus insulin ELISA-kit (Millipore Corp., Bilerica, MA , USA), ifølge producentens instruktioner. Plasmaprøver indsamles ved afslutningen af ​​forsøg blev analyseret for muse C-peptid, human insulin, insulin-analog X10 eller human IGF-1. Muse C-peptid blev analyseret med Rotte /Mus C-peptid 2 ELISA-kit (Millipore) ifølge producentens instruktioner. Plasmakoncentrationen af ​​human IGF-1 blev målt med IDS-iSys IGF-1-ELISA-kit (IDS immundiagnostik, Fountain Hills, AZ, USA), ifølge producentens instruktioner. Plasmaprøver blev analyseret for nativ human insulin under anvendelse af en Luminescens Oxygen Kanalisering Immuno-assay (LOCI-assay), som tidligere [37] beskrevne. Insulin X10 blev målt i museplasma anvendelse af en wash-LOCI analyse som også beskrevet for nylig [38]. Se Materialer S1 for detaljerede oplysninger om disse analyser.

Cell Culture

MC38 celler (mus cellelinje beskrevet af Corbett et al. (1975) [39] og generøst leveres af Dr. Pnina Brodt , McGill University, Montreal, QC) og MCF-7-celler (ATCC, Manassas, VA, USA) blev dyrket i DMEM medium indeholdende 4,5 g /l glucose (Wisent Inc., Montreal, QC, Canada) suppleret med 10% ( v /v) føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen) og 20 ug /ml gentamicin (Sandoz Canada, Boucherville, QC, Canada) (dvs. vækstmedium). Celler, der anvendes i dyreforsøg blev trypsiniseret, vasket en gang i PBS og resuspenderet i PBS (4 ° C) ved en koncentration på 5,0 x 10

6 celler /ml og opbevares på is indtil sc injektion i musene. Til signalering eksperimenter MC38-celler blev dyrket i vækstmedium i to dage indtil 80-90% konfluente, blev cellekulturer derefter skyllet en gang i PBS (stuetemperatur), og sult medium (svarende til vækstmedium, undtagen det kun indeholdt 0,25% (v /v) FBS og ingen phenolrødt) blev tilsat i 3 timer. Efter sult celler blev behandlet med nativ human insulin, X10 eller IGF-1 ved endelige koncentrationer på 1 eller 10 nM i sult medium. Præcis 30 minutter efter behandling blev celler skyllet en gang i PBS (4 ° C) og lyseret ved tilsætning af lysepuffer, som beskrevet ovenfor. Hver signalering eksperiment bestod af to udtages pr behandling og tre uafhængige forsøg blev udført. MC38-celler, der anvendes til karakterisering af IR og IGF-1R ekspression blev dyrket, høstet og lyseret som beskrevet for signal- eksperimenter ovenfor, bortset fra at de ikke blev sultet inden lyse.

Cell Proliferation

Effect af testforbindelser på proliferation blev vurderet med 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) assays væsentlige som beskrevet tidligere [40]. Kort fortalt blev MC38-celler udpladet i plader med 96 brønde (5000 celler pr brønd) i vækstmedium. Efter inkubation i 1 dag blev cellerne skyllet i PBS (stuetemperatur), sultet i 3 timer og derefter behandlet med HI, X10 eller IGF-1 i koncentrationer i området fra 0,001 til 1000 nm. Data for relative celleantal fra de tre gentagne forsøg, hver med fire replikere prøver pr tilstand, blev derefter anvendt til at passe dosisresponskurver under anvendelse af GraphPad Prism version 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Celleproliferation eksperimenter blev udført med MCF-7-celler som beskrevet for MC38-celler, bortset fra at 20.000 celler blev udpladet pr brønd. Se Materialer S1 og figur S1 for detaljerede supplerende oplysninger om celleproliferation eksperimenter.

Udarbejdelse af væv og cellelysater og vestlige Blotting

Lyse af frosne vævsprøver og cellekulturer i petriskåle, centrifugering af lysater, assay af koncentration protein, blanding af celle- eller vævs-lysater med 2X SDS loadingpuffer, denaturering, SDS-PAGE på præfabrikerede 4-15% gradient-geler (BioRad) og overførsel til 0,45 um nitrocellulose membraner blev udført som tidligere beskrevet [ ,,,0],36] Før blotting med primære antistoffer nitrocellulose membraner blev blokeret ved inkubering i Tris-bufret saltvand med 0,05% (v /v) Tween (TBS-T) med 5% (vægt /vol) bovint serumalbumin (BSA) (når blotting med phosphoryleringsafhængige specifikke primære antistoffer) eller TBS-T med 5% (vægt /volumen) skummetmælk (alle andre primære antistoffer) i 1 time ved stuetemperatur. Primære antistoffer blev fortyndet i TBS-T med 5% (vægt /volumen) BSA og inkubation blev udført natten over ved 4 ° C. Følgende kaninantistoffer, alle fra Cell Signalling Technology Inc., Boston, MA, USA, blev anvendt:. Anti-phospho-p70S6K (.. Thr389, kat nr 9205), anti-P-S6 (Ser235 /236, kat . 2211), anti-phospho-Akt (Ser473, kat. nr. 9271), anti-Akt (kat. nr. 9272), anti-phospho-MAPK (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187, kat. nr. 4370) , anti-P-IRS-1 (Ser302, kat. nr. 2384), anti-IRβ (kat. nr. 3025), anti-IGF-1Rβ (kat. nr. 3018), anti-beta-actin (kat. nr. 4967). Inkubation med sekundært antistof (peberrodsperoxidase-konjugeret gede anti-kanin IgG (Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, kat. Nr 5401) og visualisering af proteinbånd blev udført som tidligere beskrevet [36]. Intensiteten af proteinbånd blev kvantificeret ved hjælp af softwaren ImagePro (BioRad). i hver celle signalering eksperiment, båndintensiteter blev normaliseret til gennemsnittet af de vehikelbehandlede prøver. IR og IGF-1R bånd i lever, muskel kolon og MC38 celle allotransplantater blev normaliseret at betyde båndintensiteter i lever og muskel prøver.

assay af liver triglyceridindhold i lysat fremstillet ud fra leverprøver fra DIO- og lean mus blev udført under anvendelse af et triglycerid kolorimetrisk assay kit (Cayman Chemical Company, Ann Arbor , MI, USA), ifølge producentens instruktioner.

Statistical Analysis

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SAS-software-version 9.1.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). I alle analyser observationer antages at være uafhængige mellem dyr eller cellekultur eksperimentelle enheder. Desuden blev data antages at følge en normalfordeling og have varianshomogenitet. For at opfylde disse forudsætninger blev data transformeret ved anvendelse af den naturlige logaritme når det er nødvendigt. Data med en numerisk standardiseret restværdi . 3.0 blev betragtet som outliers, som foreslået tidligere [41], og den statistiske analyse blev udført med og uden disse outliers (se nedenfor)

In vitro

signaling data blev analyseret under anvendelse af en envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af parvise sammenligninger mellem hver type behandling og kontrol ved hjælp af flere t-tests med Dunnetts korrektion. Endvidere er der ved hvert dosisniveau blev en direkte sammenligning af behandling med HI og X10 og HI med IGF-1 udført ved anvendelse af student t-tests. Data, der beskriver IR og IGF-1R-ekspression i forskellige musevæv blev analyseret i en én-vejs ANOVA efterfulgt af parvise sammenligninger mellem væv bruger multiple t-test med Bonferroni korrektion.

Virkningen af ​​behandlingen på tumorvækst i hver af de fem dyreforsøg blev analyseret i en envejs ANOVA efterfulgt af parvise sammenligning af hver behandling med vehikel ved hjælp af flere t-tests med Dunnetts korrektion for hver af de to tumor vækst endepunkter; tumor ende volumen og arealet under tumorvækstkurver (tumorvækst AUC). Resultaterne af denne analyse for hvert forsøg, dvs. middelværdier for hver behandling, 95% konfidensintervaller og fold ændring af hver behandling i forhold til køretøjet, er vist i tabel 3.

For at undersøge behandling -relaterede virkninger på tumorvækst på tværs af alle fem dyreforsøg, vi for hver effektparameter (tumor ende volumen og tumorvækst AUC) samlet alle data i én datasæt og analyseret dem i en blandet lineær model med behandling som en fast forklarende variabel og eksperimentere som en tilfældig effekt. Ingen signifikant interaktion mellem behandling og forsøg blev fundet for nogen af ​​de to udfald (tumor ende volumen og tumorvækst AUC). For yderligere at udforske forskellene mellem behandlingerne blev parvise sammenligninger af hver type behandling gøres ved hjælp af multiple t-test med Bonferonni korrektion. Ingen outliers blev observeret blandt de 131 observationer af tumor ende volumen, mens én outlier blev identificeret blandt de 131 observationer af AUC tumorvækst. Udelukkelse af denne outlier var nødvendigt for at opfylde forudsætningerne bag de statistiske modeller og ikke ændre det samlede resultat af analysen. Den gennemsnitlige tumor ende volumen og tumorvækst AUC for hver behandling på tværs af alle fem eksperimenter, herunder 95% konfidensintervaller og fold skift af hver behandling i forhold til den vehikel-behandlede gruppe er vist i tabel 3. Salg

Resultater

MC38 celler er lydhøre over for Insulin, X10 og IGF-1

Vi undersøgte først, hvordan behandlingen med HI, X10 og IGF-1 i 24 timer påvirket spredning af MC38 celler og MCF-7 celler (inkluderet til sammenligning), se figur 1. Behandling med testforbindelserne forøgede proliferation i begge cellelinier. Efter aftale med tidligere proliferationer studier i MCF-7 celler, og ≈ 9 gange højere udtryk for IGF-1R end IR i MCF-7 celler [42], den mitogene effekt var størst for IGF-1 X10 HI, mens der i M38 celler rækkefølgen for mitogen effekt var X10≥IGF-1 HI. Dette tyder på MC38 celler udtrykker sammenlignelige niveauer af IR og IGF-1R.

MCF-7 celler (A) og MC38 celler (B) blev udsat for HI /X10 /IGF i 24 timer i medium med lavt serum (MCF-7 0,1% (v /v), MC38, 0,25% (v /v)). Ved afslutningen af ​​behandlingsperioden relative celleantal blev vurderet med en MTT assay. Panel A og B viser middelværdien af ​​tre uafhængige forsøg med hver fire replikater pr betingelse, fejlsøjler indikerer SEM. HI, X10 og IGF-1 forøget proliferation i MCF-7 og MC38-celler. Efter aftale med tidligere publicerede data og receptor udtryk profil, rækkefølgen af ​​de testforbindelserne ifølge mitogen potens i MCF-7 celler blev IGF-1 X10 HI. I MC38 celler rækkefølgen var X10≥IGF-1 HI. Dette tyder på IR og IGF-1R udtrykkes på nogenlunde sammenlignelige niveauer i MC38 celler.

Desuden har vi undersøgt signalering akut efter behandling med HI, X10 og IGF-1. Som vist på figur 2A-2G, behandling med de valgte doser af HI, X10 og IGF-1 signifikant aktiveret IRS-1, Akt, mTOR, p70S6K og S6 i MC38 celler i phosphoinositid 3-kinase (PI3K) vej, mens signifikant aktivering af p44 /42 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) blev kun observeret ved den høje dosis af IGF-1 på dette tidspunkt. En tidligere undersøgelse med MCF-7-celler fundet, at P-Akt (Ser473) og P-p70S6K (Ser389) var følsomme endepunkter til detektering af en signalering forskel mellem HI og X10 [42]. Vi har derfor sammenlignes direkte ækvimolære doser af HI, X10 og IGF-1, ved at beregne X10 /HI og IGF-1 /HI-forhold for hver af de undersøgte kinase phosphoryleringssteder (Figur 2H). Efter aftale med den tidligere undersøgelse, behandling med X10 signifikant øget fosforylering af Akt (Ser473) og p70S6K (Ser389) ved den laveste dosis på 1 nM. De signaleringsdata var også i god overensstemmelse med spredning data, som IGF-1 og X10 optrådte ligeligt mere potent end HI i stimulering aktivering af Akt, p70S6K og IRS-1 i MC38-celler.

Repræsentative Western blots er vist på panel A. Celler blev høstet efter behandling i 30 ug totalt protein blev sat på gelerne. Hvert forsøg omfattede to replikater pr tilstand. Båndintensiteter blev kvantificeret i forhold til gennemsnittet af de to vehikelbehandlede prøver i hvert eksperiment. Tre uafhængige forsøg blev udført, og resultaterne fra kvantificering af båndintensiteter fra Western blottting for P-Akt (B), P-p44 /42 MAPK (C), P-p70S6K (D), P-S6 (E), P-IRS -1 (F) og P-mTOR (G) og β-actin (belastning kontrol) blev samlet og analyseret i en envejs ANOVA efterfulgt af sammenligning af vehikelbehandlede prøver med hver behandling ved anvendelse af flere t-test med Dunetts korrektion. Endelig en direkte sammenligning af kinase aktivering ved HI og X10 og HI og IGF-1, henholdsvis blev udført ved hvert dosisniveau anvendelse af Student t-tests (H). Åbne cirkler: en gentagelse prøve, vandrette stænger: middelværdier, fejl barer: SEM. * Og *** angiver

P

0,05 og

P

. 0,0001 henholdsvis

Mus med Diet Induced fedme er hyperinsulinæmisk, Glucose-intolerante og har reduceret insulinfølsomhed

Valgte metaboliske parametre blev målt i DIO-mus og sammenlignet med alders-matchede mus fodret med en kontrol fedtfattig kost. Som vist i tabel 2, DIO-mus havde ca. 40% øget kropsvægt og var hyperinsulinæmisk med ca. 4 gange forøget insulin niveauer. Men DIO-mus kun marginalt hyperglykæmiske, da HbA1C niveauer blev kun let øget. Kronisk eksponering for højt fedtindhold kost resulterede også i leversteatose og DIO-mus havde 3 til 4 gange øget triglycerid i leveren. På det funktionelle plan, DIO-mus viste også lavere glukosetolerance og havde nedsat insulinfølsomhed, som bestemt ved en glukose tolerance test som tidligere beskrevet [43].

Behandling med HI, X10 og IGF-1 Resultater i short Term men High Systemic Exposure, nedsat blodsukker og Undertrykt Sekretion af endogene Insulin

Når mus blev behandlet med ækvimolære overnationale farmakologiske doser af HI, X10 eller IGF-1 ved sc injektion, meget høje plasmakoncentrationer blev observeret kort efter injektion (figur 3A). C

max var ca. 1.000 nM for HI, X10 og IGF-1. Dette er ca. 1000 gange højere end plasmakoncentrationen af ​​endogene muse insulin i hyperinsulinæmisk DIO-mus (tabel 2). Baseret på plasmakoncentrationen målt 15 min, 1 time og 6 timer efter sc injektion af HI, X10 eller IGF-1 (figur 3A), kunne vi vurderer, at plasma halveringstid (t

½) til HI og X10 var ca. 30 min, hvorimod t

½ for IGF-1 blev omtrent 70 min, i rimelig overensstemmelse med eksisterende litteratur data og det faktum, at størstedelen af ​​IGF-1 i blodplasma er bundet til IGF-1 bindingsproteiner [ ,,,0],44], [45]

A:. Plasmakoncentrationen målt i mus behandlet med HI, X10 eller IGF-1. De lavere detektionsgrænser for de forskellige analyser var: HI; 02:00, X10; 233 pM, og IGF-1; 1.3 nM. Mus blev behandlet ved tid 0 og plasmaprøver blev opsamlet efter 15 minutter, 1 time og 6 timer. Maksimale plasmakoncentrationer blev målt 15 minutter efter behandling. 6 timer efter behandling plasmakoncentrationer af IGF-1 var ≈ 100 gange højere end plasmakoncentrationen af ​​HI og X10. B: Mean blodsukker efter behandling med 600 nmol /kg med HI /X10 /IGF-1 ved injektion sc. Blood glucose vendte tilbage til basale niveauer efter ≈ 3-4 timer, n = 8 (HI, X10 og IGF-1) eller n = 6 (vehikel). Stiplet linje angiver middel blodglucose på tidspunkt 0. Fejlsøjler; SEM. C: Plasmakoncentrationerne 0,5 time og 5 timer efter behandling med HI eller X10, 600 nmol /kg. Meget høje plasmakoncentrationer blev observeret 0,5 time efter behandling. Åbne cirkler; observationer fra de enkelte dyr, vandrette linjer; middelværdier, fejlsøjler; SEM. D: Niveauer af C-peptid i plasma 0,5 timer og 5 timer efter behandling med HI eller X10, 600 nmol /kg, i de samme dyr som vist på panel C. Niveauer af C-peptidet var signifikant reduceret 0,5 timer efter behandling sammenlignet med C-peptid-niveauer målt 5 timer efter sc injektion med HI /X10, når blodglucose var vendt tilbage til basale niveauer og plasmakoncentrationer af HI og X10 var lave. Åbne cirkler; observationer fra de enkelte dyr, vandrette linjer; middelværdier, fejlsøjler; SEM. * Angiver

P

. 0,05

Behandling med de valgte doser af HI, X10 og IGF-1 hurtigt sænkede blodsukkeret i mus på en sammenlignelig måde, men ca. 3 -4 timer efter injektion blodglucose var vendt tilbage til basale niveauer (figur 3B).

Som forventet niveauerne af C-peptid var lave kort efter behandling med HI /X10, hvor meget høj plasma eksponering blev observeret ( Figur 3C), men som plasmakoncentrationen af ​​HI /X10 faldet, niveauer af C-peptid hurtigt tilbage til basale niveauer 5 timer efter injektion (figur 3D). Dette mønster af C-peptid-niveauer også korreleret glimrende med ændringerne i blodglucose (figur 3B).

Behandling med HI, X10 og IGF-1 Aktiverer Signalering Nedstrøms IR /IGF-1R i MC38 Cell Allotransplantater

in vivo

Angivelse af IR og IGF-1R i MC38 celle allotransplantater blev målt i forhold til at henvise væv lever og skeletmuskulatur (gastrocnemius muskel) og normal tyktarm. Både IR og IGF-1R blev udtrykt i MC38 allotransplantater og sammenlignelige med MC38-celler dyrket

in vitro

, dvs. fænotypen blev opretholdt

in vivo

. I MC38 blev allotransplantater IR udtrykt ved lavere niveauer end i lever og tyktarm, men sammenlignes med skeletmuskulaturen. IGF-1R blev udtrykt på niveauer kan sammenlignes med tyktarmen og på betydeligt højere niveauer end lever og skeletmuskulatur (4A-4C). Med denne teknik var det ikke muligt direkte at sammenligne niveauet af IR og IGF-1R mellem væv

A:. Repræsentative Western blots for IRβ og IGF-1Rβ i lever, MC38 tumor, kolon, muskler og MC38 celler kulturperler

in vitro

. For hver prøve 20 ug totalt protein blev fyldt på gelen. B: Kvantificering af Western blots for IRβ blev gjort i forhold til de gennemsnitlige band intensiteter af leverprøver. Den relative IR niveau i MC38 celle allotransplantater var sammenlignelig med skeletmuskel og signifikant lavere end lever og colon. n = 3 eller 4 pr væv, streger indikerer gennemsnit af to eksperimenter, fejlsøjler; SEM. *** Angiver

P

0,0001. C: Kvantificering af Western blots for IGF-1Rβ blev gjort i forhold til de gennemsnitlige båndintensiteter af muskel prøver. Den relative IGF-1R niveau var signifikant højere i MC38 celle allotransplantater end muskel og lever og sammenlignelige til tyktarmen. n = 3 eller 4 pr væv, streger indikerer gennemsnit af to eksperimenter, fejlsøjler; SEM. *** Angiver

P

0,0001. D: Repræsentative Western blots for P-mTOR, P-p70S6K, P-Akt og β-actin i prøver af tumor allografter samlet 1 time efter sc injektion af HI, X10 eller IGF-1. Plasmakoncentrationer af HI, X10 og IGF-1 i disse dyr på tidspunktet for eutanasi og indsamling af vævsprøver er vist i figur 3A. Behandling med HI, X10 eller IGF-1 resulterede i aktivering af flere kinaser i PI3K-signalvejen.

Vi undersøgte også funktionaliteten af ​​IR og IGF-1 RS i tumoren allografter ved Western blotting for kinaser i PI3K signalvejen i tumorvæv opsamlet 1 time efter subkutan administration af HI, X10 eller IGF-1 (figur 4D). Dette tidspunkt er tæt på den maksimale plasmakoncentration og tidspunktet for maksimal virkning af de indgivne forbindelser på blodglucose. Vi har tidligere vist, at phosphorylering af Akt i tumor allotransplantater og normal colon efter sc injektion af en bolus af HI og X10 er stærkt tidsafhængig [36]. I overensstemmelse med disse data, observerede vi udtalt aktivering af Akt, p70S6K og mTOR 1 time efter behandlingen, som viser MC38 tumor allotransplantater er følsomme over for akut behandling med HI, X10 og IGF-1.

Vækst af Tumor Allotransplantater er steget betydeligt i dyr behandlet med X10 og IGF-1

blev udført fem dyreforsøg. Den gennemsnitlige størrelse af tumorer på forsøgsdag 14 og tumorvækst AUC (eksperimentel dag 0 til 14) for hver behandlingsgruppe i hvert eksperiment, herunder intervaller for disse middelværdier 95% sikkerhedsgrænser, er vist i tabel 3, og alle data er plottet på figur 5A-B. Bortset eksperiment A, blev en tendens til øget tumorvækst efter behandling med HI, X10 og IGF-1 observeret i alle forsøgene, og fold ændring i tumorvækst var generelt på ca. samme størrelsesorden for hver type behandling.