PLoS ONE: Ansøgning af Hierarkisk Gruppering til Analyse af Protein Mønstre i Human Cancer-associerede Liver

Abstrakt

Baggrund

Der er to måder at statistiske metoder kan lære af biomedicinske data. En måde er at lære klassifikatorer at identificere sygdomme og til at forudsige resultater ved hjælp af uddannelse datasæt med fastslået diagnose for hver prøve. Når uddannelsen datasættet ikke er tilgængelig opgaven kan være at minen for tilstedeværelse af meningsfulde grupper (klynger) af prøver og til at udforske underliggende datastruktur (uden opsyn læring).

Resultater

Vi undersøgte proteomiske profiler af den cytosoliske fraktion af humane leverprøver ved hjælp todimensional elektroforese (2DE). Prøverne blev resektion efter kirurgisk behandling af levermetastaser i kolorektal cancer. Uovervåget hierarkisk gruppering af 2DE gel billeder (n = 18) viste et par klynger, der indeholder 11 og 7 prøver. Tidligere anvendte vi de samme prøver for at måle biokemiske profiler baseret på cytochrom P450-afhængige enzymatiske aktiviteter og fandt også, at der er tydeligt blev delt i to godt adskilte grupper ved klynge-analyse. Det viste sig, at grupper efter enzymaktivitet næsten passer perfekt til de grupper, identificeret fra proteomiske data. Af de 271 reproducerbare pletter på vores 2DE geler, valgte vi 15 til at skelne de menneskelige lever cytosoliske klynger. Brug MALDI-TOF peptid masse fingeraftryk, vi identificeret 12 proteiner for de valgte spots, herunder kendte cancer-associerede arter.

Konklusioner /Betydning

Vores resultater understreger vigtigheden af ​​hierarkiske klyngeanalyse af proteomisk data, og viste overensstemmelse mellem resultaterne af biokemiske og proteom tilgange. Gruppering af de humane lever prøver og /eller patienter i forskellige klynger kan give indsigt i mulige molekylære mekanisme af lægemiddelmetabolisme og skaber et rationale for personlig behandling

Henvisning:. Petushkova NA, Pyatnitskiy MA, Rudenko VA, Larina OV , Trifonova OP, Kisrieva JS, et al. (2014) Anvendelse af Hierarkisk Clustering til Analyse af Protein Opskrifter i Human Cancer-associerede Lever. PLoS ONE 9 (8): e103950. doi: 10,1371 /journal.pone.0103950

Redaktør: Silvia Mazzuca, Università della Calabria, Italien

Modtaget: Februar 26, 2014 Accepteret: 4 jul 2014; Udgivet: 1. august, 2014

Copyright: © 2014 Petushkova et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af Ministeriet for Undervisning og Videnskab i den Russiske Føderation, State kontrakt nr 16.522.12.2002. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. To forfattere også ansat af en kommerciel virksomhed Postgen Tech LLC, men de ikke gjorde modtage betaling eller tjenester fra selskabet for ethvert aspekt af det indsendte arbejde (herunder men ikke begrænset til tilskud, overvågningsdata board, studie design, manuskript forberedelse, statistisk analyse, etc.). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

levermetastaser normalt gradvist skade leverfunktion og er yderst ondartet og refraktær over for konventionel behandling [1] . Forståelse af de molekylære og biologiske mekanismer i kolorektal cancer kan give mulighed for udvikling af yderligere terapeutiske strategier designet til at forebygge og behandle levermetastaser [2], [3]. Endvidere kan molekylære terapier forlænge tiden til leveren tilbagefald efter kurativ resektion og kan forlænge patientens overlevelse. Udviklingen af ​​mere effektive og mindre giftige anticancer-strategier også vil give mulighed for personalisering af terapeutiske afpasset efter de molekylære funktioner i de enkelte patienter [4].

proteomiske studier af leverprøver kan hjælpe med at identificere specifikke protein markører for metastaser [5]. En af de hyppigst anvendte fremgangsmåder til karakterisering af protein komponenter af biologiske systemer er todimensional polyacrylamidgelelektroforese (2DE) i kombination med massespektrometri. Typisk er 2DE bruges til at sammenligne ændringer i proteinniveau, modifikations- og nedbrydning mellem behandlede og ubehandlede prøver [6]. Proteom ændringer kan afsløres ved gel billedanalyse efter visualisering ved farvning og identifikation af proteinarter med ændret ekspression eller i post-translationelle stater [7].

De fleste undersøgelser baseret på 2DE analyse af proteinprofiler i kolorektal cancer er udført på væv lysat af colorektal adenocarcinom, tilstødende normale colon mucosa, og levermetastaser [8] – [10]. En sådan strategi er stort set begrænset til rigelige proteiner (fx strukturelle proteiner, glycolytiske enzymer, annexiner, cathepsiner, og varmechokproteiner), som overeksprimeres i flere cancertyper [8]. Imidlertid kan disse proteiner hæmme identifikationen af ​​lav tæthed proteiner, såsom membranproteiner, som spiller en grundlæggende rolle i cellesignalering, celle-celle-interaktioner, kommunikation og transportmekanismer, og er lægemiddeltargets [11]. Målrettede tiltag forbundet med isolation fra kliniske materiale subproteomes, såsom secretome, proteasomet, plasma-membran fraktion, nuklear matrix, etc., er dukket op for nylig. Subcellulær fraktionering kombineret med massespektrometri teknikker er en kraftfuld metode til at afdække hidtil ukendte, lave rigelige, specifikke kolorektale-associerede proteiner og kandidat biomarkører [8]. For eksempel blev 1687 proteinpletter observeret på store formater geler (24 × 33 cm) af en opløselig proteinfraktion af cancerøse og normale mucosa væv og det blev vist, at intensiteten af ​​≥96% protein spots blev spredt inden 2 ganges forskelle og 90,5% inden for 1,5-fold forskelle [12]. For en human lever cytosolisk fraktion på 17 × 24 cm geler, 2-fold færre proteinpletter (911 pletter) blev matchet [13]. 2DE billede analyser viste, at antallet af protein spots blev ændret betydeligt i primær kræft og hepatiske metastatiske læsioner. Angiveligt, membranfraktionen af ​​primær cancer og levermetastaser demonstrerede tab af proteinindhold (dvs. antallet af matchede proteinpletter på 2DE geler) sammenlignet med membranfraktionen af ​​normal colorektal mucosa [10]. Muto et al. [12] generelt rapporteret, at proteom af normalt væv kan være mere homogen end for tumorvæv.

Tidligere beskrev vi en fremgangsmåde til at skelne levermikrosomal prøver til visse klasser baseret på biokemiske profiler [14]. I denne rapport, at en eksperimentel design sammenligne de biokemiske og proteom profiler præsenteres (Figur 1). I den første fase af denne tilgang blev opnået den biokemiske profil. Den omfattede 12 parametre, nemlig aktivitet af NADPH-cytochrom P450 reduktase, cytochrom P450-indhold og 10 cytokrom P450-afhængige monooxygenase aktiviteter med markør substrater. Udelukkende skyldes ukontrollerede statistisk analyse af biokemiske profiler af humane levermikrosomer vi afledt at mønstre af leveren monooxygenasesystemet dannet to godt adskilte grupper (figur 1, A). Det blev vist, at mindst 6 variabler var signifikant forskellige mellem to store klynger af human lever mikrosomale prøver med

s

-værdi 0,05 med Bonferroni korrektion. Desuden blev det konstateret, at ændringer i NADPH-cytochrom P450-reduktase-aktivitet omfatter den vigtigste faktor, der er ansvarlig for adskillelsen af ​​biokemiske profiler mellem to grupper af patienter [14].

(A) Profilen omfattede 12 parametre, nemlig aktivitet af NADPH-cytochrom P450-reduktase, cytochrom P450-indhold og cytochrom P450-afhængig monooxygenase aktiviteter med markørvacciner substrater (Petushkova et al., 2010). (B) Profilen inkluderet 2DE billeder.

For at korrelere HLC protein profil, som defineret ved 2DE, med biokemiske aktiviteter mikrosomale system, vi brugte tidligere indsamlede morfologisk normale lever prøver omgivende levermetastaser af kolon kræft. Ultracentrifugering protokol blev anvendt til at give human lever cytosol og mikrosomale fraktioner fra de samme leveren prøven. Den aktuelle undersøgelse blev udført for at sammenligne prøven klynger opnået ifølge mikrosomal biokemisk aktivitet (figur 1, A) med de respektive cytosoliske proteom profiler (figur 1, b). Desuden var vi interesserede i identifikationen af ​​opløselige proteiner, som kan være en eller anden måde relateret til aktiviteten af ​​membranbundne cytochrom P450.

Materialer og metoder

Etiske procedurer

Alle prøver fra resterende lever efter histologisk analyse blev godkendt af Institut for Patologisk Anatomi af National Research center of Surgery, Russian Academy of Medical Sciences (Moskva, Rusland). Informeret samtykke opnåedes fra alle patienter. Enkeltpersoner enige om at deltage i undersøgelsen ifølge den lokale institution etiske udvalg i Det Nationale Forskningscenter for kirurgi. Prøver er blevet beskrevet i tidligere publikationer [14], [15].

Kemikalier Salg

2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethansulfonsyre, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF ), 2,5-dihydroxybenzoesyre, ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), nicotinamidadenindinucleotidphosphat, natriumdithionit, trypsin, og natriumdeoxycholat blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA); acetonitril og trifluoreddikesyre blev indkøbt fra ICN Pharmaceuticals Inc. (Costa Mesa, CA, USA); Coomassie Brilliant Blue R-250 blev indkøbt fra Fluka (Seelze, Tyskland). Modificeret trypsin (katalog nr. V511C) blev opnået fra Promega (Madison, WI, USA). Andre kemikalier blev købt fra Reakhim-Penza, LLC (Penza, Rusland).

2.3 Vævsprøver og forberedelse

De menneskelige opløselig lever protein fraktioner blev udarbejdet i vores tidligere undersøgelse (opbevares ved -80 ° C før brug) fra resektion og kasserede masser af omgivende levervæv, som blev taget fra patienter (n = 23) undergår hepatisk kirurgi [14]. Prøver af morfologisk normal lever (3-10 g,) blev opnået fra den distale kant af resektion, mindst 5 cm fra tumoren. Prøverne blev diagnosticeret ved histopatologi.

Som bestod med betingelser for eksperimentet, vi ikke tage hensyn til nogen personlig information om patienter eller om patientbehandlingen. Men indsamling af prøver blev udført i overensstemmelse med følgende instruktioner: (1) alle patienter var under alvorlig kræftsygdom, som førte til operation af lever måske efter en kemoterapi; (2) ingen strålebehandling blev udført inden operationen; (3) ingen tegn på endokrin eller metabolisk sygdom; (4) ingen alvorlig infektion blev opdaget; (4) patienternes kostbehov blev forvaltet af National Research Center for Kirurgi til en relativt ensartet standard; som et resultat blev eksogent kosten indflydelse på metabolisk profilering reduceres til det laveste niveau. De operativt fjernede prøver blev placeret umiddelbart på is forud for opnåelse af human lever mikrosomale fraktion [14] og HLC. Alle procedurer forberedelse blev udført ved 0-4 ° C. Leverprøverne blev homogeniseret i to volumener homogeniseringsbuffer, indeholdende 1 mM EDTA, 1 mM dithiotreitol (DTT), 0,1 mM PMSF og 150 mM KCl ved anvendelse af en glas Potter Elvehjem homogenisator med en teflon pistil (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Tyskland). Leveren Homogenatet blev successivt centrifugeres ved 10.000 ×

g

i 20 min og 105.000 ×

g

for 70 min. Pelleten (mikrosomale fraktion) blev analyseret som beskrevet i vores tidligere undersøgelse [14]. I den foreliggende undersøgelse blev supernatanten anvendt som HLC fraktion. Koncentrationen af ​​HLC prøverne protein blev estimeret under anvendelse af Bradford-assayet [16] med bovint serumalbumin som en standard.

Præ-fraktionering af HLC prøverne forud for todimensional polyacrylamidgelelektroforese

alikvot af HLC (200 pi, 13,2 ± 5,6 mg protein) blev blandet med 1 ml kold 10% trichloreddikesyre (TCA) i acetone (vol /vol) indeholdende 0,07% mercaptoethanol. Efter en 3-timers inkubation ved -18 ° C blev blandingen centrifugeret ved 20.000 x

g

i 10 minutter (4 ° C). Supernatanten blev kasseret, og pelleten blev opløst i 5 ml kold acetone, der indeholder 0,07% mercaptoethanol og centrifugeret som beskrevet ovenfor. Supernatanten blev kasseret, og den resulterende pellet blev anvendt for protein separation ved 2DE.

To-dimensional polyacrylamidgelelektroforese (2DE)

2DE af HLC proteiner blev udført som beskrevet af producenten (Bio -Rad, Hercules, CA, USA). For hver HLC prøve blev den resulterende pellet opløst i 200 pi rehydrering buffer (4 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% 3 – [(3-cholamidopropyl) -dimethylammonio] -1-propan-sulfonat, 50 mM DTT og 0,5 % ampholin). Proteiner blev indlæst ved passiv rehydrering på 11-cm, lineær, immobiliseret, pH-gradient (IPG, pH 3-10) strimler natten over (14 timer) ved 50 V og i yderligere 30 minutter ved 250 V. Isoelektrisk fokusering (IEF) blev udført under anvendelse af Protean IEF celle (Bio-Rad) med en påført gradient 250-5500 V for i alt 35.000 V · h. Alle IEF trin blev udført ved 20 ° C. Efter IEF blev IPG gelstrimler ækvilibreret i ækvilibreringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 6 M urinstof, 2% natriumdodecylsulfat (SDS), 20% glycerol) indeholdende 1% DTT og rystet i 30 minutter ved 50 rpm på en orbitalryster [17]. IPG strimler blev derpå overført til ækvilibreringsopløsningen, indeholdende 2,5% acrylamid, og rystet i yderligere 30 minutter før adskillelse på en polyacrylamidgel (135 × 80 × 1,0 mm, 4% strømpe gel, og 12% adskillelsesgelen). Separation i den anden dimension blev udført under anvendelse af Mini-Protean dodeca Cell (Bio-Rad) og Tris-glycin-buffer (25 mM Tris-base og 192 mM glycin) indeholdende 0,1% SDS, ved 150 V. Run tid var ca. 60 min og efter afgangen fra bromphenolblåt i bufferen, blev den elektroforetiske adskillelse betragtes som fuldstændig.

Protein visualisering og billedanalyse

Geler blev udsat for sølvfarvning [18], gel billeder blev erhvervet ved hjælp af en GS-800 Kalibreret densitometer (Bio-Rad) og uploades til proprietære digitale billede analyse software GelEditor. Det er skrevet i Java og supportsl værktøjer til indlæsning af billeder, automatiseret spot detektion baseret på Laplace af Gauss Filter, manuel spot afsløring, matching af protein profiler, og en mulighed for at gemme rapporter (Figur S1). Stedet intensitet på gelen blev beregnet som summen af ​​pixelene i et manuelt detekteret plet. Den GelEditor software kan frit downloades fra www.bioinformatics.ru/geleditor.zip.

I-gel fordøjelse

protein spots (~ 3 mm

3) blev udskåret fra under anvendelse modificerede 250-pi tips og affarvet med 50 pi 100 mM K

3 [Fe (CN)

6] og 100 mM natriumthiosulfat i et forhold på 01:01 (v /v) pr gel piece ved stuetemperatur i 30 min. Bagefter blev gelstykkerne vasket med vand ved stuetemperatur og rystet i 15 minutter ved 50 rpm på en orbitalryster. Proceduren blev gentaget tre gange. Derefter blev gelstykkerne vasket to gange med 150 pi 50 mM NH

4HCO

3 i 50% acetonitril ved 37 ° C, rystet i 15 minutter ved 50 rpm på en orbitalryster og inkuberes i 15 minutter i dehydrering opløsning (100% acetonitril). Efter acetonitril blev fjernet, og gelstykkerne tørret, 8 ± 2,0 pi trypsin-opløsning (25 ng /pl modificeret trypsin i 50 mM bicarbonat ammonium) blev tilsat, og blandingen blev inkuberet ved 37 ° C natten over. Derefter blev 15 pi af 0,7% trifluoreddikesyre sat til hver gel stykke, og prøverne blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. De ekstraherede tryptiske peptider blev anvendt til massespektrometrisk analyse.

Matrix-assisteret laser desorption-ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS)

Hver blanding af proteolytiske peptider (1 pi) blev spottet på en MALDI target (600/384 Anchor chip; Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Tyskland) i tre gentagelser og lufttørret. For ionisering, en opløsning af 2,5-dihydrobenzoic acid (3 mg /ml) i acetonitril og 0,7% trifluoreddikesyre (01:01 volumen /volumen) anvendt. Masse spektre i

m /z

vifte af 600-4000 blev manuelt erhvervet ved hjælp af FlexControl software (Bruker Daltonik GmbH) i refleksion /forsinket udvinding mode med en accelererende spænding på 25 kV og en 135-ns forsinkelse hjælp den Ultraflex II MALDI-TOF MS analysator (Bruker Daltonik GmbH). Alle massespektre repræsenterede signaler gennemsnit 100 laser skud fra et sted på en prøve stedet. Fra hver prøve stedet, blev 4-6 masse spektre erhvervet. Laser flydende blev justeret over tærsklen af ​​matricen for at opnå den bedste opløsning og den højeste masse målenøjagtighed desorption. Signaler med et S /N-forhold 6 og højst 100 toppe pr spektrum blev brugt til at bygge peak lister med SNAP algoritme (FlexAnalysis software ver 2.0;. Bruker Daltonik GmbH) og internt kalibreret med trypsin autolyse produkter (

m /z

842.5094 og 2211.1046 Da henholdsvis). Resulterende peak lister blev brugt til at søge mod UniProtKB /Swiss-Prot database (UniProt frigive 2012_09 – September 11, 2012). Identifikation ved peptidmassefingeraftryk (PMF) blev udført under anvendelse Mascot software (Matrix Science, Inc., Boston, MA, USA). Under databasesøgning, blev højst en savnet spaltning tilladt, en masse tolerance på 80 ppm blev anvendt, og variable modifikationer, såsom methionin oxidation og cystein modifikation med acrylamid, blev taget i betragtning. Den tilegnet m /z tolerance (80 ppm) blev estimeret som totalmasse afvigelse baseret på statistiske fordeling af masse fejl i alle spektre og dens standardafvigelse.

Statistisk analyse

Den oprindelige datasæt bestod af 19 prøver (2DE geler), hver kendetegnet i gennemsnit med 271 ± 99 proteinpletter /funktioner (tabel S1). Gel nr. 6 blev anvendt som master gel til den manuelle spot-til-spot tilpasning. Da vi var interesserede i at sammenligne resultaterne med forudgående viden om biokemiske profiler målt for de samme prøver [14], vi også udelukket gel nr.4 fordi i vores tidligere undersøgelse blev det anset som en outlier; så vi havde en samling af 18 gel billeder. At sikre undersøgelse reproducerbarhed og reducere støj følsomhed, analyserede vi kun kvalitative forskelle mellem geler i form af tilstedeværelse /fravær af et bestemt protein spots. Hver gel blev gentaget tre gange, og den bedste replika blev valgt ved visuel inspektion af adskillelse kvalitet. Final datasæt blev præsenteret som en binær matrix D bestående af 18 rækker (gels billeder) og 389 kolonner (pletter) hvor

d

ij

= 1, hvis

j

th stedet var til stede på

jeg

th gel, ellers

d

ij

= 0. For gel klyngedannelse, vi brugte Wards metode. Afstand metrisk mellem to binære vektorer blev defineret som antallet af bits, hvor disse vektorer afviger (også kendt som Hamming afstand). Alle beregninger og grafik blev udført med R statistisk sprog (www.r-project.org). Kildekoden for dataanalyse scriptet kan findes i dataanalyse Script S1. For at måle ligheden mellem to data clusterings, vi beregnet justeret Rand indeks, hvis værdi i intervallet mellem -1 og +1, hvor en svarer til perfekt aftale mellem partitioner.

Resultater og Diskussion

i vores eksperimenter alle prøver blev taget fra en kategori af patienter: kirurgisk behandlet for levermetastaser forbindelse tyktarmskræft (figur 1). Derfor er vores mål var ikke at finde forskelle mellem normen og kræft, men snarere at udforske strukturen inde i en-gruppe datasæt, der beskriver human lever narkotika metaboliseringssystem og cytosol fraktion (nærværende undersøgelse). I tidligere undersøgelse vedrørende lægemiddelmetabolisme [14] trods relativt beskedne stikprøvestørrelse (n = 22) vores resultater uden tvivl bekræftet tilstedeværelsen af ​​to klynger i data. Vi beregnede silhuet bredde kriterier for klynge gyldighed, som viste, at tilstedeværelsen af ​​to klynger er bekræftet med meget høj tillid (p 0,0001). Derfor afslørede heterogenitet inden for en lige behandlede gruppe af patienter var baggrund for den aktuelt rapporterede proteomisk undersøgelse.

2DE analyse af HLC

Studier af humane lever væv er blevet udført for at identificere, om der er grupper af prøver markante i deres proteomer. Den HLC proteom var præget af en repræsentativ samling af 19 prøver adskilt af 2DE på midterste format geler i tre gentagelser, således i alt 58 2DE billeder blev undersøgt. De bedste 2DE replikater blev udvalgt fra de tekniske kørsler efter adskillelsen kvalitet (figur S2). De valgte repræsentative billeder blev omdannet til stedet lister og yderligere grupperet ved hjælp af den ukontrollerede metode. Konsekvent med vores tidligere arbejde med levermikrosomer her brugte vi et uovervåget tilgang, fordi de kliniske oplysninger om de resektion leverprøver var ikke tilgængelig.

Vi afviste nogle prøver på grund af lav kvalitet 2DE adskillelse på grund af særegenheder i forberedelse prøve (figur 2). De typiske 2DE billeder af Ag-farvede gel af prøve nr. 6 før og efter præfraktionering med TCA i acetone (se materialer og metoder) er vist i figur 2,

en

b

. Uden præfraktionering, 2DE af cytosol fraktion hæmmer adskillelse af protein pletter (Figur 2

en

). Figur 2

b

er et repræsentativt mester gel billede, der viser adskillelse af proteiner fra humant levervæv efter TCA /acetone nedbør. Denne praksis anvendes ofte for at fjerne kontaminanter, fordi det minimerer proteinnedbrydning [19], men TCA /acetone udfældningen var utilstrækkelig til at opnå passende gel billeder af HLC prøverne nr. 20-23, så vi udelukkede disse prøver fra yderligere analyser. I alt blev 687 protein spots løst på en sølv-farvet 2DE gel fra HLC prøve no.6, teknisk run # 1, ved hjælp af spot afsløring værktøj af GelEditor software. Ud over den sølvfarvning baseret på protokol af Shevchenko et al. [18] Coomassie blue farvning blev også probet ved denne undersøgelse og blev påvist ca. kun 100 proteinpletter på samme gel No.6 (figur 2

c

).

30 pg af det humane opløselige lever proteinfraktion (HLC) blev adskilt ved 2DE og visualiseret ved sølvfarvning (

en

b

) eller Coomassie Brilliant Blue farvning (

c

):

et

– HLC før forbehandling med trichloreddikesyre i acetone;

b

c –

HLC efter forbehandling. Brug Coomassie farvning næsten 100 protein spots kunne blive afsløret, men ved hjælp af sølvfarvning mærkning op til 687 protein spots blev automatisk. Steder nos. 14, 25, 34, 36, 48, 56, 62, 63, 66, 210, 214, 219, 247, 252, 275, 276, 279, 301, 321, 322, og 408 er fælles for alle 2DE geler af 19 humane lever cytosol prøver.

De opnåede gel billeder blev undersøgt for at karakterisere spot reproducerbarhed og variabilitet. Vi observerede, at 96% af proteinet pletter var ved den nedre grænse af detektionsgrænse for sølv-thiosulfat med en normaliseret intensitet 0,02 relative enheder. Et medium intensitet på 0,02-0,04 enheder blev observeret for 2% af pletter, mens 1% af pletter var af høj overflod med relativ intensitet på . 0,1 enhed

Endvidere valgte vi master gel som den bedste gel med det højeste antal pletter og minimal udvalg af spredning af det gennemsnitlige intensitet af hver plet. Føreren gel svarede til prøve nr 6. For at estimere den tekniske variation af vores forsøgsopstilling, vi gennemførte fire uafhængige replikative kørsler af HLC prøve nr. 6 på forskellige tidspunkter. Ved første trin af analysen anvendte vi antallet af pletter som et groft mål for gel reproducerbarhed. I alt 449, 420, 444, og 406 protein spots blev påvist i disse forsøg i intervaller af pI 3,5-10,0 og MW 10-250 kDa. Den observerede gennemsnitlige antal pletter var 430 ± 20, som var sammenlignelig med tidligere data fra den cytoplasmatiske fraktion af primære humane hepatocytter i HepG2 og Hep2B cellelinjer [20]. De resterende geler indeholdt tilstrækkeligt færre pletter, som vist i figur 3 for 19 HLC prøver. I hele serien, det gennemsnitlige antal manuelt detekterede proteinpletter var 271 ± 99 (gennemsnit ± SD, n = 58). De spot mængder var tre gange lavere i forhold til de tidligere rapporterede resultater af cytosolisk fraktion analyse af humane lever vævsprøver [13], [21], [22]. Forskellen i stedet nummer skyldtes sandsynligvis den 2DE setup, som vi anvendte 11-cm IPG strimler i stedet for 17 cm, der anvendes af Wimmer et al. [13] og Kim et al. [23], og så gradienter for isoelektrisk fokusering var kortere. Kim et al. [23] analyserede tumor- og ikke regioner af resektion liver cancer væv ved identifikation af cytosoliske proteiner under anvendelse 2DE og MALDI-TOF-MS. De brugte sølvfarvning for protein detektion på geler og observerede op til 1060 pladser og identificeret 127 proteiner; de rapporterede også, at et problem med variabiliteten af ​​spot intensiteter blev besluttet at bruge normaliserede intensiteter.

Geler tilhørende klynge 1 er vist i hvide søjler. Geler tilhører cluster 2 er vist i grå søjler. Gel, der er fjernet fra alle efterfølgende databehandling vises i det skraverede kolonne.

For at evaluere gel til gel variabilitet, vi sammenlignede pletter mellem fire replikerede gel billeder opnået fra prøve nr. 6 ved hjælp af den manuelle spot matching træk den proprietære GelEditor software (Figur S1). Hver replikat blev manuelt justeret til master billedet, som indeholdt et maksimalt antal pletter. Vi fandt, at 102 pletter var til stede i mindst tre gentagelser, 80 spots matchede halvdelen af ​​gelerne, mens 58 pletter var til stede på kun master gel. Endelig 47% af pletter (209 pletter) matchede alle fire replikerede 2DE billeder.

For at bestemme reproducerbarhed 2DE, vi undersøgte tekniske løber af HLC prøve 6, analyserede de normaliserede intensiteter af hver plet, og plottet dem mod hinanden på en X-Y og en fraktil – fraktil (Q-Q) plots [24]. De X-Y grunde til prøven no.6, teknisk run # 1 (master gel) i forhold til samme prøve, teknisk run # 2 viser en Pearson korrelationskoefficient r = 0,797 (Figur 4

en

). Vi udførte en sådan analyse for alle fire tekniske kørsler af gelen 6 og bestemmes den gennemsnitlige Pearsons korrelationskoefficient, som var lig 0,72 ± 0,06 (gennemsnit ± 95% konfidensinterval). Størrelsen af ​​korrelationskoefficienten r 0,7 tyder på en stærk korrelation, mens Q-Q parceller blev brugt som et grafisk værktøj til at sammenligne to udlodninger til hinanden. To datasæt ville blive betragtet som identiske, hvis de punkter i Q-Q plots ligger tæt på en regressionslinje

y = x

. Som vist i figur 4b dette kriterium er perfekt opfyldt for HLC proteiner

Normaliseret spot intensiteter fra to tekniske kørsler af gelen no.- Y plot og fraktil-fraktil. (Q – Q) plot. X – Y plot viser stærk sammenhæng mellem spot intensiteter med en Pearson korrelationskoefficient r = 0,797 (a). Q – Q plot viser høj lighed mellem spot intensiteter distribution (b). Intensitet af hver matchede plet på gelen blev normaliseret pr generelle intensitet matchede pletter inden denne gel.

De meget reproducerbare pletter (209) blev anvendt til at estimere stedet intensitet variation på tværs af fire gentagelser for HLC prøve nej 6. i variationskoefficienten (CV) fordeling histogram (se figur 5), blev 65% af pletter karakteriseret ved en CV 0,6. Denne grad af variation mellem de replikerede geler var sammenlignelig med CV observeret mellem normalt væv vs. forskellige cancer stadier [9], [25]. For eksempel, Shi et al. [9] observeret en gennemsnitlig CV på 62-69% i 1223 spot funktioner fra 18 2D-Dige spot profiler blandt forskellige sample grupper (normal colon mucosa, primær kolorektal cancer, og levermetastaser). Forfatterne fandt, at både primære og sekundære tumorer udviste en signifikant højere grad af variationer spot volumen end den normale colon.

Intensitet af hvert matchet plet på gelen blev normaliseret per samlede intensitet af matchede pletter inden denne gel.

Generelt CV afhænger af typen af ​​biologisk materiale, samt prøveforberedelse og spot detection tilgange [26], [27]. I sølvfarvning, de matchende pletter forberedt og køre under identiske betingelser varierer i intensitet; Derfor er det vanskeligt at opnå reproducerbarhed selv med parallelle replikater [26]. Derfor, som vores geler var dårligt reproducerbare i intensiteterne af de matchende pletter, vi brugte ikke intensitet værdier for yderligere analyse, men konverterede pletterne i binært format: enten der er en plet, eller ikke

3.2. Unsupervised gruppering af de geler og mikrosomale prøver

Vi brugte klyngeanalyse til at adskille geler og belyse grupper i vores samling af leverprøver. Indledningsvis blev pletter på hver 2DE gel samles til pletter på master gel (nr. 6 # 1) Perl script (Data Analysis Script S2). Vores resultater blev formateret i en tabel, hvor rækkerne angivet proteinpletterne og kolonnerne repræsenteret HLC prøver. Hvis proteinet stedet var til stede på HLC gel og master gel blev celleværdi sat til “1”, ellers hvis stedet var fraværende på det næste HLC gel, blev det sat til “0”. Vi udførte hierarkisk klyngeanalyse af data matrix ved hjælp Ward metode kombineret med Hamming afstand metriske. Gruppering af 2DE geler af de HLC prøverne blev visualiseret som et dendrogram (figur 6

en

). To store klynger var klart skelnes: den første (klynge nr. 1) blev dannet af geler nos. 1-3, 5 og 7-13, mens den anden (klynge nr. 2) indeholdt geler nos. 6 teknisk run # 3, og 14-19. Så Ward metode gav to grupper af leverprøver. Interessant histogrammet i figur 3 foreløbigt pegede på eksistensen af ​​to klynger for de HLC prøver. Det gennemsnitlige antal manuelt opdaget protein pletter på geler fra klynger nos. 1 og 2 var 219 ± 72 og 342 ± 91 (gennemsnit ± SD) henholdsvis; Men forskellen i antallet af pletter var statistisk ubetydelig (

s

0,05, n = 18)..

To store klynger kan ses

Ifølge vores tidligere data, humane levermikrosomer også adskilt i to grupper [14]: den første indeholdt prøverne nr. 1-3, 5-12 og 23, mens det andet indeholdt prøverne nr. 13-22 (figur 1A). Således var der en sammenhæng mellem prøve klyngedannelse opstået fra de to absolut forskellige eksperimentelle tilgange.

Rand-indeks var 0,58, hvilket indikerer en betydelig kamp [27] mellem biokemiske og proteom data. En lille forskel mellem gruppe sammensætning af HLC prøver og human lever mikrosomale (lægemiddel-metaboliske) system blev fundet. Disse ændringer var især HLC prøver nos. 6 og 13, er tildelt klynge nos.