PLoS ONE: Trim28 Bidrager til EMT via forordning af E-Cadherin og N-Cadherin i Lung Cancer Cell Lines

Abstrakt

I tidligere arbejde, viste vi, at transskription faktor Trim28 (trepartsudvalg motiv indeholdende 28) spiller en tumor-suppressor rolle i tidlig iscenesat adenocarcinom i lungerne på grund af sin evne til at hæmme transskription af cellecyklus-regulerende gener. Heri vi undersøge Trim28 rolle i epitel-til-mesenkymale overgang (EMT), som er stærkt impliceret i cancer metastaser. Vi fandt, at Trim28 spiller en rolle i TGF-β-induceret EMT i ikke-småcellet lungecancer-celler. Silencing Trim28 med hæmmende RNA ændrer ekspressionen af ​​talrige EMT markører, såsom E-cadherin og N-cadherin, mens overekspression af Trim28 har en modsat effekt. Trim28 ekspression induceres efter TGF-β behandling på både protein og mRNA-niveauer. Trim28 mangel svækker TGF-β-induceret EMT og nedsætter cellemigration og invasion. Endelig viser vi, at ekspressionen af ​​Trim28 påvirker acetylering og methylering af histoner på E-cadherin og N-cadherin promotorer. Disse resultater antyder, Trim28 bidrager til EMT og kan være vigtig for tumormetastase i lungekræft. Taget sammen med vores tidligere arbejde disse resultater tyder på en model, hvor Trim28 er en tumor suppressor tidligt i omstillingsprocessen i lungekræft, men i senere faser det fungerer som et onkogen

Henvisning:. Chen L, Muñoz- Antonia T, Cress WD (2014) Trim28 Bidrager til EMT via forordning af E-Cadherin og N-Cadherin i lungekræft cellelinier. PLoS ONE 9 (7): e101040. doi: 10,1371 /journal.pone.0101040

Redaktør: Olivier de Wever, Ghent Universitet, Belgien

Modtaget: 11. december 2013; Accepteret: 3 juni 2014; Udgivet: Juli 1, 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute (CA119997 og CA163068) og Moffitt Cancer center. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) er kendetegnet ved et tab af celle-celle-adhæsion og polaritet, nedregulering af epitel markører, og erhvervelse af mesenkymale markører og fænotype [1]. Akkumulerende beviser fra undersøgelser på EMT har impliceret mange signalveje, herunder TGF-β, Notch, Wnt, EGF og FGF [2]. Blandt disse TGF-β inducerer EMT effektivt i en række forskellige modeller cellelinjer og

in vivo

[3]. Ligesom mange andre biologiske processer, er EMT i sidste ende reguleres transkriptionelt af en række transkriptionsfaktorer såsom Snail1, Snail2, ZEB1 og ZEB2 [4]. Desuden har epigenetiske modifikatorer også vist sig at spille en rolle i reguleringen af ​​EMT. For eksempler, histondeacetylase SIRT1 inducerer EMT gennem transskription faktor ZEB1 mens histon methyltransferase SUV39H1 og G9A undertrykke E-cadherinekspression og fremkalde EMT i en Snail-afhængig måde [5], [6], [7].

Trim28 er medlem af en evolutionært bevaret familie af transkriptionsfaktorer co-faktorer, der har forskellige [8] funktioner; herunder reguleringen af ​​celledeling, DNA-reparation, differentiering og pluripotens [9], [10], [11], [12]. Trim28 specifikt er blevet impliceret i aktiveringen af ​​EMT i fibroblaster [13] og livmoderhalskræft celler [14]. Afhænger af kontekst, kan Trim28 enten aktivere eller undertrykke transskription gennem distinkte mekanismer [15], [16], [17], [18]. Trim28-medieret gen-nedregulering har vist sig at indebære en forening med histon methyltransferase SETDB1, histondeacetylase kompleks NuRD og rekruttering til promotorområder via sekvensspecifikke transkriptionsfaktorer [19], [20]. Dette kompleks undertrykker målgen transkription ved ændring af histon modifikationer på promotorer [8]. Når phosphoryleret ved S824 har Trim28 blevet vist at associere med transskriptionsfaktor Oct3 /4 og aktivere Oct3 /4 målgener transkription [12]. En anden mekanisme Trim28-medieret transkription aktivering er via rekruttering til specifikke responselementer, såsom glucocorticoid-responsive element (GRE) og Nur responselementet (Nure), ved NGFI-B og C /EBPβ henholdsvis [17], [18]. Nylige undersøgelser har antydet, at Trim28 kunne spille en rolle i udviklingen af ​​kræft og metastaser [13], [14]. Specifikt Trim28 ekspression opreguleret i cancervæv sammenlignet med normale væv [9], [21], [22], [23]. I en søgning efter brystkræft metastase-associerede proteiner, blev Trim28 identificeret som en af ​​197 proteiner med forhøjet udtryk i metastatiske væv [24].

I vores tidligere arbejde [9], opdagede vi, at høj Trim28 (tresidede motiv indeholdende 28) proteiner niveauer korrelerer med længere samlet overlevelse i lungeadenokarcinom patienter tidlige-iscenesatte, men ikke i sene-iscenesat patienter. Denne observation foreslået os at Trim28 kunne spille dobbelte roller i lungekræft. Vi spekuleret på, at rolle i senere faser kan forholde sig til EMT [14]. For at teste denne hypotese undersøgte vi effekten af ​​shRNAi-medieret Trim28 udtømning på EMT i NSCLC cellelinjer (A549 og H358). Vi fandt, at Trim28 bidrager til TGF-β-induceret EMT, og at høje Trim28 favoriserer EMT antyder, at Trim28 kan være en regulator af tumormetastase, især i den senere udviklingsstadium lungekræft.

Materialer og metoder

cellelinier, plasmider og reagenser

Original lungekræft cellelinier blev opnået fra ATCC. A549 og H358 celler blev dyrket i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum. Trim28-manglende A549-celler (Trim28 shRNA), Trim28-dygtige A549 og tilsvarende afledte kontrol cellelinier blev beskrevet tidligere [9]. H358 celler stabilt udtrykker Trim28 shRNA blev udvalgt i 1 pg /ml puromycin. H358 celler stabilt udtrykker Trim28 blev selekteret i 500 ug /ml G418. Enkelte kloner blev screenet for Trim28 ekspression. Ligeledes-afledte kontrol cellelinier blev dannet ved anvendelse tomme vektorer. PcDNA-FLAG-HA-TIF1β og pRL-TK blev beskrevet tidligere [9]. pCS2-Myc-Trim28 [25] og pGL3-E-cadherin [26] var de generøse gaver fra Ryan Potts (UT Southwestern) og Jia Fang (Moffitt Cancer Center), hhv. TGF-β blev indkøbt fra R 90% sammenflydende. Tre lige sår blev ridset i hver brønd med en steril 200 gl pipettespids. Celler blev skyllet forsigtigt med PBS og 2 ml medium (uden FBS eller indeholdende 10% FBS) tilsat. Billeder blev taget ved 40x forstørrelse lige efter skrabe og igen efter 24 timer og 48 timer. Alle assays blev udført tre gange, og alle forsøg gentaget tre gange.

Invasion assays

Invasion assays blev udført i BD BioCoat Matrigel Invasion kammer (354.480, BD Bioscences) ifølge producentens instruktioner. Specifikt blev A549-celler resuspenderet ved 5 x 10

4 celler /ml og fyldt i kammeret skær (kontrol indsætter eller Matrigelcoatede indsætter). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 22 timer, og cellerne, der var migreret blev vasket, fikseret med methanol, farvet med 0,5% krystalviolet og talt i tre mikroskopiske felter. Den procentvise invasion blev beregnet ved at dividere gennemsnitlige antal celler invaderer gennem en Matrigel indsatsen ved middelantallet af celler migrerer gennem en kontrol insert. Invasionen blev bestemt ved at sammenligne den procentvise invasion af Trim28 Knockdown celler med procent invasion af kontrolceller.

Tredimensionale flercellede sfæroide kulturer Salg

Tredimensionale flercellede sfæroide kulturer blev skabt på samme måde som beskrevet [28]. Kort beskrevet blev celler resuspenderet i vækstmedier til en koncentration på 5 × 10

6 celler /ml, 30 pi af cellesuspensionen blev anvendt til at lave en dråbe og 12 dråber blev fyldt på låget af en steril 10-cm væv dyrkningsplade. Låget blev forsigtigt vendt og 20 pi vækstmedium blev tilsat til hver dråbe inden de bringes på en 10-cm vævskulturplade indeholdende 6 ml vækstmedier og inkuberet natten over. Den næste dag blev 20 pi medier fjernes fra hver dråbe og 20 pi frisk medium uden TGF-β eller indeholder TGF-β (slutkoncentration; 5 ng /ml) blev tilsat. Celler blev inkuberet i 72 timer og høstet til RNA-ekstraktion.

Statistisk analyse

Eksperimenter blev udført tre gange og præsenteret som middelværdien +/- SD. Dataene blev analyseret ved to-halet Students

t

-test for signifikans.

P

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant og repræsenteret af stjerner i tal.

Resultater

Trim28 mangel ændrer ekspressionen af ​​EMT markører

Til fat rolle Trim28 i A549 og H358 ikke-småcellet lungekræft-cellelinjer, kontrol og Trim28 mangelfulde celler blev udviklet ved hjælp af ikke-tavshed shRNA som en kontrol og shRNA målrettet Trim28. Først vi udnyttet en E cadherin antistof og konfokal mikroskopi til billedet E-cadherinekspression i kontrol A549 celler og i Trim28-mangelfulde A549s. Fig. 1A viser, at kontrol A549 celler udtrykker relativt lave niveauer af E cadherin, hvorimod Trim28-deficiente celler udtrykker megen E cadherin lokaliseret i plasmamembranen. Niveauer af β-tubulin var upåvirket af Trim28-mangel. Real-time PCR blev anvendt til at undersøge ekspressionen af ​​yderligere EMT markører i kontrol og Trim28-deficiente A549s og H358 celler. Som vist i fig. 1B, E-cadherin mRNA øges, mens N-cadherin og Snail2 blev nedsat i Trim28 knockdown celler. I H358 celler (Fig. 1B bund) E-cadherin øges mens Fibronectin, Snail1, Snail2, og Twist1 er reduceret i Trim28 knockdown celler. Western blots bekræftede, at Trim28 knockdown resulterede i en stigning i E-cadherin ekspression og en reduktion i N-cadherin ekspression på proteinniveauet (Fig. 1C). Reduktionen i N-cadherin-protein var også tydelig ved konfokal mikroskopi (se fig S1). De respektive positive korrelationer mellem Trim28 ekspression og N-cadherin ekspression og den negative korrelation mellem Trim28 ekspression og E-cadherin ekspression er også tydeligt, når en række umanipulerede cellelinier undersøges ved Western blotting (se fig S2).

En

, kontrol og Trim28 knockdown A549 celler blev farvet (som beskrevet under “eksperimentelle procedurer”) og undersøgt ved hjælp af konfokal immunfluorescensmikroskopi, som følger: E-cadherin (grøn, øverste panel), β-tubulin ( grøn, nederste panel), og DAPI (blå). Flettede billeder er i bunden af ​​hvert panel.

B

, RNA ekstrakter af kontrol og Trim28 knockdown A549 og H358 celler blev udsat for realtids-PCR til at bestemme ekspressionen af ​​målgener som angivet.

Stjernerne

repræsenterer betydelige

p

værdier *:

s

0,05.

C

, udtryk for EMT markører E-cadherin og N-cadherin blev målt i kontrol og Trim28 knockdown A549 og H358 celler ved western blotting.

Trim28 overekspression ændrer ekspressionen af EMT markører

da tidligere arbejde har rapporteret, at Trim28 kan fungere som en transskription co-faktor [16], [17], vi spurgte, om Trim28 kan regulere aktiviteten af ​​E-cadherin promotor ved hjælp af en luciferase reporter konstruktion drevet af E-cadherin promotoren. Tomme pcDNA vektor eller pCS2-Myc-Trim28 plasmider blev transficeret ind A549 og H358 celler sammen med en E-cadherin-promotor-drevet luciferase reporter og en transfektionskontrol reporter (pRL-TK Renilla Luciferase). Fig. 2A viser, at E-cadherin promotoren signifikant undertrykt af Trim28 overekspression i begge cellelinier. For at løse et større antal markører A549 og H358 celler stabilt udtrykker Trim28 blev afledt sammen med styreledninger tilsvarende afledte vha tom vektor. Som forventet, Trim28 overekspression resulterede i reducerede E-cadherinekspression niveauer mens N-cadherin niveauer blev forøget (fig. 2B). Lignende resultater (fig. 2C) blev opnået på mRNA-niveauet ved anvendelse real-time PCR. Kollektivt, disse data antyder, at Trim28 kan fremme EMT i lungekræft-cellelinjer.

En

, A549 og H358 blev transficeret i tre eksemplarer med E-cadherin promotor luciferase reporter, pRL-TK reporter, og ekspressionsplasmider angivet i figuren. Celler blev høstet 48 timer efter transfektion til bestemmelse af luciferase niveauer.

B

, kontrol (pcDNA3) og Flag-Trim28 stabilt udtrykt A549 og H358 celler blev analyseret for E-cadherin og N-cadherin niveauer ved western blotting.

C

, RNA ekstrakter af kontrol og Trim28 stabilt udtrykt A549 og H358 celler blev udsat for real-time PCR. Ekspressionen af ​​målgener blev bestemt.

Stjernerne

repræsenterer betydelige

p

værdier *:

s

0,05

Trim28 ekspression induceres af TGF-β

Det er kendt, at Trim28 ekspression og TGF-β-signalering er både forøget i en række forskellige cancere, herunder lunge- [9], [23], [29]. For at bestemme om disse observationer er forbundet i lungekræft, vi udnyttet to ikke-småcellet lungekræft cellelinier, som undergår EMT ved TGF-β behandling som modeller [30], [31]. Som det kan ses i figur 3A, er Trim28 proteinniveauer forøget ved TGF-β behandling i begge cellelinier. Selvom det basale niveau af Trim28 var meget lav i Trim28 knockdown celler, blev dets ekspression alligevel induceret efter TGF-β inkubation. Real-time PCR viste lignende resultat i mRNA-niveauer (figur 3B).

A

og

B

, A549 og H358 stabilt udtrykker ikke-lyddæmpning shRNA og Trim28 shRNA blev behandlet med TGF-β (2 ng /ml) i 3 til 10 dage. Helcellelysater og RNA-ekstrakter blev underkastet western blotting ved anvendelse af de viste antistoffer (A) og real-time PCR (B).

Stjernerne

repræsenterer betydelige

p

værdier *:

s

0,05

Trim28 deltager i TGF-β-induceret EMT

TGF-beta behandlede celler vil gennemgå EMT, som kan karakteriseres ved morfologiske celleforandringer fra sten-lignende til spindel-lignende form [32]. For at bestemme om Trim28 er påkrævet for TGF-β-induceret EMT, vi behandlede kontrolgrupper og Trim28 knockdown-celler med TGF-β (2 ng /ml) og observeret morfologiske ændringer over tid. Fig. 4A viser, at erhvervelsen af ​​mesenkymale morfologi i kontrol H358 induceret af TGF-β ikke blev observeret i Trim28 knockdown celler under de samme betingelser kraftigt antyder, at Trim28 er involveret i TGF-β-induceret EMT. Brug real-time PCR, undersøgte vi mRNA niveau af E-cadherin og andre kendte mesenkymale markører i A549-kontrol og Trim KD celler efter TGF-β behandling. Selv i Trim28 Knockdown celler nogle mesenkymale gener viser svag opregulering, den robuste induktion af mesenkymale markører N-cadherin, fibronektin, vimentin, og Twist1 forårsaget af TGF-β behandling var signifikant svækket (Fig.4B). Western blot resultater (Fig.4C) bekræfter, at TGF-β er i stand til at reducere E-cadherin og opregulere N-cadherinekspression i kontrol- celler, men det undlader at gøre det i Trim28 knockdown celler.

A

, kontrol og Trim28 knockdown celler blev behandlet med TGF-β eller venstre ubehandlet. Celler blev fotograferet ved 40 ganges forstørrelse.

B

, RNA blev ekstraheret fra kontrol og Trim28 knockdown A549-celler behandlet med TGF-β som ovenfor eller venstre ubehandlet. Real-time PCR blev udført, og ekspressionen af ​​målgener blev bestemt.

C

blev kontrol- og Trim28 knockdown A549 og H358-celler behandlet med TGF-β (2 ng /ml), indtil morfologi ændringer blev observeret eller ubehandlet. Hele cellelysater blev udsat for western blotting ved hjælp af antistoffer som angivet.

Udtømning af Trim28 reducerer celle migration og invasion

rolle Trim28 i celle migration og invasion blev evalueret ved Sår healing assay og Matrigel-baserede transwell invasion assay. I vores tidligere undersøgelser, fandt vi, at Trim28 påvirker celleproliferation i A549-celler, men ikke signifikant i H358 celler (upublicerede data og [9]). Heri, brugte vi kulturmedier med eller uden FBS at udelukke bidrag af celleproliferation i bestemmelsen af ​​migration af A549 celler. Trim28 knockdown celler viste mindre sår lukning end kontrol celler (Fig.5A og 5B) med eller uden serum. Desuden viste Matrigel-baserede transwell invasion assay at Trim28 knockdown hæmmede celle invasion af A549 celler (Fig.5C).

En

, kontrol og Trim28 knockdown H358 celler blev udsat for sår -healing assay. Celler blev fotograferet lige efter bunden, og 24 timer og 48 timer efter bunden.

B

, kontrol og Trim28 knockdown A549 celler blev udsat for sårheling assay i fravær eller tilstedeværelse af serum. Celler blev fotograferet lige efter bunden og 24 timer senere.

C

, kontrol og Trim28 knockdown-celler blev udpladet i tre eksemplarer på de øverste brønde i Matrigelcoatede eller ikke-overtrukne kamre. Efter 18 timer blev celler, som havde invaderet gennem Matrigel laget fikseret og farvet. Procentdelen af ​​invasive celler, er vist i søjlediagrammet.

Stjernerne

repræsenterer betydelige

p

værdier *:

s

0,05.

D

, kontrol og Trim28 knockdown A549-celler blev dyrket i en tre-dimensionel model og behandlet med TGF-β (5 ng /ml) i 72 timer. RNA blev ekstraheret fra cellerne og underkastet real-time PCR. Ekspressionen af ​​målgener blev bestemt.

Tredimensionelle cellekulturer har vist sig at undergå EMT mere effektivt end monolag celler [28]. For at undersøge om Trim28 knockdown undertrykker EMT i en tre-dimensionel model, vi podet kontrol og Trim28 knockdown A549-celler på lågene af p100 dyrkningsskål og tilladt dem at danne hængende dråber, som beskrevet i

Materialer og fremgangsmåder

. Efter 72 timer i nærvær af TGF-β blev celler høstet og RNA ekstraheret for real-time PCR-analyse af EMT-markører. Fig. 4B afslører, at efter TGF-β behandling ekspressionen af ​​vimentin, Snail1, og Snail2 i kontrolceller A549-celler ændret mere drastisk (6 til 10 gange) i 3D-modellen (fig. 5D) end dem i monolag (1,5 til 2,5 gange). Men disse EMT markører var ikke opreguleret i Trim28 knockdown celler efter TGF-β behandling. Tilsammen understøtter disse resultater vores konklusion om, at Trim28 er en regulator af EMT.

Trim28 ændrer histon 3 ændringer på E-cadherin og N-cadherin initiativtagere

Trim28 har vist sig at regulere genekspression gennem modifikation af histoner af target-genpromotorer [8]. Kendte partnere Trim28 omfatter SETDB1 [19], en histon 3 lysin 9-specifikke methyltransferase og histondeacetylaser såsom HDAC1 [8]. I vores tidligere arbejde, fandt vi, at Trim28 knockdown øger histon 3 lysin 9 acetylering på bestemte udvalgte initiativtagere [9]. Heri, vi undersøgt, om Trim28 påvirker histon 3 ændring af E-cadherin og N-cadherin initiativtagere. Chip assays blev anvendt og IgG, acetyl-H3K9, dimethyl-H3K9, og trimethyl-H3K9 antistoffer blev anvendt. Som vist i fig. 6A, i Trim28 deficiente celler, er acetylering øges henviser methyleringen formindskes på histon 3 lysin 9 i E-cadherin promotoren sammenlignet med kontrol shRNA celler. En modsat effekt på N-cadherin blev observeret i de samme celler.

En

, chip assays blev gennemført i kontrol og Trim28 knockdown A549 celler. Kvantitativ PCR blev udført for at undersøge belægning af IgG, acetyleret histon 3 K9, dimethyleret histon 3 K9, og trimethyleret histon 3 K9 på E-cadherin og N-cadherin initiativtagere. B, blev chip assays udført i kontrol og Trim28 stabilt udtrykt A549-celler. Kvantitativ PCR blev udført for at undersøge belægning af IgG, acetyleret histon 3 K9, dimethyleret histon 3 K9, og trimethyleret histon 3 K9 på E-cadherin og N-cadherin initiativtagere.

Desuden at demonstrere hvorvidt Trim28 overekspression kan påvirke E-cadherin og N-cadherin initiativtagere, brugte vi pcDNA3 kontrol og Trim28-dygtige A549 celler og udførte chip assay. I fig. 6B, i modsætning til de observerede i Trim28 knockdown celler resultater, at acetylering af histon H3K9 er faldet, og methylering øges i Trim28-dygtige celler. På N-cadherin promotoren er acetylering af histon 3 H3K9 øget og methylering formindskes. Tilsammen indikerer disse resultater, at Trim28 ændrer E-cadherin og N-cadherin ekspression (i det mindste delvist) ved histon modifikation, som igen regulerer deres transkription.

Discussion

Vi har vist, at Trim28 kan påvirker posttranslationel modifikation af histon 3 på E-cadherin og N-cadherin promotorer. På dette tidspunkt har vi ikke belyst de specifikke involverede mekanismer. Trim28 kan mediere disse ændringer direkte eller indirekte. Den direkte mekanisme ville involvere Trim28 og Trim28-associerede histon modifikatorer blive ansat til at cadherin initiativtagere af EMT-regulerer transkriptionsfaktorer. Trim28 har vist sig at binde og regulere mange transkriptionsfaktorer på denne måde [16], [19], [33]. Men vi har designet primere rettet mod -2 kb til +0,5 kb af E-cadherin og N-cadherin initiativtagerne og ikke har kunnet påvise en Trim28 bindende region af Chip assay (upublicerede observationer). En anden mulighed er, at Trim28 regulerer ekspressionen af ​​EMT-relaterede transkriptionsfaktorer, som yderligere vil regulere EMT-gener. De transkriptionsfaktorer, der kan opholde sig direkte på E-cadherin promotor omfatter Snail1, Snail2, ZEB1, ZEB2, Twist1 og FOXC2 [4]. I vores undersøgelse fandt vi, at ekspressionen af ​​mange transkriptionsfaktorer ændres med Trim28 overekspression eller mangel, som giver bevis for muligheden. Yderligere undersøgelser vil undersøge denne mekanisme.

Det mest bemærkelsesværdige del af vores arbejde er beskrevet her er, at Trim28 påvirker TGF-β-induceret EMT i lungekræft gennem transkriptionel regulering af flere epitel og mesenkymale markører. Mus betinget knockout undersøgelser har klart tilkendegivet, at Trim28 og relateret familiemedlem kan opføre sig som tumorsuppressorer [34]; Men andre undersøgelser viser, at Trim28 har forhøjede niveauer og onkogene virkninger i en række forskellige cancere [21], [35]. Vi foreslår modellen i fig. 7 til at forklare den dobbelte rolle Trim28 i lungekræft udvikling og metastase. Vi hypotesen, at Trim28 gennem regulering af flere alternative veje kan have både tumor undertrykke og onkogene aktiviteter meget som TGF-β-signalvejen er kendt for at spille en kompleks rolle tumorigenese. På den ene side, TGF-β1 regulerer negativt cellecyklus og tjener som en tumorsuppressor i normale og præ-malignment væv. På den anden side, TGF-β, der udskilles af tumorceller, fremmer tumorinvasion og metastase [36]. Vi foreslår, at Trim28 bidrager væsentligt til TGF-β evne til at hæmme cellevækst og for TGF-β1 til at inducere EMT. Disse muligheder udelukker ikke hinanden, og dette net kan være endnu mere komplekst, når de faser og typer af cancer betragtes. Som vist i figur 7, i normale væv og kræft tidligt tidspunkt Trim28 er ansvarlig for celle-cyklus regulering gennem E2F transkriptionsfaktorer og HDACs; derfor, Trim28 viser en antiproliferativ funktion og fungerer som en tumorsuppressor. I sen eller metastatiske cancere, højt Trim28 bidrage til EMT gennem transskription regulering af epitel- og mesenchymal-gener, som et resultat, celler med højt Trim28 tendens til at have en mere invasive og metastatiske karakter. Denne model er understøttet af rapporter i litteraturen [13], [24] og vores resultater [9]. Vores resultater kan kaste lys mod forstå den dobbelte roller TGF-β-signalering i tumorer.

Denne model forklarer dette arbejde og vores tidligere arbejde demonstrerer en tumor suppressor rolle for Trim28 [9].

Støtte Information

Figur S1.

Trim28 mangel reducerer ekspressionen af ​​N -cadherin.

C

ontrol og Trim28 knockdown A549 celler blev farvet (som beskrevet under “eksperimentelle procedurer”) og undersøgt ved hjælp af konfokal immunfluorescensmikroskopi, som følger: N-cadherin (grøn, øverste panel), β-tubulin (grøn, bundpanel), og DAPI (blå). Flettede billeder er nederst

doi:. 10,1371 /journal.pone.0101040.s001

(TIF)

Figur S2.

Trim28 udtryk show negativ korrelation med E cadherin udtryk og positiv korrelation med N-cadherinekspression i en serie af ikke-småcellet lungecancer linjer. A, hele cellelysater blev underkastet western blotting under anvendelse af de angivne antistoffer. B, band intensiteter blev kvantificeret og plottet på en logaritmisk skala. Korrelationer er ikke statistisk signifikante

doi:. 10,1371 /journal.pone.0101040.s002

(TIF)