PLoS ONE: DNA Polymerase β som en roman Mål for Chemotherapeutic Intervention af kolorektal Cancer

Abstrakt

Chemoprevention er en stor strategi for medicinsk behandling af kolorektal cancer. De fleste lægemidler, der anvendes for tarmkræft terapi inducerer DNA-alkylering skader, som primært repareres ved basen excision reparation (BER) pathway. Således blokade af BER pathway er en attraktiv mulighed for at begrænse udbredelsen af ​​kolorektal cancer. Ved hjælp af en

i silico

tilgang, vi udførte en struktur-baseret skærm ved docking små-molekyler onto DNA-polymerase β (Pol-p) og identificeret en potent anti-Pol-β sammensatte, NSC-124.854. Vores mål var at undersøge, om NSC-124.854 kunne øge den terapeutiske virkning af DNA-alkylerende middel, Temozolomid (TMZ), ved at blokere BER. Først, vi bestemt specificiteten af ​​NSC-124.854 for Pol-β ved at undersøge

in vitro

aktiviteter APE1, Fen1, DNA-ligase I, og Pol-β-rettet enkelt nukleotid (SN) – og lang patch (LP) -BER. For det andet, undersøgte vi virkningen af ​​NSC-124.854 på effekten af ​​TMZ at inhibere væksten af ​​mismatch repair (MMR) deficiente og MMR-dygtige tyktarmskræft cellelinjer under anvendelse

in vitro Salg klonogene assays. For det tredje, vi undersøgt effekten af ​​NSC-124.854 om TMZ-induceret

in vivo

tumorvækst hæmning af MMR-mangel og MMR-dygtige colon xenografter implanteret i kvindelige homozygote SCID-mus. Vores data viser, at NSC-124.854 har høj specificitet til Pol-β og blokeret Pol-β-rettet sn og LP-BER aktiviteter i

in vitro

rekonstitueret system. Desuden NSC-124.854 effektivt inducerede følsomheden af ​​TMZ til MMR-mangel og MMR-dygtige kolon kræftceller både

in vitro

cellekultur og

in vivo

xenograftmodeller. Vores resultater tyder på en potentiel roman strategi for udvikling af meget specifik struktur-baseret inhibitor til forebyggelse af colon tumor progression

Henvisning:. Jaiswal AS, Banerjee S, Aneja R, Sarkar FH, Ostrov DA, Narayan S (2011) DNA Polymerase β som en roman Mål for Chemotherapeutic Intervention af kolorektal cancer. PLoS ONE 6 (2): e16691. doi: 10,1371 /journal.pone.0016691

Redaktør: Ben Ko, kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Oktober 4, 2010; Accepteret: 3 januar 2011; Publiceret: 2 Februar 2011

Copyright: © 2011 Jaiswal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA (R01 CA-097.031 og CA-100.247). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er den tredje mest almindelige kræftform og den anden mest almindelige årsag til kræftrelaterede dødsfald på verdensplan [1]. I år 2010 vil en anslået 102,900 nye kolorektal tilfælde diagnosticeres og 51,370 dødsfald vil forekomme i kun USA. Selv i de sidste to årtier en mærkbar fremgang er sket i de behandlingsmuligheder, er dødeligheden af ​​denne sygdom ikke meget bedre. Derfor er der behov nye behandlingsformer til at forbedre prognosen for denne sygdom. I mange år har det første valg af kemoterapeutisk medicin for tarmkræft været 5-fluorouracil (5-FU). Det er for det meste brugt som neoadjuverende behandling med stråling og i kombination med flere andre kemoterapeutiske lægemidler, såsom mitomycin, cisplatin, oxaliplatin, Camptosar, Eloxatin, Avastin, Erbitux, og Vectibix til behandling af kolorektal cancer, der bliver spredt [2]. Disse stoffer giver de bedste resultater ved højere doser, men forårsage alvorlige bivirkninger, herunder drab på raske celler af foring af munden, slimhinden i mave-tarmkanalen, hårsækkene, knoglemarven og forårsage leverskade og hypertension [3].

Mutationer i

adenomatøs polyposis coli (APC)

gen er en tidlig begivenhed i familiær adenomatøs polypose (FAP), et syndrom, hvor der er en arvelig prædisposition for tyktarmskræft [4], [5]. De fleste mutationer af

APC

gen forekommer i mutationen klynge region (MCR) og resultere i produktion af et trunkeret protein. Denne trunkering kompromiser flere funktioner APC, som er involveret i af Wnt-signalering smittevej, celle cyklus regulering, stabilisering af mikrotubulære cytoskelettet, celle-celle-interaktioner og DNA rep y kromosomal ustabilitet og unormal funktion [6] – [14]. Nylige undersøgelser tyder på, at den nukleare APC, gennem et område (aminosyrer 1441-2077), der er afkortet i de fleste kolorektale tumorer, samarbejder i rekrutteringen af ​​DNAPKcs til den beskadigede DNA kromatin og forbedrer tidlig reaktion på dobbelt-strenget pauser (DSB ) DNA-reparation [15]. APC interagerer også direkte med genomisk DNA, fortrinsvis med A /T rige sekvenser [16], hvilket indebærer en rolle for APC i DNA-replikation [17]. Det er blevet foreslået, at APC via sin C-terminale ende (aminosyrerne 2140-2421) interagerer med DNA og negativt regulerer cellecyklusprogression gennem hæmning af DNA-replikation ved direkte interaktion med DNA [17]. Vi har tidligere vist, at behandling med DNA-alkylerende midler forøger niveauet af APC i kolorektale cancerceller [14]. Derudover demonstrerede vi, at APC interagerer med DNA-polymerase β (Pol-β) og flap-endonuclease 1 (Fen1) og blokerer Pol-β-rettet single-nukleotid (SN) – og lang patch (LP) -base excision reparation (BER) aktiviteter er at påvirke cellulære respons på kemoterapi [14], [18]. Baseret på disse undersøgelser fremgår det, at interaktionen af ​​APC med Pol-β og andre BER proteiner kan være et passende mål for kemoterapeutisk indgriben af ​​colorektal kræft vækst.

Anvendelsen af ​​DNA-alkylerende midler som kemoterapeutiske lægemidler er baseret på deres evne til at udløse en celledød respons [19], og deres terapeutiske virkning bestemmes af balancen mellem DNA-skader og reparation. De DNA-alkylerings- skade-inducerede læsioner repareres af gruppefritagelsesforordningen, O

6-methylguanin DNA-methyltransferase (MGMT) og mismatch reparation (MFR) veje. Mange tyktarmstumorer blevet resistente over for DNA-alkylerende midler skyldes overekspression af MGMT eller MMR-mangel [20]. De celler, der mangler i MGMT er ude af stand til at behandle O

6meg under DNA-syntese, og hvis det ikke er repareret, en G: C til G: T overgang mutation opstår [21]. I tidligere undersøgelser, har den rolle, BER pathway også været impliceret i cellulær resistens over for TMZ [22], [23], som afhænger af specifik BER genekspression og aktivitet [24]. I de seneste år, de lægemidler mod cancer, der er udviklet primært målrette MGMT og MMR veje [25], [26]. Da MMR-deficiente kolorektale cancere udgør en større risiko for resistens over for DNA-alkylerende lægemidler på grund af overekspression af MGMT eller MMR-mangel [27] – [29], er det vigtigt at opdage et kemoterapeutisk strategi, der kan være nyttige til behandling af både MFR-mangelfulde og MMR-dygtige kolorektale tumorer. Interessant, selvom BER er ansvarlig for reparation af 70%, 5% og 9% af N

7-methylguanin (MEG), N

3-meg, og N

3-methyladenin (MEA) læsioner henholdsvis induceret af DNA-alkylerende stof Temozolomid (TMZ, NSC-362.856) [23], [30], [31], den potentielle nytte af BER pathway blokade er ikke blevet grundigt undersøgt. Således med kombinationen af ​​BER blokerende midler og TMZ behandling, det kliniske resultat af kemoterapeutisk effekt af TMZ kan forbedres. Tidligere undersøgelser støtter også, at DNA-alkylering-induceret skade er primært repareres af gruppefritagelsesforordningen vej [26], [27]. I fortiden, har BER vej blevet udnyttet som et mål for udviklingen af ​​nye lægemidler, men den kliniske konsekvenser af disse stoffer er stadig under efterforskning [31] – [36].

TMZ er blevet brugt til behandling af metastatisk melanom og glioblastoma multiforme, sidstnævnte i kombination med strålebehandling [37], [38], men har vist sig at være mindre effektive ved behandling af andre maligniteter. En klinisk fase II studie med TMZ i forud valgte avancerede aerodigestive tarmkanalen kræftformer, herunder kolorektal neoplasma, er for nylig blevet gennemført af Schering-Plough, Kenilworth, NJ, viser kun en delvis respons på behandlingen (https://clinicaltrials.gov/CT2 /show /NCT00423150). I et tidligere fase I klinisk studie med TMZ, et delvist svar af lægemidlet på metastatisk colorectal cancer blev også observeret, hvilket tyder på en betydelig tumor modstand mod behandling [39]. For at overvinde modstanden i TMZ, blev et klinisk fase II studie udført i hvilken lomeguatrib blev kombineret med TMZ, men resultaterne var ikke særlig stor [40]. Således er der et presserende behov for at udvikle en ny strategi, som effekten af ​​TMZ kan øges til behandling af tarmkræft.

Da de fleste kemoterapeutiske stoffer forårsager DNA-skader og modstand på grund af aktivering af DNA-reparationsvej (r), målretning proteiner af disse pathway (s) for at blokere deres aktivitet kan være en lovende strategi for udvikling af nye lægemidler med højere effekt til begge kemo-resistente og sensitive tumorer. I de senere år har strukturbaseret virtuel design og den tredimensionelle struktur af et lægemiddel-target interaktion med lille molekylvægt inhibitorer blevet anvendt til at styre rationale lægemiddelforskning [41]. Computerstøttet drug design kunne finde nye blyforbindelser og hjulpet i strukturen optimering for biologiske og farmakologiske forsøg [42] – [44]. I den foreliggende undersøgelse, udførte vi struktur-baseret molekylær docking af Pol-β på stedet, hvor adenomatøs polypose coli (APC) interagerer og blokke Pol-β-dirigeret BER [14], [45], [46]. Den molekylære docking struktur-baseret betragtes som et egnet fremgangsmåde til udvikling af nye lægemidler, eftersom den er målrettet til specifikke protein og specifik pathway [47]. Baseret på in silico indsats, har vi identificeret et højpotent lille molekylvægt inhibitor, NSC-124.854 {[5- (4-amino-6-iod-2-oxo-5,6-dihydropyrimidin-1-yl) -3- hydroxy-oxolan-2-yl] methoxyphosphonic syre}, som specifikt interagerer med Pol-β og blokerer Pol-β-rettet single-nukleotid (SN) – og lang patch (LP) -BER. Her præsenterer vi data, der beskriver, at NSC-124.854 kan øge effekten af ​​TMZ i MMR-mangelfulde og dygtige tyktarmskræft celler

in vitro

og

in vivo

modeller. Vi foreslår, at disse prækliniske resultater vil etablere et nyt paradigme for kliniske behandling af tyktarmskræft.

Resultater

Screening af små molekyler til at hæmme Pol-β-rettet streng-fortrængning aktivitet

For at identificere en potent anti-Pol-β sammensatte, vi brugte en

i silico

high-throughput struktur-baserede molekylære docking tilgang og screenet ca. 140.000 forbindelser med små molekyler (molekylvægt 500 dalton) for deres evne til at interagere med APC-bindingssted Pol-β (fig. 1

A

) [48]. De 22 højest scorende små molekylære forbindelser blev anmodet Developmental Therapeutics Program (DTP) af National Cancer Institute (NCI) til funktionel evaluering. Vi udførte den indledende screening af forbindelserne til bestemmelse af deres evne til at inhibere Pol-β-dirigeret streng-fortrængning syntese. Vi brugte en

in vitro

reconsitiuted analysesystem i disse undersøgelser. Vi screenede 22 top scoring forbindelser og data fra 12 forbindelser er vist her (fig 2

A

-.

C

). Blandt 22 små molekyler, NSC-21.371 og NSC-91.855 hæmmede Pol-β-rettet streng-fortrængning syntese ved 125 uM koncentration (figur 2

B

;. Sammenligne bane 3 med baner 9-13 og 19-23 , henholdsvis). Disse små molekylære forbindelser påvirkede ikke en-nt inkorporering aktivitet (24-mer produkt) af Pol-β på ethvert testede koncentration. Men NSC-124.854 hæmmede Pol-β-rettet streng-fortrængning aktivitet ved 5 uM koncentration, mens højere koncentrationer af NSC-124.854 fuldstændigt ophævede dannelsen af ​​streng-forskydning produkter (figur 2

A

;. Sammenligning af bane 3 med baner 4-8 henholdsvis). Når koncentrationen af ​​NSC-124.854 blev yderligere forøget til 50 uM eller mere, blev 1-nt inkorporering (24-mer produkt) aktivitet af Pol-β fuldstændigt blokeret som vist ved akkumulering af 23-mer indsnit produkt og mangel på 1 -NT iblanding produkt, hvilket afspejler et fuldstændigt tab af Pol-β-aktivitet (fig. 2

en

, sammenligne bane 3 med 4-8, henholdsvis). Disse resultater antyder, NSC-124.854 er en mest potent inhibitor af Pol-β aktivitet blandt alle de testede forbindelser.

Panel

A

viser den forudsagte interaktionen af ​​NSC-124.854 baseret på krystalstrukturen Pol-β. Pol-β er vist i guld og sidekæder forudsagt til at danne kontakter med NSC-124.854, Asp17 og Arg89, er afbildet med guld til kulstof, blå for kvælstof og rød for ilt. De APC bindende lomme-rester, Thr79, Lys81, Arg83 af Pol-β er vist som kugler farvede grå for kulstof, blå for kvælstof og rød for ilt. Polar kontakter er afbildet som gule stiplede linjer mellem NSC-124.854 og Pol-p rester Lys81 og Arg89. Figuren blev lavet med PyMOL. Panel

B

skildrer Pol-p-ligand interaktioner forudsagt baseret på stillet molekylær docking orientering af NSC-124.854. Medieret ved hydrogenbindinger (grøn) og ved hydrofobe (grå) kontakter er vist. NSC-124854 og Pol-β er vist i sort til kulstof, blå for kvælstof og rød for ilt. Inter-atomare obligationer i NSC-124.854 er vist i magenta. Inter-atomare obligationer i Pol-β er vist i guld. Hydrogenbindinger er angivet med stiplede linjer mellem de involverede atomer, mens hydrofobe kontakter er repræsenteret ved en bue med eger udstrålende mod NSC-124854 atomer, de kontakter. De kontaktede Pol-p atomer er vist med eger udstrålende tilbage. Figuren blev lavet med HBPLUS og LigPlot.

For at bestemme virkningen af ​​forbindelser på blokering af Pol-β-aktivitet, vi samles

in vitro

streng-fortrængning syntese assay med oprenset APE1 forskåret

32P-mærket 63-mer F-DNA og Pol-β. Panel

A

(NSC-124.854, NSC-143.995, NSC-160.172 og NSC-263.659),

B Hotel (NSC-10730, NSC-21.371, NSC-43.656 og NSC-91.855) og

C

(NSC-274.937, NSC-351.093, NSC-668.472 og NSC-674.711) viser virkningen af ​​små molekyler på Pol-β-dirigeret strengdeplacering syntese. I hvert panel, bane 1 viser 63-mer

32P-mærket F-DNA, bane 2 viser 23-mer produktet efter APE1 indsnit, bane 3 viser 1-nt inkorporering (24-mer) og streng-fortrængning produkter. Bane 4-8, 9-13, 14-18 og 19-23 viser streng-fortrængning aktivitet af Pol-β inkuberet med 0, 5, 10, 25, 50 og 125 pM, henholdsvis af de angivne forbindelser. Data er repræsentative for to eksperimenter.

Lille molekyle hæmmer, NSC-124.854, specifikt blokerer Pol-β aktivitet

Vi yderligere besluttet, om NSC-124.854 er en specifik hæmmer af Pol β aktivitet eller det kan også blokere aktiviteten af ​​andre BER enzymer. Vi først bestemmes IC

50 af NSC-124.854 for Pol-β-rettet streng-fortrængning syntese. Dette forsøg var den samme som beskrevet i screeningen eksperiment, medmindre vi valgte lavere koncentrationer til bestemmelse af IC

50 af NSC-124.854. Vi kvantificeret de strengdannende forskydning synteseprodukter (Fig. 3

A

, banerne 3-10, henholdsvis) og afbildet som en procent af ændring af NSC-124.854-medieret blokade af Pol-β-aktivitet (fig. 3

B

). Behandlingen med NSC-124.854 viste en dosisafhængig reduktion i streng-fortrængning syntese aktivitet med en IC

50 5,3 uM (fig. 3

B

). Disse resultater antyder, NSC-124.854 har en kraftig inhiberende virkning på Pol-β-dirigeret streng-fortrængning syntese.

For at bestemme affiniteten af ​​NSC-124.854 til blokering af Pol-β-dirigeret streng-fortrængning aktivitet vi fastlagt sin IC 2. Panel

a

viser

50 i et rekonstitueret analysesystem som i beskrevet i figur autoradiogrammet af streng-fortrængning aktivitet. Bane 1 viser

32P-mærket 63-mer F-DNA, bane 2 viser 23-mer produktet efter APE1 indsnit, og bane 3 viser streng-fortrængning aktivitet af Pol-β. Lanes 4-10 viser effekten af ​​0,5-20 uM NSC-124.854 om Pol-β-aktivitet. Panel

B

viser IC

50 data. NSC-124.854 inhiberede Pol-β-dirigeret streng-fortrængning aktivitet på en dosisafhængig måde med en IC

50 på 5,3 uM. Dataene er repræsentative for to uafhængige skøn.

Dernæst vi stilling til, om NSC-124.854 kan hæmme aktiviteten af ​​andre BER pathway enzymer såsom apurin- /apymidinic endonuclease 1 (APE1), Fen1 og DNA-ligase I. Resultaterne viste, at NSC-124.854 ikke inihibit aktiviteter af disse enzymer (figur 4

A

-.

C

henholdsvis). Ud fra disse resultater konkluderede vi, at den inhibitoriske virkning af NSC-124.854 var yderst specifik for Pol-β og påvirkede ikke aktiviteten af ​​andre BER enzymer.

Panel

A

viser virkningen af NSC-124.854 på APE1 aktivitet. APE1 (10 nM) blev inkuberet med forskellige koncentrationer af NSC-124.854 (0,5-20 uM, banerne 3-9, henholdsvis) og

32P-mærket 63-mer F-DNA. Bane 1 og 2 viser uncut

32P-mærket 63-mer F-DNA og 23-mer indsnit produkt hhv. Panel

B

viser effekten af ​​NSC-124.854 på Fen1 aktivitet. Fen1 (10 nM) blev inkuberet med forskellige koncentrationer af NSC-124.854 (0,5-20 uM, banerne 3-9, henholdsvis) og

32P-mærket 51-mer flagrede-DNA. Bane 1 viser positionen af ​​51-mer mærket oligonukleotid og bane 2 viser 11-mer spaltet flap produkt. Panel

C

viser effekten af ​​NSC-124.854 om DNA-ligase I-aktivitet. DNA-ligase I (5 nM) blev inkuberet med forskellige koncentrationer af NSC-124.854 (0,5-20 uM, banerne 3-9, henholdsvis) efterfulgt af tilsætning af 2,5 nM

32P-mærket 63-mer nicked DNA. Bane 1 viser 23-mer mærket oligonukleotid (nicked produkt) og bane 2 viser 63-mer ligeret produkt. Data er repræsentative for to uafhængige forsøg

Lille molekyle hæmmer NSC-124854 blokerer single-nukleotid (SN) -. Og lang patch (LP) -BER aktiviteter i et rekonstitueret

in vitro

assay

Baseret på molekylær docking analyse, NSC-124.854 forudsiges at danne polære (H-bindinger) interaktioner med aminosyreresterne Lys81 og Arg89 og en ikke-polær (van der Waals) interaktion med aminosyrerest Asp17 på overfladen af ​​Pol-β [48], [49]. Disse rester er i nærheden af ​​APC bindende lomme (aminosyreresterne Thr79, Lys81 og Arg83) (fig. 1

B

). Disse forudsagte kontakter antyder en flere direkte kontakter mellem NSC-124.854 og Pol-β, som muligvis kan efterligne interaktionen af ​​APC med Pol-β. Da disse data tyder på, at NSC-124.854 i kombination med TMZ som en mulig kemoterapeutisk strategi behandling for tarmkræft, vi foretog en undersøgelse for at fastlægge effekten og begrænsninger i denne strategi.

Selvom vi bestemt specificitet NSC- 124.854 til Pol-β-aktivitet, som vist i fig. 3 og 4, var det nødvendigt at undersøge effekten af ​​denne forbindelse, når den komplette BER system sn og LP-BER er samlet. Disse eksperimenter vil give biokemisk evidens for styrken af ​​NSC-124.854. Vi brugte 63-mer

32P-mærket U-DNA som substrat (fig. 5

A

) for SN-BER. Da Fen1 er nødvendig for LP-BER aktivitet og kan stimulere Pol-β aktivitet for streng-fortrængning syntese [50], [51], vedtog vi samme strategi til bestemmelse af effekten af ​​NSC-124.854 på LP-BER (fig. 5

B

). Efter APE1 indsnit, var en forventet 23-mer produkt genereret (Fig 5

C

;. Sammenligne bane 1 med 2). Resultaterne viste effektiv 1-nt inkorporering (24-mer produkt) ved Pol-β, som blev ligeret med DNA-ligase I til at generere 63-mer repareret produkt (fig. 5

C

, bane 5). Tilsætningen af ​​Fen1 stimuleret Pol-β aktivitet for streng-fortrængning syntese (fig. 5

C

, bane 4), som også blev ligeret med DNA-ligase I til at generere 63-mer repareret produkt (fig. 5

C

, bane 6). Tilsætningen af ​​NSC-124.854 blokeret Pol-β-dirigeret 1-nt tilsætning (24-mer produkt i fravær af Fen1) (fig. 5

C

, sammenlign bane 3 med 7) samt Strandvejen forskydning syntese i nærvær af Fen1 på en dosis-afhængig måde (fig. 5

C

, sammenlign bane 4 med bane 8-11, henholdsvis). Endvidere er den fuldstændige reparation ved sn og LP-BER sub-veje efter tilsætning af DNA-ligase I blev også blokeret af NSC-124.854 i en dosisafhængig måde (fig. 5

C

, sammenligning af bane 12 -15 og 16-19, henholdsvis).

Paneler

A og B

repræsenterer protokollerne i sn og LP-BER hhv. Panel

C

viser autoradiogrammet beskriver virkningen af ​​varierende koncentrationer af NSC-124.854 på sn og LP-BER aktiviteter. Bane 1 viser 63-mer

32P-mærket U-DNA, bane 2 viser 23-mer produktet efter APE1 indsnit, Lane 3 viser 1-nt inkorporering af Pol-β, Bane 4 viser strengdannende forskydning produkter efter tilsætning af Fen1. Bane 5 og 6 viser 63-mer ligeret produkt af sn og LP-BER aktiviteter hhv. Bane 8-19 viser virkningen af ​​NSC-124.854 om blokering af 1-nt (24-mer produkt) inkorporering. Lanes 8-11 skildrer NSC-124.854-medieret blok af streng-forskydning syntese. Endvidere bane 12-15 og banerne 16-19 viser virkningen af ​​NSC-124.854 om blokering af sn og LP-BER aktiviteter på en dosisafhængig måde. Dataene er en repræsentant for tre forskellige eksperimenter.

Angivelse af vildtype APC forårsager resistens over for TMZ behandling, som er afskaffet ved behandling med NSC-124854

I tidligere undersøgelser, vi har vist, at APC interagerer med Pol-β og Fen1 og blokerer sn og LP-BER aktiviteter [14], [45], [46], [52] – [54]. Vi har også vist, at HCT-116-celler (udtrykker vildtype APC) er mere følsomme over methylmethane sulfonat (MMS) og TMZ behandlinger end HCT-116-APC (KD) celler (bankes ned APC med pSiRNA) [36], [45], [46]. I den foreliggende undersøgelse, vi bestemt følsomhed TMZ i overværelse af NSC-124.854 til flere tyktarmskræft cellelinier (HCT-116, HCT-116-APC (KD), HCT-116 + CH3, Caco-2, HT29, SW480, LoVo og RKO) under anvendelse af et klonogent assay [18], [36], [46]. IC

50 resultater viste, at alle de testede cellelinjer udviste højere sensitivitet til kombinationsbehandling af NSC-124.854 med TMZ (tabel 1). IC

50 data viste, at NSC-124.854 var i stand til at øge væksten hæmmende effekt af TMZ til både HCT-116 og HCT-116-APC (KD) cellelinier; Men virkningen var større i HCT-116 end i HCT-116-APC (KD) celler (tabel 1). Disse resultater bekræfter vores tidligere resultater, som vildtype-APC ved at inhibere BER pathway forøger følsomheden af ​​DNA-alkylaying lægemidler [36], [46], [54]. Men andre cellelinjer, som udtrykker enten vild-type eller afkortede APC, såsom RKO (310 kDa), SW480 (147 kDa), Caco-2 (150 kDa), LoVo (120 kDa) og HT29 (110 og 200 kDa) viste ikke en direkte korrelation af den rolle APC i følsomheden af ​​disse lægemidler. Disse resultater tyder på, at andre end mutationer i genetiske faktorer

APC

gen kan også spille en rolle i fastsættelsen af ​​følsomheden af ​​NSC-124.854 og TMZ til forskellige kolon kræftceller. En af de kritiske parametre for denne differentiel følsomhed styres af den differentierede status MMR-aktivitet, som er beskrevet nedenfor.

kombinationsbehandling af NSC-124.854 forøger vækstinhiberende virkning af TMZ på MMR-defekte og MMR-dygtige kolon kræftceller

MMR proteiner er involveret i den kemoterapeutiske respons tyktarmskræft celler og defekt i MMR protein (er) er til stede i HNPCC (HNPCC) [55]. To af de MMR-proteiner er mest almindeligt muteret i humane cancere, MLH1 og MSH2. MMR-deficiente celler er ofte resistente over for DNA-alkylerende midler [55]. For at fastlægge den rolle, MMR i kombinationen effekt af NSC-124.854 med TMZ på væksthæmning, vi brugte flere MMR-dygtige og MMR-mangelfulde tyktarmskræft cellelinjer. HCT-116, HCT-116-APC (KD), og RKO cellelinier er mangelfuld i MMR grund af mangel på ekspression af hMLH1, et nøgleenzym i denne pathway [56], mens LoVo celler er MMR-defekte på grund af fravær af MSH2 udtryk [57]. Den HCT-116 + CH3 celle er blevet gjort MMR-dygtige ved at indføre en enkelt kopi af kromosom 3 huser

hMLH1

gen [58]. TMZ vides at forårsage resistens over for MMR-defekte celler [26]. I tidligere undersøgelser er det blevet foreslået, at afbrydelsen af ​​BER pathway kan ophæve lægemiddelresistens forårsaget af MMR-mangel [59]. I den foreliggende undersøgelse, vi afgøres, om behandling af TMZ sensibiliserer MMR-dygtige celler forholdsvis mere end de MMR-defekte celler, og om blokaden af ​​BER vej af NSC-124.854 kan afskaffe TMZ modstand mod MFR-defekte celler. Som ventet MMR-dygtige cellelinier SW480 (IC

50 108,1 ± 3,2 pM), HCT-116 + CH3 (IC

50 130,7 ± 4,3 pM) og Caco-2 (IC

50 449,2 ± 42,4 uM), med undtagelse af HT29 (IC

50 962,7 ± 62,7 uM) viste en højere følsomhed over for TMZ i forhold til MMR-mangel cellelinjer HCT-116 (IC

50 739,0 ± 25,9 uM), HCT-116- APC (KD), (IC

50 877,7 ± 49,2 pM), LoVo (IC

50 838,8 ± 53,1 uM) og RKO (IC

50 1572,6 ± 89,9 pM) (tabel 1). Endvidere kombinationsbehandlingen af ​​NSC-124.854 yderligere reduceret IC

50 af TMZ med to-fold i alle de syv cellelinjer uanset status af MMR-aktivitet (tabel 1). Disse resultater tyder på, at kombinationsbehandling af NSC-124.854 med TMZ kunne være en nyttig kemoterapeutisk strategi for forvaltningen af ​​både MMR-mangel og MMR-dygtige kolorektale tumorer.

Kombination af NSC-124.854 med TMZ kan bruges som en potentiel kemoterapeutisk tilgang til at forøge colon tumorvækst

in vivo

for yderligere at verificere

in vitro

resultater af effekten af ​​kombinationsbehandling af NSC-124.854 og TMZ med et godt karakteriseret og specifikke mål for Pol-β til at reducere doserne for TMZ, der kan fjerne bivirkninger og samtidig afskaffe MFR-modstand, vi udførte en

in vivo

xenograft undersøgelse med svær kombineret immundefekt ( SCID, mangler funktionelle T- og B-celler) mus, som beskrevet i figur 6

A

. Vores valg til hunmus var baseret på nylig undersøgelse, der beskriver, at de anslåede nye tilfælde af tyktarmskræft i 2009 var forudsagt til at være højere hos kvinder end hos mænd [60]. Vi valgte en dosis på 20 mg /kg legemsvægt af TMZ til disse eksperimenter, som er 10- og 4-gange lavere end den maksimalt tolererede dosis hos mus og menneske, henholdsvis [61] – [65]. Også den dosis på 10 mg /kg legemsvægt for NSC-124.854 er mere end 20 gange lavere end IC

50 i kultur (tabel 1). Selvom vi ikke har bestemt den maksimalt tolererede dosis (MTD) af NSC-124.854 i mus, den valgte koncentration er meget i sikrere område.

Panel

A

viser den skematiske repræsentation af forsøgsprotokol. Panel

B

viser ændringen i tumor volumen på 42

nd dag af forsøget. Viste data er middelværdien ± SD af fire til seks dyr i hver gruppe. *, Væsentligt anderledes end kontrol;

†, væsentligt anderledes end NSC-124.854. P. 0,05

Disse stoffer blev givet intraperitonealt (.

i.p

) i fem på hinanden følgende dage. Den vækstinhibering af tumorer blev monitoreret op til 42 dage. Resultaterne viste en stigning i tumorvolumen i kontrolgruppen i en tidsafhængig måde for alle de cellelinjer,

dvs.

, HCT-116, HCT-116-APC (KD) og HCT-116 + CH3. Tumoren volumen nåede et maksimum på 1.120 mm

3 inden for 42 dage efter xenograft implantation, som er vist i figur 6

B

. Den tumorvækst i den ubehandlede HCT-116 xenograft var højere end HCT-116-APC (KD) og HCT-116 + CH3 celler. Den anti-tumor effekt af TMZ alene var signifikant forskellig i HCT-116 + CH3-celler (MMR-dygtige) og var mindre udtalt i HCT-116 og HCT-116-APC (Kd) -celler (fig. 6

B

). Behandling med NSC-124.854 alene faldt også væksten af ​​tumorer med alle de cellelinjer, som var mere udtalt, når det blev kombineret med TMZ (fig. 6

B

). Disse resultater tyder på, at kombinationsbehandling af NSC-124.854 øger den terapeutiske effekt af TMZ lige godt i både MMR-mangel og MMR-dygtige xenograft tumor model

in vivo

. For at bestemme tolerancen af ​​lægemidlerne, indspillede vi legemsvægten af ​​dyrene to gange om ugen indtil forsøgets afslutning. Resultaterne viste en lignende gevinst i kropsvægten af ​​kontrol og behandlede grupper af dyr med NSC-124.854 og TMZ alene eller i kombination (data ikke vist). Således ser det ud til, at doser på 10 mg /kg legemsvægt for NSC-124.854 og 20 mg /kg legemsvægt for TMZ var veltolereret og forårsagede ikke nogen tydelige bivirkninger i vores forsøgsdyr.

diskussion

i tidligere undersøgelser har Pol-β blevet brugt som et mål for kemoterapeutisk lægemiddel udvikling [23], [34], men nåede ikke ud over den prækliniske niveau. Effektiviteten af ​​de tidligere forbindelser har været mindre effektive, fordi de kræver meget høje koncentrationer for at opnå den ønskede cytotoksicitet

in vitro

og de blev ikke testet systematisk

in vivo

. Desuden blev de primært målrettet til at blokere SN-BER. Anvendelsen af ​​TMZ til behandling af andre end glioblastom og melanom maligniteter har været begrænset, især til behandling af kolorektale tumorer, grundet mindre udtalt virkning på suppression af tumorvækst [39], [40]. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi struktur-baseret molekylær tilgang til at identificere små molekyler, som kan efterligne interaktionen af ​​APC med Pol-β og blokere Pol-β-dirigeret BER der kan udnyttes som et kemoterapeutisk mål. Vores strategi for molekylær docking i APC-bindende lomme af Pol-β var at identificere et lille molekyle, der kan blokere både sn og LP-BER aktiviteter og demonstrere cytotoksicitet i både

in vitro

i vivo

analyser ved lavere koncentrationer

Især hvis det lykkes, den foreslåede strategi vil være yderst effektive i forebyggelsen af ​​både MMR-dygtige og MMR-mangelfulde kolorektal kræft.; dette er af betydning, fordi de MMR-mangelfulde kolorektal kræft udgør en større risiko for resistens over for DNA-alkylerende lægemidler som følge af overekspression af MGMT eller MMR-mangel [27] – [29]. De celler, der mangler i MGMT er ude af stand til at behandle O

6meg under DNA-syntese, og hvis udbedrede, en G: C til G: T overgang mutation opstår [27]. G: T misforhold derefter repareres af MMR-vejen [28]. Men hvis O

6meg ikke repareres, før re-syntese trin i MMR, thymin er sandsynligvis vil blive re-sat modsat læsionen. Det menes, at den gentagne cyklus af forgæves MMR resultater i en generation af tertiære læsioner, sandsynligvis gapped DNA.