PLoS ONE: 14-3-3 σ Expression Effekter G2 /M Reaktion på Oxygen og korrelerer med kræft i æggestokkene Metastasis

Abstrakt

Baggrund

In vitro

cellekultur forsøg med primære celler har rapporteret, at celleproliferation hæmmes i nærvær af omgivende forhold til fysiologiske O

2 niveauer. Cancer er primært en sygdom af afvigende celleproliferation derfor studere kræftceller dyrket under omgivelsernes O

2 kan være uønsket. For at forstå bedre virkningen af ​​O

2 på udbredelsen af ​​kræftceller

in vitro

sammenlignede vi vækstpotentialet i et panel af æggestokkene kræft cellelinjer under omgivelsernes (21%) eller fysiologisk (3% ) O

2.

vigtigste resultater

Vores observationer viser, at ligner primære celler, mange cancerceller opretholde en iboende følsomhed over for O

2, men nogle display ufølsomhed over for ændringer i O

2-koncentration. Yderligere analyse viste en sammenhæng mellem defekt G2 /M cellecyklus overgang regulering og O

2 ufølsomhed resulterende fra overekspression af 14-3-3 σ. Målretning 14-3-3 σ overekspression med RNAi restaurerede O

2 følsomhed i disse cellelinjer. Derudover fandt vi, at metastatiske tumorer i æggestokkene ofte overekspression 14-3-3 σ, som i samarbejde med phosphoryleret RB, resulterer i dårlig prognose.

Konklusioner

Kræftceller viser forskellen proliferativ følsomhed over for ændringer i O

2-koncentration. Selvom en direkte forbindelse mellem O

2 ufølsomhed og metastase ikke blev bestemt, viste denne undersøgelse, at en O

2 ufølsom fænotype i kræftceller til at korrelere med metastatisk tumor progression

Henvisning:. Ravi D, Chen Y, Karia B, Brown A, Gu TT, Li J, et al. (2011) 14-3-3 σ Expression Effekter G2 /M Reaktion på Oxygen og korrelerer med kræft i æggestokkene Metastase. PLoS ONE 6 (1): e15864. doi: 10,1371 /journal.pone.0015864

Redaktør: Janine Santos, University of Medicine og Dentistry of New Jersey, USA

Modtaget: 26 august, 2010; Accepteret: November 25, 2010; Udgivet: 10. januar, 2011

Copyright: © 2011 Ravi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIEHS (K22-ES12264) og en Voelcker fond Young Investigator Award fra Max og Minnie Tomerlin Voelcker Fund til AJR Biskop. Kleberg Center for molekylære markører på MD Anderson Cancer Center, MD Anderson Cancer Center Læge Scientist Program, den McNair Scholars Program støttet af Robert og Janice McNair Foundation og en American Society of Clinical Oncology (ASCO) kræft fundament Career Development Award (CDA ), Cancer Foundation og en Science Foundation Ireland (SFI) /Health Research Board (HRB (Irland)) Translational Research Award (TRA), alle til BT Hennessy. B. Karia understøttes af DOD CDRMP Breast Cancer Research Program Predoctoral Praktikophold Award (BC093931). A. Brown er støttet af NIA T32 uddannelse tilskud (T32AG021890). Y. Chen er støttet af NIH /NCI cancer center tilskud (P30 CA054174-17) og NIH /NCRR CTSA tilskud (1UL1RR025767). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cellelinjer afledt af kræftpatienter giver en eksperimentelt manipulerbare model system, der letter undersøgelser kræft biologi og dens behandling. Den ubegrænsede spredning potentiale af cancerceller er en væsentlig kendetegn for malignitet, men brugen af ​​standard vævskultur protokoller ofte begrænser celleproliferation, som observeret med primære cellelinier [1], [2], [3], [4]. Selv om anvendelsen af ​​fysiologiske tilstande vides at påvirke

in vitro

proliferation af cancerceller [5], [6], [7] og primære celler er kendt for at udbrede bedre ved fysiologisk O

2, den virkningen af ​​fysiologisk O

2 på

in vitro

kræft celledeling er relativt uudforsket. Imidlertid er det blevet rapporteret, at ændrede koncentrationer af O

2 resultater i klare forskelle i celledeling og respons på lægemiddelbehandling i kræftcellerne [8], [9], [10].

Oxygen , udover næringsstoffer og vækstfaktorer, er af afgørende betydning for korrekt cellevækst og dens tilgængelighed har en direkte indvirkning på cellulær metabolisme, signalveje, proliferation, differentiering og overlevelse [3], [11], [12], [13]. Mange

in vitro

undersøgelser har vist fordelene ved fysiologisk O

2 for vævskultur. For eksempel er den biologiske opførsel af primære cellekulturer med en fysiologisk koncentration af O

2 (2,7-5,3%) er langt overlegen i forhold til den normale praksis voksende celler under atmosfærisk eller “ambient” O

2-koncentration ( 21% O

2) [4]. Faktisk er disse to vækstbetingelser kendt for at resultere i særskilte metaboliske og molekylære karakteristika [13].

Betydningen af ​​at overveje O

2 spændinger i kræft biologi er veletableret. For eksempel har den omstændighed, at der findes mange cancere i en ‘hypoxisk’ tilstand ført til udviklingen af ​​hypoxi-målrettet terapi [14], [15]. Generelt er den hypoxiske koncentration af O

2 er 1% for de fleste faste tumorer, men den hypoxiske fusion kan variere baseret på celletyperne og den normale perfusion status [16] og derudover, hypoxi tendens til at inhibere celleproliferation [ ,,,0],17]. Fysiologisk O

2 spændinger varierer fra 2,7 til 5,3% i det interstitielle rum [18], hvor mange primære tumorer bor, til 14,7% i det arterielle cirkulation og lunger, hvor migrere og potentielt metastatiske cancerceller findes ofte. Derfor cancer undersøgelser, der kun gennemført i omgivelserne (21%) O

2 kan gå glip relevante biologiske observationer. Dette kan være særlig vigtigt, når de forsøger at studere udviklingen af ​​kræft til metastatisk sygdom, som er en væsentlig begivenhed i cancer ætiologi og er forbundet med dårlig prognose [19]. I betragtning af de forskelle i O

2 spændinger i forskellige rum i kroppen, en forståelse af effekten af ​​O

2 koncentration om kræft celledeling kunne give nyttig indsigt i de involveret i patologiske progression af kræft mekanismer.

Kræftceller, der har erhvervet mutationer i enten onkogener eller tumorsuppressorgener vise en karakteristisk ukontrolleret spredning fænotype [20]. For eksempel, tumorsuppressorer såsom p53 eller RB handling som “molekylære dørvogtere” kendt for at påvirke cellecyklusprogression. Mutation af sådanne faktorer letter ubegrænset proliferation i cancerceller [20]. Cellecyklusprogression indebærer en række af begivenheder katalyseret af cycliner og cyclinafhængige kinaser (CDK’er) [21], og i normale celler er en tæt reguleret proces. Den tumorsuppressor p53 er en mester regulator af G1 /S og G2 /M faseovergang i cellecyklus [22], og er kendt for at have en vigtig rolle i at reagere på ilt koncentration, især hypoxi ( 1% O

2) [23] eller hyperoxi (95% O

2) [24]. Selvom undersøge effekten af ​​ekstreme O

2 betingelser er både vigtig og afslørende, skal det bemærkes, at disse tidligere undersøgelser ikke undersøge respons af p53 ved fysiologisk (3%) O

2 og ambient (21%) O

2. p21 og 14-3-3 σ er transkriptionelle mål af p53, som er involveret i regulering G1 /S og G2 /M-overgange af cellecyklus ved at målrette CDK2 og CDC2 (også kendt som CDK1), henholdsvis [22], [25] . The CDK’er til gengæld regulere RB proteinfunktion, at mediere cellecyklusprogression via G1 /S og G2 /M [26]. Derfor kunne afbrydelse af RB-funktion også påvirke kontrollen af ​​cellecyklusprogression [26]. I betragtning af, at forskelle i O

2-koncentration resultat i ændret cellecyklusprogression i primære celler, men kræftceller ofte vise cellecykluskontrol fejl, der er helt klart potentiale, at disse fejl kan påvirke, hvordan kræftceller reagerer på ændrede O

2 niveauer på en måde, der kunne have en stor indflydelse på kræft progression.

Her undersøgte vi biologiske opførsel af kræft i æggestokkene celler under fysiologiske og omgivende O

2. Interessant nok nogle af de ovarian cancer cellelinjer havde en normal reaktion på O

2-koncentration, (

dvs.

reduceret celleproliferation med forøget O

2-koncentration), mens spredning af andre ovariecancer cellelinier var upåvirket af denne O

2 stigning. Endvidere afslørede vore undersøgelser, at 14-3-3 σ og dens rolle i cellecyklussen påvirke det proliferative respons på ændret O

2 niveauer. I betragtning af variationen i partialtrykket af oxygen i hele kroppen, og den potentielle betydning, at denne sammenhæng kan have på kræft progression, er det afgørende at forstå effekten af ​​O

2 koncentration om kræft celledeling og kræft progression. Vi leverer dokumentation for, at købet af O

2 ufølsomhed kan være en komponent i kræft progression og et kendetegn for vellykket metastatisk sygdom.

Resultater

Fysiologiske ilt resulterer i øget celledeling i æggestokkræft celler

i vores indledende undersøgelser sammenlignede vi effekten af ​​fysiologiske (3% O

2) og ambient (21% O

2) iltkoncentrationen hjælp A2780 ovariecancerceller og bemærkede, at 12 dages cellekultur under disse betingelser resulterede i en 2,6 fold vækstsuppression under 21% O

2 (figur 1). Derfor undersøgte vi effekten af ​​O

2 koncentration på vækstpotentialet i seks æggestokkene kræft cellelinjer hjælp fysiologiske (3% O

2) og ambient (21% O

2) iltkoncentrationer. Da serum til stede i cellekultur medium også kan have en indflydelse på vækst, vi også testet effekten af ​​forskellige koncentrationer af serum. Uanset mængden af ​​serum til stede i vækstmediet, dyrkning i 21% O

2 generelt resulteret i et betydeligt fald i celledeling for fire af de æggestokkene kræft cellelinier (A2780, OVCAR5, OVCAR8 og HOC8) sammenlignet med 3 % O

2 (figur 2). Den eneste undtagelse observerede var med HOC8 celler i nærvær af den højeste koncentration af serum (10% v /v), hvor der blev observeret en ubetydelig O vækst effekt

2-afhængig (figur 2). Formentlig den manglende respons i Hoc8 skyldes en dominerende indflydelse af serum, som ikke blev observeret med A2780, OVCAR5 og OVCAR8. I modsætning hertil var der ingen signifikant effekt på væksten af ​​SKOV3 og HeyA8 cellelinier ved at øge O

2-koncentration til 21%, uanset serumkoncentrationer (figur 2). Den observerede undtagelse var HeyA8 dyrket under 2% serum, som viste nedsat celleproliferation ved 21% O

2 sammenlignet med 3% O

2 (

s

0,001). I modsætning til effekten af ​​O

2 niveauer, øge koncentrationen af ​​serum resulterede i en proportional vækst stigning i kræft i æggestokkene cellelinjer A2780, OVCAR5 og OVCAR8 (

s

10

– 5, figur 2). Koncentrationen af ​​serum havde en moderat indflydelse på væksten i SKOV3 og HeyA8 (figur 2); en serumkoncentration mellem 2 og 6% havde en signifikant effekt (

s

10

-5) i SKOV3, mens HeyA8 serumkoncentration mellem 2 og 10% serum haft den største effekt på 3% O

2 (

s

10

-5) (figur 2). Stigende serumkoncentration fra 6% til 10% havde lille effekt på væksten af ​​HeyA8, SKOV3 og HOC8 (figur 2). Sammen, fremgår det, at både ilt niveauer og serumkoncentrationen påvirke væksten af ​​disse æggestokkene cancercellelinier, men på en uafhængig måde. Som forventet fra arbejde af andre med primære celler [4], observerede vi, at størstedelen af ​​de ovarieceller kræft viste nedsat celleproliferation ved omgivelsernes O

2-koncentration i forhold til fysiologisk O

2-koncentration. Men to cellelinjer ikke at have hæmmet celledeling ved den højere (omgivende) O

2 niveauer. Vi kategoriseret derfor æggestokkene kræft cellelinjer baseret på disse forskelle, der enten O

2 følsom (A2780, OVCAR5, OVCAR8 og HOC8) eller ufølsom (SKOV3 og HeyA8) (figur 2). Samlet set har disse forskelle tyder heterogenitet i vækstregulering svar på fysiologiske signaler af O

2 niveauer i disse dyrkede cellelinjer.

Lige antal A2780 ovariecancerceller blev podet i en 10 cm petriskål og var rutinemæssigt holdes under 3% O

2 (fysiologisk) eller 21% O

2 (omgivende). Stigningen i celleantal blev bestemt ved at tælle manuelt en gang i tre dage, og det samlede celleantal blev vurderet og plottet ved lineær skala (i Graph A) og log skala (i Graph B).

ovariecancer cellelinjer blev dyrket under 3% eller 21% O

2, og omfanget af proliferation blev bestemt efter 3 dages vækst (se materialer og fremgangsmåder). For hver cellelinie, procentdelen af ​​celleproliferation ved 3% O

2 (let skraverede søjler) og ved forskellige koncentrationer af serum blev sammenlignet med proliferation under standard vævsdyrkningsbetingelser bestående af 21% (omgivende) O

2 (mørkt skraverede søjler) og 10% FBS. Fejlbjælkerne viser standardafvigelserne for middelværdi og statistisk signifikant (ved studerende T Test) forskelle i proliferation mellem 3% og 21% O

2 for hver koncentration af serum er angivet med en stjerne [(*)

s

0,05, (**)

s

0,001 og (***)

s

. 0,0001]

Det er muligt, at den tilsyneladende O

2 ufølsomhed og forskelle i proliferation skyldtes forskelle i fordoblingstiden for hver cellelinie. Hvis f.eks SKOV3 og HeyA8 (O

2 ufølsomme cellelinjer) proliferere langsommere, O

2 afhængig proliferation ændringer kan være for trivielt at måle. Derfor målte vi cellen fordoblingstid for alle ovarian cancer cellelinjer. Vores resultater viste, at under standard vævskultur-betingelser (10% serum og 21% O

2) fordoblingstiden for alle ovarian cancer cellelinjer var noget lignende ( 24 timer) med undtagelse af HOC8, som havde en forlænget fordoblingstid på omkring 45,5 ± 4,9 timer (tabel S1 og se Methods S1). Derfor er de fleste af de æggestokkene kræftceller var dividere på en omtrent lige sats, og grov forskel i fordoblingstid er usandsynligt, at være en faktor i de observerede spredning forskelle mellem cellelinjer under forskellige betingelser.

Oxygen følsomhed korrelater med dynamiske ændringer i S og G2 faser af cellecyklus

i betragtning af de forskelle i proliferation observeret for kræft i æggestokkene cellelinjer dyrket under enten 3% eller 21% O

2, vi undersøgt, om O

2-koncentration ændrer cellecyklus profil af hver cellelinie. Uanset serumkoncentration, sammenligne 3% O

2 til 21% O

2 resulterede i et signifikant fald i procentdelen af ​​celler, der var i G1 fasen af ​​cellecyklus og en betydelig stigning i procentdelen af ​​celler i S-fase (tabel 1), hvilket var forventet baseret på tidligere observationer med primære celler [27]. Desuden i tre af O

2 følsomme cellelinjer (A2780, OVCAR5 og OVCAR8) procentdelen af ​​cellens befolkning i G2 fase blev øget væsentligt i 21% O

2. Men en betydelig stigning i G2 blev ikke observeret i den fjerde O

2 følsom cellelinie, HOC8 (tabel 1). Svarende til HOC8, O

2 ufølsomme cellelinier, SKOV3 og HeyA8, ikke vise en signifikant ændring i andelen af ​​celler i G2-fasen af ​​cellens cyklus ved dyrkning under 3% O

2 eller 21% O

2 (tabel 1). I betragtning af, at de O

2 følsomme cellelinjer tilvækst langsommere ved 21% O

2 sammenlignet med 3% O

2 trods mindre andel af deres celle population i G1 og en øget omfang i S og G2, konkluderer vi, at disse celler skal forløber langsommere gennem cellecyklussen. Men for de O

2 ufølsomme cellelinjer og HOC8 (med udvidet betydeligt fordoblingstid), vi ikke oplever en betydelig stigning i andelen af ​​celler i G2, når O

2 niveauer blev forøget. Disse resultater antyder, at selv om G1 og S faser i cellecyklussen reagerer på lignende måde på ændringer i O

2-koncentration i både O

2 følsomme og ufølsomme cellelinjer, er det G2-fasen af ​​cellens cyklus, der er ikke reagerer på O

2 koncentration i O

2 ufølsomme cellelinjer. Derfor kan forskellen i cellecyklus respons iagttaget med disse æggestokkene cancercellelinier være på niveau af regulering under cellecyklusprogression fra G2 til M-fasen. Det er også muligt, at de observerede med G2 og O

2 følsomhed i disse cancercellelinier ændringer afspejles i den mitotiske komponent af cellecyklussen. Vores observation af mitotiske celler til stede i O

2 følsomme og ufølsomme cellelinjer dyrket under 3% og 21% O

2 understøtter denne konklusion; O

2 følsomme cellelinier viser et proportionalt fald i mitotiske cellepopulation observeret ved 21% O

2 sammenlignet med 3% O

2, (figur 3), svarende til en akkumulering af celler ved G2 ved 21% O

2 (tabel 1). Tilsvarende i de O

2 ufølsomme cellelinier (HeyA8 og SKOV3) andelen af ​​mitotiske celler forblev uændret uanset O

2 koncentrationer (figur 3). Dette er forventet, fordi, som tidligere nævnt (tabel 1), at andelen af ​​celler ved G2 i O

2 ufølsomme cellelinier var også upåvirket af O

2-koncentration. Vi konkluderer, at de fleste cancerceller bevarer en evne til at regulere cellens cyklus som reaktion på ændringer i O

2-koncentration sammenlignes med vildtype celler [27]. Dog kan visse cancerceller mister O

2 koncentrationsafhængig styring af cellecyklus (som i O

2 ufølsomme cancer cellelinjer), hvilket resulterer i en tydelig fænotype.

Mitoseindeks i æggestokkene cancercellelinier, der blev dyrket under 3% eller 21% O

2 i 3 dage blev bestemt ved at tælle kerner med kondenserede kromosomer, blandt mindst 1000 celler til stede i hvert forsøg. Statistisk signifikans blev bestemt ved ANOVA og den betydelige forskel i Mitoseindekset mellem 3% og 21% O

2 er angivet med en stjerne [(*)

s

0,05, (***)

s

0,0001]

Oxygen ufølsomhed korrelerer med ændret G2 /M komponenter

Indtil nu har vi vist, at O ​​

2. følsomme cellecyklus respons på G2 /M overgang mangler i O

2 ufølsomme cellelinjer. Vi gik derfor på at karakterisere denne observation yderligere ved at bestemme, hvad komponent i G2 /M regulering er mangelfuld i de O

2-ufølsomme kræftceller. Den største effektor af G2 /M overgang er CDC2 [22], [28]. CDC2 danner et kompleks med cyclin B [29], [30], som phosphorylerer forskellige strukturelle proteiner resulterer i kollaps nukleare kuvert, kondens og adskillelse af kromosomer [30], [31] og inaktivering af andre cellecyklus regulerende proteiner sådanne som WEE1, RB og Cdc25C [30], [32]. I normale celler, er de samlede niveauer for CDC2 protein holdes konstant gennem hele cellecyklus [33] og er reguleret af post-translationel modifikation [33] og cellulære lokalisering [30], [31]. Når Tyr15 resten på CDC2 dephosphoryleres ved Cdc25C, aktiveret CDC2 danner et kompleks med cyclin B, akkumuleres i kernen, og fremmer G2 /M overgang [30], [33], [34]. Dette sker på en trinvis måde gennem stigende mængder af nukleart CDC2 protein [30]. Vores undersøgelse af total CDC2 protein og phosphoryleret CDC2 protein afslørede, at begge er betydeligt lavere i O

2-ufølsomme cellelinier (HeyA8 og SKOV3) sammenlignet med de O

2-følsomme cellelinjer (figur 4A). Selvom niveauet af Cdc2 var relativt høje i O

2-følsomme cellelinjer (A2780, OVCAR5 og OVCAR8) (figur 2), vi observerede et fald i Tyr15 fosforylering status uanset O

2 koncentration for A2780, OVCAR5 og OVCAR8 med stigende serumniveauer (figur 4A). Dette korrelerer med den observation, at stigende serumkoncentrationsværdier forårsager forøget cellulær proliferation og resulterer i en ledsagende reduktion i andelen af ​​celler i G2 /M (sammenlign med tabel 1). Der blev imidlertid ikke åbenlys O

2-afhængig ændring i enten hel eller phosphoryleret cyklin B eller Cdc25C observeret i O

2 følsomme cellelinjer (A2780, OVCAR5, OVCAR8 og HOC8) i forhold til O

2 ufølsom cellelinier (HeyA8 og SKOV3) (figur 4A). Derfor fremgår det, at den observerede nedgang i cellepopulationen i G2 i 21% O

2 ikke kan være afhængig phosphorylering-medieret inaktivering af Cdc2. Det skal bemærkes, at disse eksperimenter blev udført i asynkront voksende celler, og det er derfor muligt, at forbigående forskelle i CDC2 status blev overset. Interessant, niveauerne af CDC2, Cyclin B og Cdc25C (den negative regulator af CDC2) var betydeligt lavere i O

2 ufølsomme cellelinier (HeyA8 og SKOV3) sammenlignet med O

2 følsomme cellelinjer (A2780, OVCAR5, OVCAR8 og HOC8) (figur 4A). Disse observationer tyder på en iboende mangel i de centrale komponenter involveret i G2 /M progression i O

2 ufølsomme cellelinjer.

Proteinlysater fremstillet ud fra de æggestokkene kræft cellelinjer opretholdt i vækstmedium bestående af stigende koncentrationer af serum og 21% eller 3% O

2 blev analyseret ved Western blot. (A) I forhold til O

2 følsomme cellelinjer, nedsat udtryk for de centrale komponenter involveret i G2 /M cellecyklusprogression CDC2 /cyclin B1 kompleks og observeres sin aktivator Cdc25C i O

2 ufølsomme cellelinjer ( angivet med stjerne og kursiv), mens ekspressionen af ​​14-3-3 σ, et protein, der hæmmer CDC2 er forhøjet i O

2 ufølsomme cellelinjer. (B) Phosphorylering af RB og Wee1 blev overvåget som en indikator for CDC2 funktion, fordi både RB og Wee1 er kendte mål for phosphorylering med CDC2. Lige belastning af proteinekstrakter blev overvåget ved de afisolerede Western blots probning med det primære antistof for β-actin.

p53, p21 og 14-3-3 σ er faktorer, som har evnen negativt at påvirke CDC2 aktivitet og G2 /M overgang [22]. Aktuel forståelse er, at p53 og p21 indflydelse cellecyklus i hypoxisk og hyperoxiske betingelser [23], [24], [35], [36]. I betragtning af de reducerede niveauer af CDC2 og tilsyneladende defekte G2 /M checkpoint i O

2 ufølsomme cellelinjer (HeyA8 og SKOV3), udforskede vi muligheden for, at nedskrivninger skyldtes en defekt i en af ​​disse molekylære regulatorer. Western blot analyse fundet p53 og p21, der skal overudtrykt i én O

2-ufølsom cellelinie (HeyA8). Men begge var, fraværende i den anden O

2-ufølsom cellelinie (SKOV3), og udtrykket mønster for disse proteiner forblev uændret uanset ændringer i O

2 eller serumkoncentration (figur S1), hvilket tyder på, at hverken p53 eller p21 er relevant for CDC2 funktion i O

2 følsomhed. Interessant, observerede vi en betydelig stigning i ekspressionen af ​​14-3-3 σ (figur 4A) i O

2 ufølsomme cellelinjer (HeyA8 og SKOV3) i forhold til de O

2-følsomme cellelinjer. Selvom niveauet af 14-3-3 σ ekspression var betydeligt lavere i hver O

2-følsomme cellelinier sammenlignet med HeyA8 og SKOV3, vi observere en stigning i ekspressionen af ​​14-3-3 σ ved 21% O

2 med A2780 (figur 4A). Selv i modstrid med den kendte inhiberende rolle 14-3-3 σ på CDC2 aktivitet, konkluderede vi, at høje niveauer af 14-3-3 σ kombineret med reducerede niveauer af Cdc2 i en prolifererende cancercelle kan indikere en manglende kontrol med G2 /M progression som reaktion på O

2 etager.

for at tydeliggøre følge af de lave niveauer af CDC2 protein observeret i O

2-ufølsomme cellelinjer, vi bestemt den funktionelle aktivitet af de resterende CDC2 ved at undersøge phosphorylering af to af sine substrater, RB og WEE1. Phosphorylering af RB på Ser 807 remanensen medieres af CDC2 [32], og vi observerede denne phosphorylering uanset Cdc2 niveauer eller O

2 niveauer med 10% serum for alle cellelinjer med undtagelse HOC8 (figur 4B), hvilket indikerer usvækket CDC2 aktivitet i disse cellelinjer. En reduktion i phosphoryleret RB korreleret med reduktionen af ​​serum-koncentration (figur 4B) og korreleret med øget akkumulering af den samlede RB i O

2-sensitive cellelinjer (A2780, OVCAR5 og OVCAR8), men ikke i HOC8 (figur 4B) . Samlet RB var knap påvises i O

2-ufølsomme cellelinjer (HeyA8 og SKOV3) (figur 4B), med undtagelse af 2% serum ved 3% O

2 tilstand i HeyA8 cellelinje. Interessant, en sammenligning mellem RB ekspressionsmønster (figur 4B) og celleproliferation (figur 2) viste, at HOC8, HeyA8 og SKOV3 celler vokser bedre i celledyrkningsmedium med en lav koncentration af serum (2%) i forhold til A2780, OVCAR5 og OVCAR8. Det fremgår derfor, at den samlede RB proteinniveauet respons forbliver intakt i O

2-følsomme cellelinjer, og at dette svar er nok mere relevant for serumkoncentrationer end O

2 etager. Den anden mål for CDC2-medieret inaktivering ved phosphorylering er WEE1, der kan også gensidigt inhibere CDC2 funktion ved phosphorylering [37]. Vi observerede øget fosforylering af WEE1 i O

2 følsomme cellelinjer (A2780, OVCAR5 og OVCAR8), knap påviselige niveauer i HOC8, (figur 4B) og et komplet fravær i O

2-ufølsom cellelinjer ( HeyA8 og SKOV3, figur 4B). Dette mønster blev stort set sammenfattet for totale Wee1-protein niveauer (figur 4B). Derfor er fraværet af phospho-WEE1 i O

2-ufølsomme cellelinjer ikke indikerer et fravær af CDC2 aktivitet, men snarere et fravær af WEE1 substrat. Ud fra disse resultater konkluderede vi, at på trods af de reducerede mængder af CDC2 i O

2-ufølsomme cellelinjer, CDC2 er funktionelt aktive og uhæmmet af de øgede niveauer af 14-3-3 σ. Det skal bemærkes, at RB og CDC2 handle ud fra hinanden for at regulere hinandens funktion [38], og phosphorylering status RB [26] eller CDC2 [39] kan påvirke E2F medieret ekspression af cykliner, der er væsentlige for cellecyklusprogression. Derfor overvejer dette komplekse forhold mellem RB og CDC2, phosphoryleringen mønster af RB er utilstrækkelig til at forudsige G2 /M progression.

Sammenfattende O

2-sensitive cellelinjer (A2780, OVCAR5 og HOC8 ) viste forøget ekspression af Cdc2 og cyclin B kombineret med lavt niveau af 14-3-3 σ ekspression. Dette antyder, at cellecyklussen komponenter, der kræves for en dynamisk proliferativ reaktion på forskelle i O

2-koncentration er til stede i disse cellelinier. Men i O

2-ufølsomme cellelinier, som udtrykker høje niveauer af 14-3-3 σ og lave niveauer af Cdc2 og Cdc25C sådan dynamisk cellecyklus reaktion på ændringer i O

2-koncentration kunne hæmmes. Vi forfulgte derfor muligheden for, at denne omvendte korrelation mellem 14-3-3 σ og CDC2 kan være vigtigt for O

2-følsomme regulering af G2 /M overgang.

14-3-3 σ og mitotisk progression i ilt følsomhed

Vores tidligere observationer tyder en sammenhæng mellem forhøjet niveau af 14-3-3 σ og O

2-ufølsomhed, der skal bekræftes. Derfor ønskede vi at bekræfte, at 14-3-3 σ faktisk påvirker O

2-afhængig proliferation. Til denne del af undersøgelsen, vi begrænset vores analyse til to cellelinjer med vildtype p53: O

2-følsomme A2780 [40], og O

2-ufølsomme HeyA8 cellelinier [41]. Hidtil har vi anvendt Western blot-analyse for at overvåge den samlede ekspressionsniveauer af 14-3-3 σ og CDC2 (figur 4A). Eftersom de funktionelle responser af disse proteiner er afhængige af deres cellulære lokalisering, anvendte vi immunofluorescens at bestemme deres cellulære lokalisering under 3% O

2 og 21% O

2. I O

2-sensitive A2780 cellelinje blev lokaliseringen af ​​14-3-3 σ begrænset til cytoplasmaet under 3% O

2 (figur 5A), men blev fundet i både kernen og cytoplasmaet på 21% O

2 (figur 5A). CDC2 blev fordelt i hele cellen og dens lokalisering var upåvirket af O

2-koncentration. Det fremgår således, nuklear udelukkelse af 14-3-3 σ korrelerer med en nedsat fraktion af celler i G2 /M-fasen og en uhæmmet cellecyklusprogression når A2780 dyrkes ved 3% O

2, som nævnt før (tabel 1). I modsætning hertil viste O

2-ufølsomme HeyA8 cellelinje høje niveauer af 14-3-3 σ og lave niveauer af Cdc2 (figur 4A), med en betydelig mængde 14-3-3 σ i cytoplasmaet (figur 5A). Endvidere forblev 14-3-3 σ udelukket fra kernen, selv ved 21% O

2 i HeyA8 celler (figur 5A). Disse observationer blev yderligere verificeret ved Western blot-analyse af kerner og cytosol cellefraktioner opnået fra disse celler (figur 5B). Endelig, for at bekræfte effekten på G2 /M overgang, vi bestemt andelen af ​​de celler i M-fasen for forskellige O

2 koncentrationer ved hjælp af mitose specifikke markør phospho-histon H3. I O

2-følsomme A2780 celler, under 21% O

2, observerede vi et fald i mitoseindeks (P 0,001), sammenlignet med 3% O

2 (figur 5C). Ingen sådan O

2-afhængig ændring i mitoseindeks blev observeret for de O

2-ufølsomme HeyA8 celler (Figur 5C). Disse resultater understøtter vores indledende konklusion, at de O

2-ufølsomme cellelinjer har en mangel i reguleringen cellecyklusprogression ved G2 /M som reaktion på øget O

2 niveauer (Figur 2).

(A) Cellulær lokalisering af immunofluorescens viser, at 14-3-3-σ (grøn) er placeret i cytoplasmaet og CDC2 (Red) er til stede i kernen (blå). Sammenlignet med O

2 sensitive A2780 celler, omfanget af 14-3-3 σ er højere og CDC2 er lav i O

2 ufølsomme HeyA8 celler. I O

2 følsom A2780, er 14-3-3 σ lokaliseret både i kernen og cytoplasmaet på 21% O

2. (En stiplet gul linje, skitserer en repræsentativ kerner til at angive relative lokalisering af 14-3-3 σ og CDC2 i disse celler). (B) Western blot-analyse af nukleare og cytoplasmiske fraktioner har lave niveauer af 14-3-3 σ i kernen i forhold til cytoplasmaet, med forøgede mængder af 14-3-3 σ er til stede i cytoplasmaet af O

2 insensitive HeyA8 celler. Niveauet af Cdc2 er højere både i kernen og cytoplasmaet af O

2 følsom A2780, men til stede i lavere mængde kun i kernen af ​​O

2 ufølsomme HeyA8 celler. Histon H1 og β-actin blev anvendt som lastning kontroller for nukleare og cytoplasmatiske fraktioner henholdsvis. (C) mitotiske celler blev bestemt ved tælling af celler, der farves positivt for en mitose specifik markør, Phospho-histon H3 fra den samlede cellepopulation. (C). Eksperimenter blev udført tre gange.