PLoS ONE: Epigenetik Underbygning forordningen af ​​CXC (ELR +) Chemokiner i ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Baggrund

Angiogenese kan spille en rolle i patogenesen af ​​ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Den CXC (ELR

+) chemokin familie er stærke fortalere for den angiogene respons.

Metoder

udtryk for CXC (ELR

+) familiemedlemmer (

CXCL1-3 /GROa-γ

,

CXCL8 /IL-8

,

CXCR1 /2

) blev undersøgt i en serie af resektion friske frosne NSCLC tumorer. Derudover blev udtryk og epigenetisk regulering af disse kemokiner undersøgt i normal bronchieepithelceller og NSCLC cellelinjer.

Resultater

Alt i alt udtryk for de chemokin ligander (

CXCL1, 2

,

8

) og deres receptorer (

CXCR1 /2

) blev nedreguleret i tumorprøver forhold til den normale, med undtagelse af

CXCL3

.

CXCL8

CXCR1 /2

viste sig at være epigenetisk reguleret af histon post-translationelle modifikationer. Rekombinant CXCL8 ikke stimulere cellevækst i enten en normal bronchial epitel eller en pladecarcinom cellelinje (SKMES-1). Imidlertid blev en stigning observeret ved 72 timer efter behandling i et adenocarcinom cellelinje.

Konklusioner

CXC (ELR

+) kemokiner er dysreguleret i NSCLC. Balancen mellem disse kemokiner kan være kritisk i tumormikromiljøet og kræver yderligere belysning. Det er stadig uvist, om epigenetisk målretning af disse veje er en levedygtig behandlingsmulighed i lungekræft behandling

Henvisning:. Baird AM, Gray SG, O’Byrne KJ (2011) Epigenetik Underbygning forordningen af ​​CXC ( ELR

+) Chemokiner i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 6 (1): e14593. doi: 10,1371 /journal.pone.0014593

Redaktør: Kelvin Yuen Kwong Chan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: Juni 14, 2010; Accepteret: 2 januar 2011; Udgivet: 27 Januar 2011

Copyright: © 2011 Baird et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en ubegrænset pædagogisk bevilling fra Pfizer. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Midler til dette projekt var at give af Pfizer i form af en løn for Anne- Marie Baird. Ingen midler blev fastsatte forbrugsvarer. Finansieringen forudsat var et tilskud-i-hjælp, og som sådan, ændrer den ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Angiogenese er vigtigt i vækst og spredning af kræft og påvirker også inflammatoriske ændringer, som kan prædisponere for denne sygdom [1]. CXC (ELR

+) chemokiner inducerer angiogenese og kan være vigtigt i cancere, som har en angiogen fænotype såsom NSCLC [2].

Udtrykket kemokin henviser til en familie af lav molekylvægt (8- 10 kDa) kemotaktiske cytokiner. Kemokiner er små inducerbare cytokiner, som er kemo-tiltrækningsmidler for leukocytter. Kemokiner er klassificeret efter deres aminosyresammensætning, funktionel aktivitet og receptor bindende egenskaber og består af fire sub familier defineret i henhold til de to første af fire konserverede cysteinrester (a) C, (b) CC, (c) CXC og (d) CXXXC [3]. CXC kemokin-familien består af to undertyper, ELR

+ og ELR

– ifølge en særlig Glu-Leu-Arg (ELR) motiv forud for den første cysteinrest [3]. CXC (ELR

+) initiativtagere indeholder en formodet

cis

element, der genkender NF-KB, og derfor kan forårsage trans-aktivering af CXC chemokiner [4].

angiogene receptor for CXCL8 og den anden CXC (ELR

+) kemokiner er CXCR2 [5]. Blokade af denne receptor fører til et fald i angiogenese i pancreascancer [6], og en signifikant inhibering af human melanom tumorvækst og eksperimentelle lungemetastaser i CXCR2 – /- mus, såvel som en reduktion i angiogenese [7]. Inden indstilling af lungen, kræft vækst og metastatisk potentiale er nedreguleret i flere mus CXCR2 – /- modeller [7], [8]. Imidlertid kan CXCL8 binde til CXCR1 og CXCL1 /CXCL8 kan også binde DARC, selv om binding til DARC ikke transducerer et signal. I øjeblikket undersøgelser med DARC antyder, at det virker ved ‘mopping’ Up kemokiner og dermed reducere deres signalering kapacitet. Over-ekspression af DARC fører til øget tumorvækst, men dette skyldtes induktionen af ​​store nekrotiske områder i tumoren [9], [10].

Kemokinreceptorer er opreguleret på tumorceller, tillade tumoren at drage fordel af chemokin rige miljøer, fremme tumorvækst og vaskulaturen. Desuden kan kemokiner rekruttere makrofager, som detekterer den hypoxiske miljø i tumoren og efterfølgende udskiller pro-angiogene faktorer [11], [12]. Oprindeligt kemokiner var tænkt til kun at spille en rolle i at tiltrække bestemte leukocytter til et websted af skade; ikke desto mindre har det nu vist sig, at de er involveret i den neoplastiske transformation af en celle, fremme af angiogenese, tumor klonal ekspansion og ændringer i ECM, særlig middelbare organspecifikke metastaser ved cancer [13]. Specifikke ligand receptor-par diktere metastaserne mønstre af bryst- og lungecancer [14]. I brystkræft metastaser til lungerne, CXCL1 var en del af et gen, signatur, også inkluderet VCAM1 og MMP1 [15]. En nylig undersøgelse viste, at tumor afledt CXCL8 fungerede som et tiltrækkende for cirkulerende tumorceller for at vende tilbage til den oprindelige tumor, der fører til en mere aggressiv tumor fænotype [16].

En række CXC chemokiner er blevet påvist i neoplastisk væv som produkter af tumorceller eller stromale elementer [12]. For eksempel, tumorinfiltrerende inflammatoriske celler hæver CXCL8 niveauer i bronchioalveolar celler, sammen med sine to receptorer [17]. Stærke beviser antyder, at CXC (ELR

+) chemokiner har en rolle i cancer kampagne, da de kan fremme vækst og overlevelse af cancerceller [18].

vækst og progression af cancer er afhængig af angiogenese og CXCL8 har vist sig at spille en rolle ved den angiogene og tumorfremkaldende egenskaber. I renal celle kræft niveauerne af CXCL1, CXCL3 og CXCL8 var forhøjet sammenlignet med kontroller og receptor negativ (CXCR2 – /-) mus var der en tilsvarende reduktion i tumorvækst [19]. Undersøgelser med melanom tumor modeller understøtter rolle CXCL1, CXCL2, og CXCL3 i mediere tumor angiogenese og niveauer af alle tre kemokiner er stærkt udtrykt i melanom tumorer. Transfektion af CXCL1-3 til immortaliserede ikke-tumorigene celler gav dem evnen til at danne tumorer [20], [21]. CXCL8 er en af ​​de mest undersøgte medlemmer af CXC (ELR

+) familie, især i lungekræft. CXCL8 blev identificeret i en genekspression signatur, var prsedikativ af dårlig prognose hos patienter med stadium I lungekræft [22], mens niveauet af CXCL8 er steget betydeligt i både maligne pleuraekssudat [23] og NSCLC [24], hvor niveauerne stiger med trin [25] og korrelerer med patientens overlevelse /tilbagefald [26]

Chemokiner inden tumormikromiljøet menes at spille mindst fem roller i udviklingen af ​​tumorer og metastatisk sygdom.; (A) kontrol leukocyt infiltrat, (b) modificere tumor immunrespons, (c) regulere angiogenese, (d) fungere som vækst og overlevelse faktorer, og (e) lede bevægelsen af ​​tumorceller selv [27]. CXC (ELR

+) ligander og receptorer er særligt vigtige ved mediering NSCLC tumorassocieret angiogenese [28] og orgel specifikke metastaser [13], [14]. CXCR2-ligander har også været impliceret i NSCLC tumor progression gennem sneglen, høje niveauer af, som korrelerer med nedsat overlevelse [29].

Aberrant epigenetisk regulering af genekspression er en hyppig begivenhed i NSCLC [30], [31] . Målretning disse epigenetiske reguleringsmekanismer i NSCLC er et aktivt område af lægemiddelforskningen. Vi søgte at undersøge ekspressionen af ​​CXC (ELR

+) chemokiner og deres receptorer i en serie af primær NSCLC tumorprøver og i en yderligere panel af NSCLC cellelinier og til direkte at undersøge, om epigenetik spiller en rolle i reguleringen af disse gener i denne sygdom. Vores resultater viser, at ekspressionen af ​​disse chemokiner og deres receptorer ofte dereguleret i NSCLC, der reguleres via direkte og i direkte af epigenetiske mekanismer (histon posttranslationelle modifikationer og DNA CpG methylering henholdsvis) og kan være god kandidat mål for epigenetisk terapi i behandlingen af ​​denne kræftform.

Metoder

Cellelinjer

A549 (adenocarcinom), SKMES-1 (planocellulært karcinom), H460, H647 og H1299 (store cellecarcinom) og BEAS-2B (transformerede normale bronchoepithelial) cellelinier blev indkøbt fra ATCC (LGC Promochem, Teddington, UK). HBEC cellelinjer [32] var en gave fra Prof. John D Minna (Hamon Center for Therapeutic Oncology Research, UTSoutwestern, Dallas, TX, USA). Alle cellekulturreagenser blev købt hos Lonza (Walkersville, MD, USA). Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 i følgende medier; A549 – F-12 (Ham) medium suppleret med 10% (vol /vol) FBS, penicillin streptomycin (500 U /ml) og 2 mM L-glutamin. BEAS-2B blev også opretholdt i F-12 (Ham) medium uden tilsætning af FBS. SKMES-1 – EMEM med tilsætning af 10% (v /v) FBS, penicillin streptomycin (500 U /ml), 2 mM L-glutamin og 0,1 M ikke-essentielle aminosyrer. Alle store celle carcinom linjer blev holdt i RPMI med 10% FBS og penicillin streptomycin (500 U /ml). HBEC linjer blev holdt i keratinocyt serumfrit medium (SFM), med L-glutamin (GIBCO Invitrogen, Paisley, Skotland) og suppleret med 2,5 ug human rekombinant epidermal vækstfaktor (rEGF), og 25 ug bovin hypofyse (GIBCO Invitrogen) .

Primær tumor prøver

En serie af 37 tumor prøver (14 adenokarcinom og 23 pladecellekræft) blev taget fra patienter med tidlig fase NSCLC på St. James Hospital, Dublin. Matchet normalt væv blev taget parallelt for hver patient, og prøver blev evalueret af en patolog umiddelbart efter dissektion.

Reagenser

Trichostatin A (TSA) blev indkøbt fra Calbiochem (San Diego, CA, USA ) og opløst i DMSO til en koncentration på 250 mg /ml. Cellekulturerne blev behandlet i en periode på 16 timer, ved en slutkoncentration på 250 ng /mL.

Phenylbutyrat (PB) (tributyrat ™) var en gave fra Triple Crown America, Perkasie, PA, USA. Cellekulturer blev behandlet ved en slutkoncentration på 10 mM i 16 timer.

5-Aza-2′-deoxycytidin (DAC) blev indkøbt fra Merck (Darmstadt, Tyskland) og opløst i methanol. Cellekulturer blev behandlet med DAC (slutkoncentration – 1 uM). I 48 timer med DAC og medier erstattes hver 24 timer

Rekombinant humant CXCL8 blev indkøbt fra PromoKine (Promocell GmbH, Heidelberg, Tyskland) og rekonstitueret i sterilt destilleret vand.

SB 225002 blev indkøbt fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA) og opløst i DMSO til en koncentration på 2,2 uM. Cellelinier blev behandlet i en time før tilsætningen af ​​CXCL8, ved en koncentration på 0,022 uM.

Total RNA-isolering og RT-PCR-amplifikation

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRI reagent® ( Molecular Research center, Montgomery Road, OH, USA) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Forud for første streng cDNA-syntese, 10 ug totalt RNA blev forbehandlet ved fordøjelse med RQ1 DNase (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens anvisninger. cDNA blev frembragt under anvendelse Superscript III (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) og oligo dT (20) primere (Eurofins MWG operon Ebersberg, Tyskland) ifølge producentens instruktioner.

cellelinier blev undersøgt for ekspressionen af ​​

CXCL1-3

,

CXCL8

,

CXCR1 /2

og

Beta-actin

ved RT-PCR under anvendelse af primere og udglødningstemperaturer skitseret i tabel 1. PCR cyklusbetingelser bestod af -95 ° C i 5 minutter efterfulgt af 35 cykler af 1 min ved 94 ° C, 1 min ved målgenet annealingstemperatur og 1 min ved 72 ° C med en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 minutter.

Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og produkter elektroforeret på en 1% agarosegel. Produktkvantificering blev udført under anvendelse TINA 2.09c (Raytest, Isotopenmeßgeräte GmbH, Straubenhardt, Tyskland) densitometri software. MRNA-ekspression blev normaliseret til

Beta-actin

kontrol, og blev udtrykt som et forhold mellem mål mRNA udtryk:.

Beta-actin

udtryk

chromatin immunoprecipitation (X- chip)

chromatin immunfældning blev udført som følger: Efter behandlinger blev celler fikseret med formaldehyd (slutkoncentration 1%), suspenderet i SDS lysis buffer (Millipore, Billerica, MA, USA) og sonikeret, indtil DNA var fragmenteret i længder på mellem 200-1000 bp. Portioner af denne klippede DNA blev efterfølgende immunpræcipiteret under anvendelse af OneDay chip Kit ™ (Diagenode, Liege, Belgien) ifølge producentens instruktioner. Antistofferne anvendt til immunpræcipitering var som følger: pan acetyl-histon H3 (Millipore Cat # 06-599), pan acetyl histon H4 (Millipore Cat # 06-598), acetyl-histon H3 (K9 /14ac) (Diagenode Cat # pAb -ACHBHS-044), acetyl-histon H3 (K9ac) (Diagenode Cat # pAb-ACHAHS-044), acetyl phospho – histon H3 (K9pS10) (Sigma Cat # H0788), di methyl-histon H3 (K9Me2) (Sigma Cat # D5567), di methyl histon H3 (K4Me2) (Sigma Cat # D5692) og methyl-histon H3 (K4Me) (Sigma Cat # M4819). Et nej antistof kontrol blev inkluderet til kontrol for ikke specifik binding.

Primere anvendt til at studere promotorområder af

CXCL8

CXCR1 /2

af Chip blev designet fra kendt 5’UTR’er indeholdt i deres nucleotidsekvenser. RT-PCR cyklusbetingelser var de samme som de ovenfor omhandlede. Primere og annealeringstemperaturer til chip er præsenteret i tabel 2.

ELISA

Koncentrationen af ​​CXCL8 blev målt i konditioneret medier ved hjælp af en DuoSet® ELISA Development Systems (R substratopløsningen anvendte blev lavet i phosphatcitratpuffer (indeholdende citronsyre og dinatriumhydrogenorthophosphat dodecahydrat, pH 5,0), 10 mg 1, 2-phenylendiamin (OPD) og 18 pi 1 MH

2O

2 .

CXCL2 blev kvantificeret under anvendelse af et ELISA development kit indkøbt fra Strathmann Biotec (Hamborg, Tyskland) ifølge producentens instruktioner.

cellulær proliferation assays

celleproliferation blev målt ved anvendelse en Cell Proliferation ELISA, BrdU (Roche Diagnostics Ltd., Sussex, UK). Kort fortalt blev cellerne podet ved 5 x 10

3 /brønd i en 96-brønds plade og klæbet natten over. Efterfølgende den komplette medium blev fjernet, og cellerne vaskes med 100 pi PBS. Serum depleteret medier (0,5% FBS) blev tilsat til lungekræft kun celler, da dette efterligner nøjere fysiologiske betingelser. Efter inkubation natten over blev cellerne behandlet i 24, 48 eller 72 timer med humant rekombinant CXCL8 i forskellige koncentrationer (0,1-100 ng /ml). Inhiberingsundersøgelser blev udført ved at forbehandle celler med 0,022 pM SB225002 i 1 time før tilsætning af CXCL8. Absorbans blev målt på en pladelæser ved 450 nm med en referencebølgelængde indstillet til 690 nm og datoer og ubehandlede brønde blev anvendt til normalisering formål. De ubehandlede celler blev sat til 100%, og de CXCL8 behandlinger vurderes i forhold til dette.

Statistisk analyse

Dataene er udtrykt som gennemsnit ± SEM (standard error af middelværdien). Statistisk analyse blev udført med InStat (Graphpad software, La Jolla, CA, USA) under anvendelse af en parret ensidet Students

t

-test. Forskelle blev betragtet som signifikante, når p 0,05

Resultater

Angivelse af

CXCL1-3

,

CXCL8

CXCR1 /2

i primær lungekræft tumor prøver

for at vurdere udtryk for en række CXC (ELR

+) familiemedlemmer i et panel af normale /tumor matchede patientprøver fra fase i og II-patienter, RT PCR blev udført (figur 1A), og opsummeret i figur 1B. Densitometrisk analyse af RT-PCR viste et signifikant fald i ekspressionen af ​​

CXCL1

,

CXCL2

(p 0,01) og

CXCR1

receptor (p 0,05) i NSCLC tumorprøver forhold til den normale (figur 1C)

A) Niveauer af

CXCL1

-.

3 fotos,

CXCL8

CXCR1 /2

blev undersøgt ved RT-PCR på et panel af NSCLC linjer (adenocarcinom (n = 14), pladecellecarcinom (n = 23)) patientprøver. Repræsentative billeder af op og ned regulerede prøver er vist.

Beta actin

niveauer blev brugt til normalisering formål. B) En oversigt over de ændringer i ekspressionen af ​​de forskellige CXC (ELR

+) kemokiner og deres receptorer i et panel af tumor /normal matchede patient NSCLC prøver. C) Samlet densitometri analyser af tumor /normal matchede patient NSCLC prøver. Data tegnes som middelværdier ± standardfejl på middelværdi (n = 37). (N – Normal, T – Tumor)

Angivelse af

CXCL1-3

,

CXCL8

CXCR1 /2

i en. panel af normale og lungekræft cellelinier

Ved hjælp af RT-PCR, blev kemokinerne undersøgt i et panel af normale og NSCLC cellelinier (figur 2). Alle testede cellelinier udtrykte varierende niveauer af

CXCL1-3

CXCL8

, med højere basal udtryk observeret i NSCLC linjerne. Men robust ekspression af begge receptorer (

CXCR1 /2

) blev påvist i de normale cellelinier (HBEC3-5).

Panelet omfattede A549 (adenocarcinom), SKMES-1 (skællede cellecarcinom), H460, H647 og H1299 (storcellet carcinom), BEAS-2B (SV40 transformeret normal bronchoepithelial) og HBEC cellelinier (normale bronchieepithelceller cellelinjer udødeliggjort i fravær af virale oncoproteiner).

Beta actin

er inkluderet for at validere lastning effektivitet. (M – DNA størrelse markør, ve – Negativ RT-PCR-kontrol).

histonacetylering er involveret i reguleringen af ​​

CXCL8

CXCR1 /2

udtryk

Brug histondeacetylaseinhibitoren (HDACi), Trichostatin A (TSA), en induktion af

CXCL8

CXCR1 /2

i både den normale (HBEC4) og lungekræft cellelinier (A549 og SKMES-1), med et samtidigt fald i

CXCL1-3

(SKMES-1, s 0,05) blev observeret (figur 3A). Induktion af

CXCL8

var signifikant i HBEC4 og SKMES-1 (p 0,05), som var stigningen i

CXCR1

CXCR2

i både lungekræft celle linjer (A549 – p 0,05, SKMES-1 – p 0,01) og

CXCR1

i HBEC4 (p 0,05) (figur 3B). Reaktivering af ekspressionen af ​​disse receptorer i NSCLC cellelinier antyder, at disse gener epigenetisk reguleres på samme niveau som histonacetylering. Behandling af cellelinier med en ekstra histondeacetylaseinhibitoren, phenylbutyrat (PB), resulterede også i en reaktivering af

CXCR1 /2

(data ikke vist), hvilket indikerer, at resultaterne er HDACi specifikke. To kemokiner blev udvalgt, CXCL2 og CXCL8, til bestemmelse af protein-ekspression ved ELISA. Den observerede mønster afspejlede, at set på mRNA-niveauet i SKMES-1, med et fald i CXCL2 og en stigning i CXCL8 med TSA behandling (p 0,05) (figur 3C). Der var imidlertid ingen signifikant ændring i proteinniveauer i enten A549 eller HBEC4 mellem basale og TSA-behandlede celler (data ikke vist).

A) Virkningen af ​​TSA behandling (250 ng /mL i 16 timer) på udtryk for

CXCL1

–

3 fotos,

CXCL8

CXCR1 /2

. B) Densitometri analyse af udtryk i behandlede versus ubehandlede prøver når normaliseret til

beta actin

. Data tegnes som middelværdier ± standardfejl på middelværdi (n = 3). C) Behandling med TSA også påvirker produktionen af ​​CXCL2 og CXCL8 på proteinniveau i SKMES-1 celler. Chemokiner blev kvantificeret i konditionerede medier fjernet fra kulturen efter eksponering for TSA (250 ng /mL i 16 timer). Data tegnes som middelværdier ± standardfejl på middelværdi (n = 3). (UT – ubehandlet, TSA – Trichostatin A).

Regulering af

CXCL8

CXCR1 /2

sker gennem direkte kromatin remodeling

for at bekræfte, at de observerede effekter for HDACi skyldtes øget histon hyperacetylering på initiativtagerne til

CXCL8

CXCR1 /2

gener, vi udført kromatin immunofældning (chip) analyse af den enkelte initiativtagere fra A549 celler behandlet med TSA. Som det kan ses i figur 4, behandling med TSA resulterer i en stigning i mængden af ​​PCR-produkt efter

CXCL8

CXCR1 /2

indikerer forøget histon hyperacetylering omkring promotorerne for disse gener. Vi viser, at lysin 9 og lysin 14 hyperacetylated i denne region efter behandling med TSA. Dette eksperiment viser klart, at kromatin remodeling er direkte involveret med aktiveringen af ​​

CXCL8

(figur 4A),

CXCR1

(figur 4B) og

CXCR2

(figur 4C) gen udtryk. Derudover har vi også observeret en stigning i histon H3 lysin 4 tri-methylering (H3K4me3) på

CXCR1-

promoter (data ikke vist) og phosphorylering af serin 10 (H3K9pS10) på

CXCL8

promotoren. En stigning i H3K4 diemethylation (H3K4Me2) blev påvist med en samtidig reduktion i H3K9 dimethylering (H3K9Me2) ved promotorregionen. Disse ændringer har været forbundet med aktivering af transskription og tidlig respons gener henholdsvis og føje yderligere styrke til dokumentation for, at disse gener dynamisk reguleres af histon POS-translationelle modifikationer.

Chippen analysen viser, at TSA behandling resulterer i en stigning i acetyleringen af ​​histon H3 og H4. A549-celler blev dyrket i nærvær eller fravær af TSA (250 ng /ml) i et tidsrum på 16 timer. Efterfølgende blev en chip assay udført under anvendelse af de følgende antistoffer; pan acetyleret histon H3 (Ac H3) og H4 (Ac H4), histon H3 acetyleret på lysin 9 og 14 (H3K9 /K14Ac), histon H3 acetyleret på lysin 9 (H3K9Ac), histon H3 acetyleret på lysin 9 og phosphoryleret i serin 10 (H3K9pS10), histon H3 dimetylation markør på lysin 9 (H3K9Me2), dimetylation markør på lysin 4 (H3K4Me2) og methylering markør på lysin 4 (H3K4Me). Kromatin status ved promotorregionen af ​​(A)

CXCL8

, (B)

CXCR1

og (C)

CXCR2

vises. Input DNA tjener som en positiv kontrol anbefalet af producenten (Diagenode). Et nej antistof kontrol blev inkluderet til kontrol for ikke specifik transport af DNA med histoner. (M – DNA størrelse stige)

Methylering er ikke direkte involveret i reguleringen af ​​CXC (ELR

+) familie

Efter behandling af celler med en DNA-methyltransferase. inhibitor (DAC), blev virkningerne på CXC (ELR +) familie ekspression undersøgt under anvendelse af RT-PCR (figur 5). En væsentlig reduktion af

CXCL3

(p 0,01) blev observeret i HBEC4 cellelinien og ikke i nogen NSCLC cellelinjer (figur 5B).

CXCL8

ekspression blev signifikant induceret i to af de tre cellelinier (HBEC4 /SKMES-1 – p 0,05, figur 5B). De to receptorer

CXCR1

CXCR2

signifikant induceret af DAC i HBEC4 (p 0,01) (Figur 5A, B). DAC demonstreret evne til at genaktivere

CXCR1

men ikke

CXCR2

udtryk i SKMES-1 (p 0,01) (Figur 5A, B). DAC kunne fremkalde

CXCR2

men ikke

CXCR1

i A549 (p 0,05) (Figur 5A, B). Mens disse data tyder på, at DNA CpG methylering er involveret i reguleringen af ​​ekspressionen af ​​de CXC-receptorer og CXCL8, en søgning af UCSC genom-biblioteket (https://genome.ucsc.edu/) viste en sparsom antal CpG rester på promotorregionerne af disse tre gener. Derfor mener vi en ændring i ekspressionsniveauerne af denne familie måske på grund af en sekundær effekt forårsaget af DAC behandling, såsom opregulering af specifikke transkriptionsfaktorer.

A) Virkningen af ​​5-aza 2′-deoxycytidin (DAC) behandling på ekspressionen af ​​

CXCL1

–

3 fotos,

CXCL8

CXCR1 /2

. Celler blev dyrket i 1 pM DAC i 48 timer med medier og lægemiddel erstattet hver 24 timer. Expression ændringer blev målt ved hjælp af RT-PCR med beta-Actin anvendt som intern kontrol for kvantificering formål. B) Densitometri analyse af udtryk i behandlede versus ubehandlede prøver når normaliseret til

beta actin

. Data afbildet som gennemsnit ± standardfejl på middelværdien. (N = 3). (DAC – 5-aza-2’deoxycitidine)

Cellulær proliferation af SKMES-1 er faldet i tilstedeværelse af rekombinant CXCL8, mens øget i A549

Ved behandling med forskellige. koncentrationer af rekombinant CXCL8 (0,1-100 ng /ml) i et tidsrum på 24-72 timer, var der en tendens til et fald i proliferation i HBEC cellelinje i forhold til ubehandlet kontrol (data ikke vist). CXCL8 behandling (100 ng /ml og 10 ng /ml) forårsagede en stigning i proliferation i A549-cellelinien (p 0,01-100 ng /ml, p 0,05-10 ng /ml) ved 72 timer efter kun behandling (figur 6A). Men der var et signifikant fald i proliferation 24 timer efter behandling i SKMES-1 (figur 6B) ved alle testede koncentrationer (p 0,01, 100 ng /ml og 10 ng /ml; p 0,05 1 ng /ml og 10 ng /ml), men ikke på noget andet tidspunkt (data ikke vist). For at bestemme om den proliferative virkning i begge disse cellelinjer var på grund af specifik CXCL8 behandling blev en CXCR2 neutraliserende tilgang foretaget. Cellelinier blev behandlet med SB 225002 ved en tidligere offentliggjort IC

50 værdi på 22 nM [33] i en time før tilsætningen af ​​CXCL8 ved 100 ng /ml i 72 timer (A549) og 24 timer (SKMES-1 ) (figur 6C). Blokade af CXCR2 receptoren negeret den proliferative effekt i både A549 og SKMES-1 cellelinjer sammenlignet med CXCL8 behandling alene.

A) Cell proliferation blev undersøgt ved BrdU assay efter 24-72 h behandling med CXCL8 i A549 ( 72 timer efter behandling) og SKMES-1 (24 timer efter behandling) cellelinier. Kun tidspunkter med betydelige data vises. Data er repræsenteret som en procentdel af den ubehandlede kontrol (UT), som blev sat til 100%, og udtrykkes som middel ± SEM. (N = 3) (ε p 0,01 – CXCL8 behandling

vs

UT, ψ p. . 0.05 – CXCL8 behandling

vs

UT) B) cellelinjer blev behandlet med en selektiv CXCR2 antagonist (0.022μM) i 1 time før tilsætning af CXCL8 og dyrkes i en periode på 24 (SKMES-1) eller 72 timer (A549). Data er repræsenteret som en procentdel af den ubehandlede kontrol (UT), som blev sat til 100%, og udtrykkes som middel ± SEM. (N = 3).

Diskussion

CXC (ELR

+) chemokin familie, en potent pro-angiogene familie, viste sig at blive reguleret epigenetisk i både NSCLC og normale bronchieepithelceller cellelinjer på niveau med både histon post-translationelle modifikationer.

i et panel af normale /tumor matchede prøver, de kemokiner og receptorer vises ingen ændrede udtryk mønster mellem adenocarcinom og pladecellekræft prøver, med undtagelse af

CXCL3

(gennemsnit forhøjet i pladecellecarcinom og reduceret i adenocarcinom). Højere niveauer af CXCL8 have opdaget IHC i lungekræft vævsprøver sammenlignet med normal [34], og i vores prøver niveauer af

CXCL8

mRNA var forhøjet i 37,8% (14/37) prøver. Skønt de samlede gennemsnitlige densitometridata værdier (adenokarcinom n = 14 og pladecellecarcinom n = 23) indikerer en reduktion af kemokiner i tumorprøverne (figur 1C), var dette ikke tilfældet for hver enkelt prøve (figur 1 A). På grund af den heterogenicity af prøverne, er det vanskeligt at foretage en endelig konklusion baseret på disse resultater. Det skal dog bemærkes, at ekspression af mange af kemokiner blev oftest findes at være nedreguleret i NSCLC-tumorer som følger

CXCL1

(64,9%, p 0,01),

CXCL2

( 81,1%, p 0,01),

CXCL3

(59,5%) (figur 1B). Desuden niveauer af

CXCR1

viste sig også at blive reduceret betydeligt i NSCLC tumorer (35,2%, p 0,05).

I et panel af NSCLC cellelinjer behandlet med HDACi der var en fald i

CXCL1-3

med en samtidig stigning i

CXCL8

receptorerne

CXCR1

2 Hotel (figur 3B). TSA har tidligere vist sig at opregulere CXCL8 i lungen [35] og brystcancercellelinier [36]. Reaktivering af disse receptorer i lungen cancercellelinier ville indikere, at de er under epigenetisk regulering på niveauet for histon modifikation. Den generelle dogme forbundet med HDACi er, at de fungerer til at inducere genekspression. Men i denne undersøgelse, TSA forårsagede både en op- og ned- regulering af kemokiner, en effekt set af andre i andre studier. For eksempel er HDACi blevet vist at nedregulere Wilms tumor gen 1 (WT1) [37] og EGFR [38]. Begrænset tilgængelighed af specifikke transkriptionsfaktorer kan resultere i kun et vist antal op-regulerede gener. Som sådan aktiveringen af ​​

CXCL8

kan føre til nedregulering til

CXCL1-3

, enten via en molekylær kontakt eller gennem titrering af transkriptionsfaktorer væk fra promotorområder af disse gener. CHIP resultater viser, at TSA virker ved direkte remodeling promotorregionen af ​​

CXCL8

og

CXCR1 /2

gener (figur 4). Vores chip resultater viser, at histoner H3 og H4 blive hyperacetylated ved disse genpromotorer, der involverer lysiner 9 og 14 i histon H3 og lysiner 5, 8, 12 og 16 i histon H4. Vi observerer en kraftig stigning i niveauet af histon H3 lysin 4 dimethylering (H3K4me2) efter aktivering af transskription via HDACi, og også observere et tab af histon lysin 4 monomethylation (H3K4me), efter aktivering af CXCL8 /CXCR1 /CXCR2. Efter aftale med den aktuelle litteratur, vi observerer tilstedeværelsen af ​​en undertrykkende mærke H3K9Me2 på BGB promotor før aktivering via HDACi, og niveauer af denne histon modifikation fald efter aktivering [39], [40]. Disse resultater kontrollere, at HDACi forårsager forårsager kromatin remodeling via histon post-translationelle modifikationer rundt promotorområdet af generne undersøgte angiver, at det er aktivt element i reguleringen af ​​disse kemokiner og deres receptorer.

DNA CpG methylering er også en hovedkomponent i epigenetisk regulering af genekspression. Hypermethyleret DNA findes ofte i promotorregionerne af tumorsuppressorgener i cancere, især i lungekræft [30]. Behandlinger med DNMTi DAC genaktiveret ekspressionen af ​​

CXCR1

i A549 (figur 5B) cellelinie og

CXCR2

i SKMES-1 (figur 5B).