PLoS ONE: Docetaxel-Modstand i prostatakræft: Evaluering Associated fænotypiske ændringer og Potentiale for Resistance Transfer via Exosomes

Abstrakt

Baggrund

Hormon-refraktær prostatakræft stadig hindres af uundgåelige progression af resistens til første linie behandling med docetaxel. Nylige undersøgelser tyder på, at fænotypiske ændringer forbundet med cancer kan overføres fra celle til celle

via Salg mikrovesikler /exosomer. Her sigter vi at undersøge fænotypiske ændringer i forbindelse med docetaxel-modstand, for at hjælpe med at bestemme kompleksiteten af ​​dette problem, og at vurdere relevansen af ​​udskilte exosomer i prostatakræft.

Metode /vigtigste resultater

docetaxel-resistente varianter af DU145 og 22Rv1 blev etableret og karakteriseret i form af krydsresistens, morfologi, spredning, motilitet, invasion,

anoikis

, kolonidannelse, exosomer sekretion deres og funktionel relevans. Indledende analyse af exosomer fra relevante serumprøver blev også udført. Erhvervet docetaxel-resistens tillagt krydsresistens over for doxorubicin og inducerede ændringer i motilitet, invasion, spredning og forankring-uafhængig vækst. Exosomer bortvist fra DU145 og 22Rv1 docetaxel-resistente varianter (DU145RD og 22Rv1RD) tillægges docetaxel-resistens mod DU145, 22Rv1 og LNCap celler, som kan være til dels skyldes exosomal MDR-1 /P-gp overførsel. Exosomer fra prostata cancer patienter sera induceret øget celleproliferation og invasion, i forhold til exosomer fra aldersmatchede kontroller. Desuden exosomer fra sera fra patienter, der gennemgår et kursus af docetaxel behandling i forhold til matchede exosomer fra de samme patienter før docetaxel behandling påbegyndes, når den anvendes til både DU145 og 22Rv1 celler, viste en korrelation mellem cellulært respons på docetaxel og patienternes reaktion på behandlingen med docetaxel.

konklusioner /betydning

Vores undersøgelser viser den komplekse og mangesidede karakter af docetaxel-resistens i prostatakræft. Desuden er vores

in vitro

observationer og indledende kliniske undersøgelser viser, at exosomer kan spille en vigtig rolle i prostatakræft, i celle-celle kommunikation, og dermed kan tilbyde potentiale som køretøjer, der indeholder prædiktive biomarkører og nye terapeutiske mål.

Henvisning: Corcoran C, Rani S, O’Brien K, O’Neill A, Prencipe M, Sheikh R, et al. (2012) Docetaxel-Modstand i prostatakræft: Evaluering Associated fænotypiske ændringer og Potentiale for Resistance Transfer via Exosomer. PLoS ONE 7 (12): e50999. doi: 10,1371 /journal.pone.0050999

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: Marts 28, 2012; Accepteret: 30 Oktober 2012; Udgivet: December 10, 2012 |

Copyright: © 2012 Corcoran et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Science Foundation Irlands finansiering af Det strategiske Forskningsråd Cluster, Molekylær Therapeutics for Cancer Irland (08 /SRC /B1410) til JC, WW, LOD; finansiering, til LOD, at støtte KOB som Marie Keating Foundation Scholarship ved Trinity College Dublin; og infrastruktur og core facilitet støtte gennem Irlands HEA s program for forskning i tredje niveau Institutes (PRTLI) Cyklus 5 til LOD blandt andet TCD proteasehæmmere. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mens docetaxel tilbyder forbedret samlet overlevelse for patienter med hormon-refraktær prostatakræft (HRPC) som fremgår af to fase III forsøg (TAX 327 og SWOG 9916) og efterfølgende klinisk ledelse, desværre tilbagefald er næsten uundgåelig. Årsager til svigt af docetaxel til at øge overlevelsen over ~2.5 måneder er endnu ikke helt klarlagt. Lægemiddelresistens ofte tilskrives med overekspression af transportproteiner, herunder P-glycoprotein (MDR-1 /P-gp), der er forbundet med udstrømningen af ​​mange anti-cancer (og andre) midler [1] – [3]. Endvidere har også vist sig at bidrage til ændringer i den invasive og bevægelige fænotype af celler, kemo-resistens [4] – [7]. Andre fænotypiske egenskaber, der kan være forbundet med dette problem i prostatacancer er endnu ikke fastlagt.

Hertil kommer, at de seneste undersøgelser tyder på, at fænotypiske ændringer i forbindelse med kræft kan overføres fra celle til celle

via

mikrovesikler /exosomer. Exosomer er blevet beskrevet som nanostørrelse membranbundne vesikler endocytiske oprindelse [8]. Afhængigt af deres celle af oprindelse, har disse små vesikler været impliceret med adskillige forskellige roller hvoraf nogle omfatter deres forbindelse med sygdomstilstande, såsom cancer. Intercellulær kommunikation er en sådan rolle, gennem deres evne til at fremme signaltransduktion [9] og overførsel af membranreceptorer, proteiner, mRNA og miRNA [10], [11] fra en celle til en anden. Relevansen af ​​exosomer med hensyn til deres potentiale for at hjælpe med prostatakræft progression og udvikling af kemo-resistens er endnu ikke fastlagt.

På grund af den komplekse karakter af prostatakræft progression, docetaxel-resistent prostata-cellelinjer blev udviklet og karakteriseret til at repræsentere både primære og metastatiske tumorer samt androgen-følsomhed og androgen-resistens i prostatacancer. Kort fortalt, erhvervet resistens til docetaxel, i to prostatakræft-cellelinier, tillagt krydsresistens over for anthracyclin, doxorubicin og inducerede ændringer i motilitet, migration, invasion, proliferation og forankringsuafhængig vækst. Anvendelse af exosomer isoleret fra docetaxel-resistente DU145RD og 22Rv1RD cancerceller, at docetaxel-sensitive DU145, 22Rv1 og LNCaP moderceller medførte en betydelig stigning i resistens over for docetaxel til hver af disse recipientceller. Dette kan, i det mindste delvist, skyldes overførslen af ​​MDR-1 /P-gp ved exosomer. Exosomer fra prostatacancer serumprøver inducerede en signifikant stigning i celleproliferation og invasion forhold til exosomer fra aldersmatchede raske kontroller. Desuden exosomer fra sera fra patienter, der gennemgår et kursus af docetaxel behandling i forhold til matchede exosomer fra de samme patienter før docetaxel behandling påbegyndes, når den anvendes til både DU145 og 22Rv1 celler, viste en korrelation mellem cellulært respons på docetaxel og patienternes respons på docetaxel behandling. Disse foreløbige translationelle undersøgelser støtter den kliniske relevans af exosomer i prostatakræft.

Resultater

afgørelsen af ​​omfanget af Modstand mod Docetaxel

Som det fremgår af tabel 1, DU145RD og 22Rv1RD celler blev fundet at være ca. 108- og 71-fold resistente over for docetaxel i forhold til deres respektive alderen forælder cellelinjer.

docetaxel-resistente celler Demonstrere Nogle Cross Modstand mod Andre kræftbehandlingsmidler

Både resistent cellelinje varianter udviste krydsresistens (4-8 gange) over for doxorubicin (tabel 1), mens ingen signifikante forskelle i følsomhed til 5-fluoruracil eller Carboplatin blev observeret for DU145RD eller 22Rv1RD i sammenligning med deres respektive forælder celler.

Docetaxel-resistente varianter ikke adskiller sig morfologi men har forskellige spredning, motilitet og invasion fænotyper Versus Parent cellelinier

Observation af cellemorfologi afslørede ingen væsentlige forskelle i morfologi af cellerne efter erhvervet docetaxel-resistens (Figur 1), skønt resistente celler prolifererer langsommere end deres docetaxel-sensitive forælder populationer (tabel 2). Sårhelende assays blev anvendt til at vurdere virkningerne af docetaxel-resistens på cellemotilitet (figur 2). Efter 24 timer DU145RD celler udviste signifikant (p 0,05) forøget sårlukning sammenlignet med DU145. Docetaxel-resistent 22Rv1RD viste marginal, men signifikant (p 0,05), nedsat sårlukning forhold til 22Rv1. Overvejer den cellulære migration (figur 3A) og invasion (figur 3B), blev DU145RD sig at have øget motilitet (p 0,01) og invasive kapacitet (p 0,05) sammenlignet med DU145. 22Rv1RD sammenlignet med 22Rv1 celler imidlertid udviste en formindsket tendens i migration (p 0,01) og invasion (p 0,05).

Billeder af følsomme forælder og docetaxel-resistente varianter af DU145 og 22Rv1 cellelinier. (Olympus CKX4, 20X forstørrelse).

sårheling analyser blev udført for at vurdere celle motilitet. Monolag blev ridset med en pipettespids, og de resulterende sårede områder blev overvåget ved fasekontrastmikroskopi i 24 timer (DU145) og 48 timer (22Rv1). Resultater er vist som n = 3 ± SEM, hvor * = p. 0,05 (t-test)

Migration assays blev udført under anvendelse af 8 um porestørrelse 24 brønde Transwell kamre; B: For invasion assays indlæggene blev præ-belagt med ECM. Cellerne fik lov til at migrere /invadere i 48 timer (DU145) og 72 timer (22Rv1). Resultaterne vises som n = 3 ± SEM, hvor * = p 0,05, ** = p. 0,01 (t-test)

Erhvervet Docetaxel-resistens Påvirker Anchorage-uafhængig Overlevelse og vækst

Undersøgelse om erhvervet resistens også kan overdrage

anoikis

modstand, vi observerede resistens at være signifikant forbundet med nedsat celledød under

anoikis

betingelser for både narkotika resistente varianter

dvs.

DU145RD (p 0,05) og 22Rv1RD (p 0,05); i forhold til deres respektive kontrolceller (figur 4A). Efterfølgende at vurdere, om disse levedygtige celler er også i stand til at formere sig i suspension, blev kolonidannelse i blød agar sig at være steget betydeligt i DU145RD (

P

0,05) og 22Rv1RD (

P

. 0,05) i sammenligning med deres respektive forælder-celler (figur 4B)

i

anoikis

assays cellelinje varianter blev udpladet på poly (hydroxyethyl methactylic) syre-coatede brønde 24 – eller 95% ethanol-overtrukne plader, som kontroller – og blev dyrket i 24 timer. 100 pi Alamar blue farvestof blev derefter tilsat til hver brønd, inkuberet i 4 timer og absorbansen blev målt ved 570 nm; B: kolonidannelse assays blev udført ved anvendelse Cytoselect ™ 96-Well Cell Transformation kit. Celler blev inkuberet i 8 dage i halvfast agar medier før de blev lyseret og detekteret med CyQuant GR Dye i en fluorescenspladelæser. Resultaterne vises som n = 3 ± SEM, hvor * = p. 0,05 (t-test)

Exosomer udskilles fra prostatacancerceller og kan påvirke Reaktion på Docetaxel men ikke signifikant Alter proliferation, motilitet og invasion

Transmissionselektronmikroskopi identificeret tilstedeværelsen af ​​exosomer isoleret fra det konditionerede medium af alle cellelinie varianter (figur 5A). Desuden western blotting for både TSG101 og PDC6I /Alix (figur 5B), proteiner ofte forbundet med exosomer dannelse og dermed anses for at være vigtige markører for vellykket isolering af exosomer [12], [13], blev påvist i isolater fra konditionerede medium alle cellelinie varianter. Mængden af ​​exosomer bortvist fra docetaxel-resistente og ældet-matchede varianter adskilte sig ikke signifikant (figur S1A). Som erhvervet docetaxel-resistens i DU145RD cellerne var forbundet med øget migration og invasivitet Derefter undersøgte vi, hvis autologe (DU145) eller resistente (DU145RD) exosomer kunne ændre motilitet vurderet ved sårheling kapacitet (figur 5C) og invasion (figur 5D ( i)) af DU145. Ingen signifikant forskel mellem oprullede lukninger af celler i nærvær af DU145 eller DU145RD exosomer blev fundet. Tilsvarende når den anvendes til 22Rv1 celler, hverken DU145- eller DU145RD-afledte exosomer tillagt væsentlig betydning for invasion (figur 5D (ii))

A:. Transmission Electron Microscopy blev udført for at undersøge størrelse og struktur exosomer ; B: Western blotting blev udført for at vurdere ekspressionen af ​​fælles exosomer markører i 30 ug (TSG101) og 8 ug (PDC6I /Alix) exosomer isoleret fra DU145 og 22Rv1 cellelinie varianter; C: DU145 sårhelende assays i nærvær af exosomer (5 ug) fra DU145 cellelinje varianter; D (i): DU145 invasion assays i nærvær af exosomer (15 ug) fra DU145 cellelinje varianter; D (ii): 22Rv1 invasion assays i nærvær af exosomer (15 ug) fra DU145 cellelinje varianter

En lille stigning i proliferation af DU145 celler i nærvær af DU145-afledte exosomer blev noteret. . Dette nærmede signifikans (p = 0,053); dog havde DU145RD exosomer ikke i væsentlig grad ændre udbredelsen af ​​DU145 celler (figur 6A (i)); muligvis som følge af den langsommere væksthastighed af de celler, fra hvilke disse sidstnævnte exosomer blev afledt. Efter behandling med IC

50 koncentration af docetaxel, tilstedeværelsen af ​​DU145 exosomer (p 0,05) og i et større omfang DU145RD exosomer (p 0,01) (Figur 6A (ii)) blev fundet at inducere en betydelig grad af docetaxel ufølsomhed (resistens) til cellerne. Til mere bredt undersøge om DU145RD exosomer kan fremkalde lignende påvirker når den anvendes til andre cellelinjer, vi næste undersøgt disse exosomer på både 22Rv1 og LNCap celler (figur 6B og 6C). Hverken DU145- eller DU145RD-afledte exosomer væsentligt påvirket af spredning af 22Rv1 eller LNCaP-celler (figur 6B (i) og 6C (i)). Efter behandling med docetaxel, blev ikke observeret nogen væsentlig ændring som respons på 22Rv1 eller LNCaP-celler med docetaxel i nærvær af DU145 exosomer sammenlignet med virkningen af ​​lægemidlet i nærvær af PBS i stedet for exosomer (figur 6B (ii) og 6C ( ii)). Men i nærværelse af DU145RD exosomer, evne 22Rv1 og LNCaP-celler til at overleve i denne koncentration af docetaxel blev signifikant forøget (p 0,001) (figur 6B (ii) og 6C (ii)). At afgøre, om dette sandsynligvis vil være specifikke for exosomer fra én cellelinje variant (DU145RD) eller mere generelt exosomer fra docetaxel resistens celler blev exosomer fra 22Rv1 og 22Rv1RD varianter efterfølgende vurderet. Her fandt vi den samme tendens til at forekomme

dvs..

Var der ingen signifikant stigning i udbredelsen af ​​DU145 eller LNCap cellerne i nærvær af enten 22Rv1 eller 22Rv1RD exosomer (Figur 6D (i) og figur 6E (i)). Der var ingen signifikant ændring i respons på docetaxel, af enten DU145 eller LNCap celler, i overværelse af alderen forældre 22Rv1-afledte exosomer. Men i nærværelse af exosomer fra resistent variant 22Rv1RD begge DU145 celler (p 0,01) (Figur 6D (ii)) og LNCaP-celler (p 0,01) (Figur 6E (ii)) viste en signifikant stigning i resistens over for docetaxel

AC (i):. DU145, 22Rv1 og LNCaP spredning i overværelse af exosomer (20 ug) fra DU145 cellelinje varianter; A-C (ii) reaktion af DU145, 22Rv1 og LNCaP-celler med docetaxel i nærvær af exosomer (20 ug) fra DU145 cellelinje varianter; D-E (i): DU145 og LNCaP proliferation i nærvær af exosomer (20 ug) fra 22Rv1 cellelinje varianter; D-E (ii): Reaktion af DU145 og LNCaP-celler med docetaxel i nærvær af exosomer (20 ug) fra 22Rv1 cellelinje varianter; F: Western blotting blev udført for at vurdere ekspressionen af ​​MDR-1 /P-gp i totalt cellulært protein (50 ug) og tilsvarende exosomer (30 ug) af DU145 og 22Rv1 cellelinie varianter. Resultaterne vises som n = 3 ± SEM, hvor * = p 0,05, ** = p 0,01, *** = p. 0,001 (t-test)

Vi har tidligere rapporterede, at både DU145RD -og 22Rv1RD i højere extent- udtrykte MDR-1 /P-gp, hvorimod MDR-1 /P-gp blev opdaget i alders-matchede kontrol celler, DU145 og 22Rv1 [14] (figur 6F). For at undersøge om MDR-1 /P-gp er muligvis udført

via

exosomer fra DU145RD eller 22Rv1RD celler, undersøgte vi forekomsten af ​​denne efflukspumpen i exosomer isoleret fra disse resistente varianter. Her rapporterer vi, at MDR-1 /P-gp er faktisk til stede i de tilsvarende exosomal ekstraktioner (Figur 6F).

Exosomer detekteres i serum fra prostatacancerpatienter og kan påvirke celleproliferation, Invasion og reaktion på Docetaxel

Western blotting for både TSG101 og PDC6I /Alix (figur 7A) viste den vellykkede isolering af exosomer fra sera af patienter med prostatacancer og raske kontrolpersoner. Mængder af exosomer detekteret i sera fra prostata cancer patienter og alderen-matchede kontroller adskilte sig ikke signifikant (figur S1B). Når tilføjes DU145 celler, exosomer fra docetaxel-naive patienter med prostatacancer (n = 6) viste en signifikant (

P

0,001) stigning i invasionen i forhold til exosomer fra aldersmatchede raske kontrolpersoner (Figur 7B ). Endvidere, når påført 22Rv1 celler, var der en signifikant stigning i proliferation i nærvær af prostatacancer exosomer i forhold til dem fra raske kontroller (

P

0,01) (figur 7C). Med henblik på at vurdere potentielle relevans af cirkulerende exosomer med hensyn til, hvordan de kan hjælpe med at forudsige eller endog påvirke patienternes respons på docetaxel behandling, de påvirkninger af exosomer isoleret fra patienter før docetaxel behandling (n = 8) sammenlignet med matchede exosomer isoleret fra de samme patienter i løbet af deres 10 cykler af docetaxel behandling blev vurderet. Med henblik på denne pilotundersøgelse, patienter (n = 6), som opnåede faldende PSA niveauer med behandling i forhold til deres før behandling PSA niveauer blev betragtet som “responders”, mens de (n = 2), hvis PSA niveauer steg i løbet af behandlingen blev anset som “non-respondere”. Som angivet i fig 7D, blev 22Rv1 og DU145 celler eksponeret for deres omtrentlige IC

50 koncentrationer af docetaxel og den resulterende cellelevedygtigheden blev efterfølgende tildelt en arbitrær værdi på 1. De exosomer isoleret under behandling fra patienter med stigende PSA niveauer (Patienter A B; “ikke responderede”) blev fundet at beskytte både 22Rv1 og DU145 celler mod virkningerne af docetaxel. I modsætning til de 6 docetaxel “responders”, exosomerne isoleret under deres behandlingsforløb syntes at forbedre de inhiberende virkninger af docetaxel på både 22Rv1 og DU145 celler.

Western blotting blev udført for at vurdere ekspressionen af fælles exosomer markører i 30 pg exosomer isoleret fra sera af docetaxel-naive patienter (patient # 1-6) og alder-matchede raske kontrolpersoner (kontrol # 1-6). B: DU145 invasion i nærvær af exosomer fra docetaxel-naive patienter og ældede-matchede raske kontroller (25 ug), med repræsentative invasion billede, der vises. C: 22Rv1 proliferation i tilstedeværelsen af ​​exosomer fra behandlingsnaive patienter og aldersmatchede raske kontrolpersoner (25 ug). Resultater er vist som n = 6 ± SEM, hvor ** = p 0,01, *** = p 0,001 (t-test). D: Reaktion, at docetaxel, af 22Rv1 og DU145 celler i nærvær af serum-afledte exosomer fra patienter med forhøjede PSA niveauer (n = 2; Patienter A B) og i nærvær af exosomer fra patienter med nedsat PSA niveauer ( n = 6; Patienter C-H)

diskussion

Mens docetaxel forbliver som den nuværende gyldne standard for HRPC behandling, det kun øger overlevelse på gennemsnitligt 2,5 måneder, og dem. patienter, der oprindeligt reagerer med tiden udvikler resistens over for dette stof. I denne undersøgelse, viser vi den komplekse karakter af docetaxel-resistens ved brug af

in vitro

menneskelige prostata cancer cellelinje modeller. Både docetaxel-resistent cellelinje varianter i denne undersøgelse viste krydsresistens over for doxorubicin, hvilket stemmer overens med tidligere undersøgelser af docetaxel-resistente bugspytkirtelkræftceller [15] og brystkræftceller [16]. Desuden har paclitaxel, hvorfra docetaxel syntetisk afledte, været forbundet med krydsresistens over for doxorubicin i paclitaxel-resistente prostatacancer-cellelinier [2]. Interessant DU145RD og 22Rv1RD celler, sammenlignet med deres alderen forælder populationer, deles også en række andre fænotypiske karakteristiske ændringer i tillæg til modstand og krydsresistens. Disse omfattede nedsat proliferation, øget

anoikis

modstand og øget koloni formation; men DU145RD og 22RV1RD afveg med hensyn til ændringer i deres motilitet og invasion

Øget migration og invasion har tidligere været forbundet med kemoresistens [4] -. [6], som er afspejlet i resultaterne af vores DU145 model. Mens 22Rv1 celle varianter vises de modsatte virkninger med hensyn til migration og invasion, er det bemærkelsesværdigt, at for motilitet assays niveauet af sårlukning var minimal følgende 48 timer og invasion /migration assays blev podet på et væsentligt højere densitet end påkrævet for DU145 celler for at opnå de observerede resultater. Det er muligt, at disse forskelle, kan være forbundet med allerede kendte forskelle mellem cellelinierne (specificeres, 22Rv1 celler er fra en primær tumor og er androgen-sensitive, mens DU145 er fra en hjernemetastaser og er androgen-ufølsom). Dette understreger yderligere behovet for disse typer af undersøgelser og inddragelse af større paneler af cellelinje modeller, hvor det er muligt, at så optimalt som muligt afspejle andre patient-til-patient forskelligheder og så øge vores forståelse af kompleksiteten af ​​docetaxel-resistens i prostatakræft. Knockdown af beta catenin i osetocarcinoma celler stigende resistens over for doxorubicin har tidligere været forbundet med undertrykt invasion [7]. Endvidere multiresistente cellelinier afledt af Dunning R3327 model af rotte prostatacarcinom har vist, at miste metastatisk potentiale hos værtsdyr i sammenligning med deres forælder-celler [17].

Tidligere undersøgelser under anvendelse af kolorektal cancer ( HT29), brystkræft (T47D) og tyktarmskræft (H630) celler, i overensstemmelse med vores egen, har fundet, at erhvervet kemo-resistens kan reducere væksten [18], [19]. Reduceret celleproliferation på grund af tilstedeværelsen af ​​kromosomal ustabilitet, som er forbundet med multiresistens, er for nylig blevet demonstreret i kolorektale cancerceller [20]. Således øgede evne docetaxel-resistente varianter at modstå celledød under

anoikis

forhold i vores undersøgelse kan ikke tilskrives en simpel øget hyppighed af spredning. Sammenhængen mellem øget klonogene overlevelse og kemo-modstand, observeret i både vores DU145RD og 22Rv1RD celler, er i overensstemmelse med flere andre undersøgelser [18], [21], [22].

Den nye beviser for, at celler kan kommunikere med nabolandet “eller sekundære celler” gennem udskillelsen af ​​mikro- eller nanostørrelse vesikler (kendt som exosomer) bærer cellulære oplysninger har for nylig understreget betydningen af ​​disse enheder [23]. Vi har derfor undersøgt potentialet i disse vesikler at blive udvist og overføre fænotypiske forandringer, forbundet med docetaxel-resistens, til sekundære celler. Ingen væsentlige forskelle i motilitet, invasion eller spredning af DU145 og 22Rv1 celler blev observeret i tilstedeværelsen af ​​DU145- eller DU145RD-afledte exosomer. Begrænsede studier til dato, har vist, at exosomer udtrykker amphiregulin [24] og HSP90α [25] kan øge kræftcellen motilitet og migration. Imidlertid synes dette ikke at være tilfældet med prostatakræft celleafledte exosomer vurderes her.

Interessant vi fundet induceret docetaxel-resistens med DU145 celler i nærvær af DU145RD exosomer. (Ca. 22%), sammenlignet med, når disse celler blev udsat for deres egne exosomer. Dette antyder, at DU145RD exosomer er i virkeligheden, at overføre resistens over for docetaxel. Desuden blev et lignende mønster findes, når DU145- og DU145RD-afledte exosomer blev føjet til 22Rv1 og LNCap celler. Specielt har en betydelig stigning i docetaxel-resistens (ca. 15% for 22Rv1;. 16% for LNCaP), uafhængig af spredning påvirkninger, resulterede. Dette, for første gang, antyder, at exosomer kan være et middel til at kommunikere docetaxel-modstand mellem celler. For at bekræfte at den observerede påvirker af DU145RD-afledte exosomer er ikke begrænset til denne cellelinje variant, udførte vi en lignende undersøgelse med 22Rv1 og 22Rv1RD exosomer. I overensstemmelse med resultaterne fra vores indledende DU145RD exosomer analyser, observerede vi en lignende tendens tillægges docetaxel-modstand (

dvs.

en stigning på ca.. 11-12%) til både DU145 og LNCap cellerne i nærvær af 22Rv1RD exosomer.

MDR-1 /P-gp udtrykkes af både vores DU145RD og 22Rv1RD celler, men er ikke målbart i stamceller, implicerer det som er involveret i den erhvervede docetaxel-resistens (denne iagttagelse er noget at holde med den kliniske situation, hvor størstedelen af ​​prostatakræft er MDR-1 /P-gp-positive [26]). Vigtigere, fandt vi, at ekspressionsmønsteret i de tilsvarende exosomer afspejlede, at de celler, hvorfra de blev afledt, yderligere underbygger potentialet af resistens overførsel og vores forslag om, at MDR1 /P-gp potentielt kunne være -Mindst partly- involveret i nyligt erhvervet resistens tillagt ved de exosomer. Men forskellen i MDR-1 /P-gp niveauer mellem exosomer fra docetaxel-resistente varianter i forhold til deres forældre celler ikke nødvendigvis en kausal rolle for MDR1- /P-gp i lægemiddel-resistens observeret.

for yderligere at undersøge potentialet i exosomer i et klinisk miljø, som en pilotundersøgelse, vi isoleret exosomer fra docetaxel-naive patienter med prostatacancer og alder-matchede raske kontrolpersoner. Vi undersøgte påvirker af disse exosomer på cancercelleinvasion og proliferation. Den øgede proliferation og invasion af celler i nærvær af exosomer fra cancerpatienter foreslår en forårsagende rolle for disse exosomer. Selvom dette er en lille pilotundersøgelse, taget sammen med vores cellelinie-afledte exosomer undersøgelser, understøtter yderligere den hypotese, at exosomer kan have en rolle i prostatacancer celle kommunikation.

I forbindelse med docetaxel-resistens, vi efterfølgende undersøgt relevansen af ​​exosomer afledt af relevante patienter. Konkret denne pilotundersøgelse (n = 8 patienter) inkluderet matchet serum exosomer opnået før og under kurset docetaxel behandling. Her vurderede vi respons DU145 og 22Rv1 celler til deres IC

50 koncentrationer af docetaxel (som vist i tabel 1

dvs.

1,7 nM for DU145 celler; 4 nM for 22Rv1 celler) i nærvær af disse exosomer populationer. Den observerede docetaxel-resistens tildelt til begge cellelinier ved exosomer isoleret fra præ-cyklus 7 sera (n = 2 patienter) korreleret med patienternes stigning i PSA-niveauer. Exosomerne fra de resterende 6 patienter syntes at bibringe forøget følsomhed over for både DU145 og 22Rv1 celler, korrelerer med de patienter (n = 6) reducerede niveauer af PSA over deres behandlingsforløb.

En mulig forklaring på den måde, hvorved exosomer påvirker fænotypen af ​​”target” celler er, at de overfører mRNA’er, miRNA og /eller proteiner fra erhvervet resistens celler, der er kausale molekyler i at ændre den cellulære fænotype af de modtagende sekundære celler. Dette er i overensstemmelse med akkumulerende beviser for, at exosomer spiller en vigtig rolle i celle-til-celle kommunikation. For eksempel, i 2007 Valadi et al. viste, at mRNA transporteres via exosomer fra mastceller oversættes til protein på deres overførsel til at målrette celler [10]. Den vellykkede optagelse af exosomer fra sekundære celler blev også demonstreret ved Skog et al. [11], når fluorescens-mærkede glioblastom exosomer blev inkuberet med endotelceller. Mange flere nyere eksempler på disse observationer er blevet rapporteret og en nylig udtalelse fra Mittelbrunn og Sanchez-Madrid [27] yderligere beskriver, hvordan denne overførsel af genetisk information kan forekomme, med virkningerne af exosomer på sekundære celler potentielt bidrager til carcinogenese og tumorvækst; støbning tumormikromiljøet; fremme angiogenese; og modulering immunrespons [28], [29]. Specielt i forhold til modulerende reaktion på anti-cancer terapi, har HER2-overekspression exosomer fra donorceller vist sig at nedsætte følsomheden af ​​modtagende celler til Trastuzumab [30]. Så mens vi ikke kan spekulere om særlige molekyler, der kan gennemføres

via

exosomer fra vores resistente celler til at fremkalde fænotypiske ændringer i target-celler (andre end at antyde, at overførslen af ​​MDR-1 /P-gp protein kan til dels være en medvirkende faktor), er det rimeligt at antage, at det kan være et enkelt -eller kombination of- mRNA’er, miRNA og /eller proteiner, som har en kausal rolle i docetaxel-resistens. Således nu at funktionel relevans har været forbundet med disse exosomer i giver et niveau af docetaxel-modstand, profilering af indholdet af disse exosomer er berettiget til bedre at forstå den præcise molekyle (r) og mekanismen (er) involveret.

som konklusion denne undersøgelse bekræfter, at docetaxel-resistens i prostatacancer er yderst-kompleks og kan være forbundet med varieret cellulær påvirker i form af resistens over for andre kemoterapeutiske lægemidler, motilitet, invasion og forankringsuafhængig vækst. Det er imidlertid klart, at i betragtning af mange aspekter af docetaxel-modstand, der ikke én, men flere faktorer vil sandsynligvis mægle deres virkninger i prostatakræft. Her viser vi, for første gang, at cellulær kommunikation

via

exosomer kan delvis resultere i tillagt docetaxel-resistens til sekundære celler. Fremtidige undersøgelser af større grupper af serumprøver, fra både docetaxel-naive patienter og også fra patienter efter docetaxel behandling, er berettiget -assessing både påvirker af og de molekylære indhold exosomes- at udvide vores forståelse af exosomer og deres relevans for celle kommunikation og docetaxel-resistens i prostatakræft

Materialer og metoder

cellelinjer og Cell Culture

prostatakræft cellelinjer, 22Rv1 (ATCC CRL-2505;. androgen-følsomme ; fra en primær human tumor), DU145 (ATCC HTB-81; androgen-ufølsom, fra en hjerne metastase) og LNCaP (ATCC CRL-1740; androgen-sensitive, fra lymfeknudemetastaser) blev erhvervet fra American Type Culture Collection ( ATCC). 22Rv1 og DU145-celler blev holdt i RPMI-medium (Sigma-Aldrich) tilsat 10% føtalt bovint serum (PAA), 1% L-glutamin (Sigma-Aldrich) og ved 37 ° C /5% CO

2. LNCaP-celler blev opretholdt i avanceret RPMI (Biosciences) suppleret med 10% føtalt bovint serum (PAA), 1% L-glutamin (Sigma-Aldrich) og 1% HEPES (Sigma-Aldrich) og ved 37 ° C /5% CO

2.