PLoS ONE: a-actinin-4 Forbedrer Kolorektal Cancer Cell Invasion ved at undertrykke Focal Vedhæftning Maturation

Abstrakt

α-Actinins (ACTNs) er kendt for at tværbinde actinfilamenter på fokale sammenvoksninger i migrerende celler. Blandt de fire isoformer af pattedyr ACTNs er ACTN1 og ACTN4 allestedsnærværende udtrykt. For nylig blev ACTN4 rapporteret at forbedre kræft cellemotilitet, invasion og metastase. Men den mekanisme, hvormed ACTN4 driver disse maligne fænotyper forbliver uklart. Her viser vi, at ACTN4, men ikke ACTN1, inducerer dannelsen af ​​umodne fokale sammenvoksninger i DLD-1 celler, hvilket fører til hurtig omsætning af fokale sammenvoksninger. Interessant, zyxin (ZYX) samling til fokale sammenvoksninger blev markant nedsat i ACTN4 udtrykker DLD-1 celler, mens rekruttering af paxillin (PAX) forekom normalt. På den anden side, i ACTN1 udtrykker DLD-1 celler, PAX og ZYX var normalt rekrutteret til fokale sammenvoksninger, hvilket tyder på, at ACTN4 specifikt svækker omdrejningspunkt vedhæftning modning ved at hæmme rekrutteringen af ​​ZYX til grupper komplekser. Brug oprensede rekombinante proteiner, fandt vi, at ZYX binding til ACTN4 var defekt under forhold, hvor ZYX binding til ACTN1 blev observeret. Endvidere blev Matrigel invasion af SW480-celler, der udtrykker høje endogene niveauer af ACTN4 protein inhiberet af ektopisk ekspression af ACTN1. Alt i alt, vores resultater tyder på, at ZYX defekt binding til ACTN4, som optager fokale sammenvoksninger i stedet for ACTN1, inducerer dannelsen af ​​umodne fokale sammenvoksninger, hvilket resulterer i forbedring af celle motilitet og invasion

Henvisning:. Fukumoto M, Kurisu S, Yamada T, Takenawa T (2015) α-actinin-4 Forbedrer Kolorektal Cancer Cell invasion ved at undertrykke Focal Adhesion Modning. PLoS ONE 10 (4): e0120616. doi: 10,1371 /journal.pone.0120616

Academic Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, CANADA

Modtaget: 5. oktober, 2014 Accepteret: 24 Januar 2015; Udgivet: April 10, 2015

Copyright: © 2015 Fukumoto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Japan Society for fremme af Science (JSP’er) gennem JSP’er Tilskud-i-Aid for Videnskabelig Forskning Grant 25.860.215 (til S. Kurisu ) og JSP’er Tilskud-i-Aid for Videnskabelig Forskning Grant 23227005 (til T. Takenawa). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

α-Actinins (ACTNs) er allestedsnærværende udtrykt cytoskelet proteiner, der tværbinder actin filamenter på compliance kryds i epitelceller og fokale sammenvoksninger i polariseret migrerende celler [1,2]. I fokale adhæsioner, ACTNs interagerer med en række andre fokale adhæsions–associerede proteiner såsom vinculin (VCL) [3,4] og integriner [5,6], og derefter knytte actinfilamenter til fokale adhæsioner [7-9]. Der er fire isoformer af ACTNs i pattedyrceller [10-12]. ACTN1 og ACTN4 er ubikvitært udtrykt og kaldes ikke-muskel isoformer, mens ACTN2 og ACTN3 specifikt udtrykkes i muskelvæv. Blandt ACTNs, ACTN4 er primært involveret i celle motilitet og kræft invasion [12-21]. Under celle bevægelse, er ACTN4 proteinekspression niveau markant øget, og ACTN4 koncentrerer på forkant af migrerende celler [12]. ACTN4 knockdown undertrykker migration og invasion af cancerceller [15-18,20-22], mens dets overekspression i kolorektal cancer celler inducerer lymfeknude metastaser i immunsvækkede mus [13]. Endvidere ACTN4 proteinekspression tæt forbundet med dårligt resultat hos patienter med brystkræft [12], kolorektal [13], pancreas [20,23], ovarie- [19], blære [21], og lunge [24] cancer. Men grunden til, at ACTN4, snarere end ACTN1 er ofte forbundet med kræft maligniteter trods ligheder i domænet struktur, actinbindende og-tværbinding aktiviteter, og Ca

2 + -sensitivity mellem de to mangler at blive belyst [25] .

fokale adhæsioner er store integrin-baseret, dynamiske makromolekylære strukturer, der forbinder den ekstracellulære matrix med de intracellulære bundter af actinfilamenter kaldet stress fibre. Fokal adhæsion er den primære struktur, der transmitterer ekstracellulær trækkraft i en celle. Således klæbestyrken af ​​celler til substratet og levetiden eller dynamik af fokale adhæsioner kritisk påvirker dynamisk organisation af celleform, herunder cellemotilitet. Ved overflytning celle lamellipodia, spirende sammenvoksninger, som består af klynger integriner og andre cytoplasmatiske proteiner såsom fokal vedhæftning kinase (FAK), ACTN, og vinculin (VCL) indledningsvis dannes. Disse er kortlivede strukturer, der enten omsætning hurtigt i omkring 60 sekunder, eller moden til større (ca. 1 um i diameter) dot-lignende sammenvoksninger benævnt fokale komplekser, der fortsat i flere minutter. Focal komplekser yderligere vokse centripetalt ind aflange fokale adhæsioner, og sideløbende de tilknyttede actin stress fibre bliver tykkere [26]. Polymerisering af lamellipodial actin katalyseres af actin kernedannelse fremme faktorer, WASP familie verprolin-homologe protein (WAVE) familieydelser proteiner og actin-relateret protein 2/3 (ARP2 /3) kompleks, som også er nødvendig for samlingen af ​​spirende sammenvoksninger. Lamellipodial actinfilamenter i samråd med ACTNs, danner forstadier, der tjener som skabeloner til modningen af ​​spirende sammenvoksninger inden fokale sammenvoksninger [27,28]. Modningen af ​​spirende omdrejningspunkt vedhæftning involverer deltagelse af stilladser proteiner, nemlig paxillin (PAX) og zyxin (ZYX), til at danne stabile fokale sammenvoksninger [7,26,29-31]. PAX synes at regulere overgangen fra spirende sammenvoksninger til grupper komplekser gennem flere fosforylerede tyrosinrester af PAX. På den anden side, ZYX deltagelse i fokale adhæsioner er et relativt sent hændelse, der forekommer efter fokale komplekser dannes. Således er ZYX menes at være involveret i dannelsen og reorganisering af fuldt modne, centripetale fokale sammenvoksninger. I overensstemmelse, nylige rapporter tyder rolle ZYX i stress fiber fortykkelse som reaktion på mekaniske spændinger [32]. ACTN1 er traditionelt menes at være en linker mellem integrin komplekser og stress fibre, eftersom ACTN1 direkte kan binde til integrin β1, VCL og ZYX [33,34]. Imidlertid rolle ACTN4, som udviser en høj aminosyrelighed (86%) til ACTN1, er ikke blevet præcist testet, både i funktion og i protein-protein interaktioner i fokal adhæsionsdannelse.

I denne undersøgelse vi demonstrerer modsatrettede virkninger af ikke-muskel ACTNs i fokal vedhæftning modning i kolorektal cancer celler. ACTN1 positivt regulerer omdrejningspunkt vedhæftning dannelse, mens ACTN4 inducerer destabilisering og hurtig omsætning af fokale sammenvoksninger i ACTN4-overekspression celler. Vi viser også, for første gang, en klar forskel mellem de to ACTN isoformer i ZYX-binding. ACTN4 binder ikke til ZYX, som sandsynligvis ligger til grund for observerede høje omsætningshastighed af fokale adhæsioner i ACTN4-overudtrykkende celler, mens ACTN1 binder til ZYX som tidligere rapporteret. ACTN4 manglende binde til ZYX tæt associerer med kræft patogenese, fordi kompromitteret celle-substrat vedhæftning ofte fører til øget kræftcelle motilitet og invasionsevne.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

anti-ACTN1 antistof (H00000087) blev købt fra Abnova (Taipei City, Taiwan). Anti-ACTN4 antistof (ALX-210-356) blev købt fra Enzo Life Sciences (Plymouth Meeting, PA, USA). Den anti-RhoA (sc-418) og anti-myosin regulatoriske let kæde (MRLC) (sc-28329) antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Den anti-phospho-MRLC (T18 /S19) antistof (# 3674) og anti-His-mærke-antistof (# 2365) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Den anti-FLAG (F3165), anti-VCL (V9131), anti-ZYX (HPA004835), og pan-ACTN (A5044) antistoffer blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Den anti-PAX-antistof (610.051) blev indkøbt fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Den anti-phospho-SRC (Y418) antistof (44-660G) og anti-phospho-FAK (Y397) antistof (44-624G) blev købt hos Life Technologies (

Carlsbad

, CA, USA). Den anti-actin-antistof (MAB1501) blev købt fra EMD Millipore (Billerica, MA, USA). Rhodamin-mærket phalloidin blev erhvervet fra Life Technologies. Vækstfaktor Reduceret Matrigel (# 354.230) blev indkøbt fra Corning (New York, NY, USA). Aktin proteiner oprenset fra kanin skeletmuskel (AKL99-A) blev købt fra Cytoskeleton, Inc. (Denver, CO, USA).

Cell kultur

menneskelige kolorektal cancer cellelinjer DLD-1 , HT-29, LoVo, NCI-H508, og Caco-2 var generøse gaver fra Dr. T. Azuma (Tokyo Dental College, Tokyo, Japan). Den menneskelige kolorektal cancer cellelinje SW480 var en generøs gave fra Dr. K. Nagano (The Institute of Medical Science, University of Tokyo, Tokyo, Japan). DLD-1 og LoVo blev oprindeligt købt hos JCRB Cell Bank (Osaka, Japan). HT-29, NCI-H508, Caco-2, og SW480 var fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Alle cellelinjer, bortset fra SW480, blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Wako, Osaka, Japan) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 4 mM L-glutamin og penicillin /streptomycin. SW480-celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI 1640; Wako, Osaka, Japan) suppleret med 10% FBS. FreeStyle 293F celler blev dyrket i FreeStyle 293 Expression medium (Life Technologies).

plasmider og transfektion

Fuld-længde human ACTN1, ACTN4, og ZYX cDNA’er blev opnået ved polymerasekædereaktion (PCR) hjælp DLD-1-celle-cDNA som skabelon. Følgende deletionsmutanter af ZYX blev amplificeret ved PCR: ZYX-N (aminosyrer [aa] 1-51) og ZYX-C (aa 52-572). Alle cDNA’er blev sekventeret, og derefter subklonet ind i pCMV2A, pCMV4A (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), pEGFP-N2, pEGFP-N3, pEGFP-C1, pmCherry-N1 (TAKARA BIO Inc., Otsu, Japan), pGEX-6P-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), og pFastBacHT A (Life Technologies). GFP-vinculin (VCL) konstruktion blev tidligere beskrevet [35]. For ACTN stabil ekspression i DLD-1 celler, cDNA’er der koder GFP, ACTN1-GFP, og ACTN4-GFP blev amplificeret ved PCR og indsat i pIRESpuro3 vektoren (TAKARA BIO Inc.).

Plasmider blev transficeret i DLD- 1 eller SW480 celler ved anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens eller i FreeStyle 293F celler med FreeStyle Max reagens i overensstemmelse med producentens anvisninger (Life Technologies).

RNA-interferens (RNAi)

Små interfererende RNA (siRNA’er) rettet mod menneskelige ACTN1 og ACTN4 (siGENOME SMARTpool) og siGENOME Ikke-targeting Kontrol siRNA Pool # 2 blev købt fra GE Dharmacon (Lafayette, CO, USA). siRNA’er blev transficeret ind DLD-1-celler med Lipofectamine RNAiMAX reagens (Life Technologies) i en endelig koncentration på 10 nM. De transficerede celler blev dyrket i et vækstmedium i 48-72 timer før det underkastes western blotting eller immunfluorescensfarvning.

Generering af stabile DLD-1-ACTNs-GFP cellelinier

DLD- 1-celler blev transficeret med pIRESpuro3-GFP, -ACTN1-GFP, eller-ACTN4-GFP. Enkelte kolonier blev isoleret efter 2 ugers puromycinselektion (1,5 ug /ml). Proteinekspression i cellelysater blev bestemt ved immunoblotting med et anti-GFP-antistof. De fremkomne celler blev betegnet som DLD-1-GFP, DLD-1-ACTN1-GFP, eller DLD-1-ACTN4-GFP.

Oprensning af rekombinante proteiner

Menneskelig fuld længde ZYX og ZYX-C blev klonet ind i pCMV2B vektor koder for et N-terminalt FLAG-mærke og transficeret ind i FreeStyle 293F celler. Cellerne blev høstet ved centrifugering 48 timer efter transfektion, og pelleten blev resuspenderet i immunpræcipitering (IP) puffer (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre [EDTA], og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF]) suppleret med leupeptin og aprotinin. Cellerne blev lyseret ved lydbehandling og centrifugeret ved 100.000 ×

g Salg i 30 min. Supernatanten blev inkuberet med anti-FLAG M2 affinitet gel (Sigma-Aldrich) i 2 timer og derefter vasket fire gange med IP puffer. FLAG-ZYX-fuld og-ZYX-C bundet til anti-FLAG M2-gel blev straks anvendt til pull-down assay. Human ZYX-N blev klonet ind i pGEX-6P-1-vektor. Denne konstruktion blev anvendt til at transformere BL21 (DE3) pLysS

Escherichia coli

celler (Promega, Madison, WI, USA). De celler, der udtrykker GST-fusionsproteiner blev opsamlet, resuspenderet i lysepuffer (40 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 5 mM EDTA og 1 mM PMSF og Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablet [ ,,,0],Roche, Basel, Schweiz]), lyseret ved lydbehandling og centrifugeret ved 12.000 x

g

i 30 min. Supernatanten blev inkuberet med glutathion Sepharose 4B (GE Healthcare) i 2 h og derefter vasket med lyseringspuffer. Bundet GST-ZYX-N blev elueret med glutathion.

His-mærket humant fuldlængde ACTN1 og ACTN4 blev udtrykt i Sf9-celler ved anvendelse af Bac-to-Bac Baculovirus Expression System (Life Technologies). Rekombinante proteiner blev oprenset under anvendelse af Ni-NTA agarose (Qiagen, Venlo, Holland).

immunfluorescensmikroskopi

Celler blev transficeret med plasmider eller siRNAs og re-udpladet på Matrigelcoatede dækglas efter 24- 48 h transfektion. Cellerne fik lov at klæbe og spredes i 24 timer, og derefter fikseret med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af permeabilisering anvendelse af 0,2% Triton X-100 i phosphatpufret saltvand (PBS) i 5 minutter. Dækglassene blev vasket to gange med PBS og inkuberet med de primære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur, og derefter behandlet med sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Alexa Fluor 568 gede-anti-kanin IgG (H + L) antistof og Alexa Fluor 647 ged anti-mus IgG (H + L) antistof (begge fra Life Technologies) blev anvendt som sekundære antistoffer. De dækglas blev monteret med PermaFluor Vandig Montering Medium (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og observeret ved hjælp af en FluoView 1000-D konfokalmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

Western blotting

Alle celler anvendt til Western blotting blev podet i plastskåle belagt med Matrigel. Cellerne blev lyseret med Laemmli prøvebuffer, sonikeret kortvarigt at adskille DNA, og kogt ved 95 ° C i 5 min. Western blotting blev udført ved standardprocedurer med afsløring af alkalisk phosphatase-konjugeret gede-anti-mus eller kanin-IgG sekundære antistoffer (Promega). ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) blev anvendt til at kvantificere band intensiteter.

Kvantificering af fokale sammenvoksninger og stress fibre

Focal sammenvoksninger blev kvantificeret som følger. Celler blev fikseret og farvet med anti-VCL antistof og rhodamin-phalloidin, eller med anti-PAX og anti-ZYX antistoffer. Billeder blev opnået ved konfokal mikroskopi og tærskelværdi for tre gange baggrunden. Fokale vedhæftning numre blev kvantificeret ved at tælle VCL eller PAX plaques. For at kvantificere omdrejningspunkt vedhæftning modenhed, blev PAX- og ZYX-positive plaques per arealenhed (DLD-1 celler) eller per celle (SW480 celler) talt. Otte til firs celler opnået fra tre uafhængige forsøg blev analyseret. Forholdet mellem ZYX-positive til PAX-positive (i alt) plaques blev beregnet for hver celle og derefter gennemsnit mellem celler. For at kvantificere fokal adhæsion størrelse, den gennemsnitlige område i PAX-positive plaques blev beregnet for hver celle og derefter gennemsnit mellem celler. Alle billedbehandlingen blev udført ved anvendelse ImageJ software.

Stress fiberdannelse blev kvantificeret som følger. Celler transficeret med kontrol, ACTN1, og ACTN4 siRNAs, eller celler, der udtrykker GFP, ACTN1-GFP, eller ACTN4-GFP blev farvet med anti-VCL antistof og rhodamin-phalloidin og afbildes ved konfokal mikroskopi under de samme indstillinger erhvervelse. Phalloidin signaler blev tærsklingsbehandlet på samme niveau og procentdelen af ​​celler, der danner mærkbare stress fibre tilsluttet VCL plaques i mindst én ende blev kvantificeret. Forsøgene blev gentaget tre gange. Mindst 23 celler blev scoret for hvert forsøg.

live-cell imaging af DLD-1 celler og omsætning analyse

DLD-1 celler transficeret med GFP-VCL og mCherry, ACTN1-mCherry, eller ACTN4-mCherry blev re-belagte på Matrigel-belagt, 35 mm glas-bottom retter (IWAKI, Tokyo, Japan) 24 timer efter transfektion. Ca. 16 timer efter fornyet udpladning blev cellerne observeret i mere end 2 timer ved total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi (Olympus). Før samling af billederne blev mediet udskiftet med en CO

2-uafhængig medium (Life Technologies) suppleret med 10% FBS og 4 mM L-glutamin. Billederne blev taget som en ramme hvert minut i 120 minutter. Det afbildede adhæsioner passer til kriterierne i, at de blev lokaliseret til et udragende lamellipodia. En sekvens af kymographs blev opnået under anvendelse ImageJ software. Den time-lapse ændring i fluorescensintensitet af GFP-VCL blev plottet hjælp af Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA), og satserne for fokal vedhæftning forsamling, stabilitet og demontering blev bestemt som beskrevet tidligere [28]. Disse målinger blev udført i 2-10 adhæsioner per celle i 8-10 celler for hver betingelse.

Matrigel invasion assay

invasion assay blev udført som tidligere beskrevet [36], med nogle modifikationer. DLD-1-GFP, DLD-1-ACTN1-GFP, og DLD-1-ACTN4-GFP-celler (2,0 x 10

5 celler i serum-frit DMEM) blev podet i det øvre rum af BD BioCoat Matrigel Invasion Chamber (BD Biosciences) og inkuberet med 10% FBS DMEM i nederste brønd og serum-frit medium i øverste kammer. Efter 26 timer blev cellerne fikseret med 3,7% formaldehyd i PBS i løbet af 30 minutter. Celler blev vasket med PBS, og invaderet GFP-positive celler på undersiden af ​​filtermembranen blev observeret ved konfokal mikroskopi. Cellerne i seks tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter fra dublerede kamre blev talt i tre uafhængige forsøg. SW480-celler blev transficeret med GFP eller ACTN1-GFP-plasmider. Efter 24 timer, celler (5,0 x 10

5 celler) blev podet i topkammeret og inkuberet med 10% FBS RPMI 1640 i bunden godt og serum-frit medium i øverste kammer.

Træk -down assay

GST-ZYX-N-proteiner bundet til glutathion Sepharose 4B blev inkuberet med oprenset His-ACTN1 eller His-ACTN4 proteiner i bindingsbuffer (lysisbuffer plus 1,0% bovint serumalbumin [BSA]) i 2 h, vasket tre gange med bindingsbuffer, og bundne ACTNs blev analyseret ved SDS-PAGE. FLAG-ZYX-fulde og FLAG-ZYX-C-proteiner bundet til anti-FLAG M2 affinitet gel blev blandet med renset His-ACTN1 eller His-ACTN4, inkuberes i 2 timer i IP buffer, og bundne ACTNs blev analyseret. Mængden af ​​aktiv RhoA blev kvantificeret i pull-down-analyser med GST-Rhotekin-RBD, som tidligere beskrevet [36]. De signalintensiteter blev målt ved hjælp af ImageJ software.

Statistisk analyse

For multiple sammenligninger,

P

værdier blev genereret ved envejs variansanalyse (envejs ANOVA) ved anvendelse af Dunnetts test for multiple sammenligninger. For to gruppe-analyser, Students

t

-test blev anvendt. Analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 6 software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA).

Resultater

ACTN1 og ACTN4 udtryk i kolon kræftceller

ACTN4 blev rapporteret at forbedre cellemotilitet og fremme lymfeknudemetastase af colorektal cancer [13]. Det er dog ikke klart, om disse virkninger tilskrives ACTN4 isoformspecifik funktioner, eller om ACTN1 klassisk isoform kan fremkalde kræft fænotyper som ACTN4 gør. Vi kvantificerede først de relative ekspressionsniveauer af endogene ACTN1 og ACTN4 proteiner i flere coloncancer-cellelinjer under anvendelse af oprensede rekombinante proteiner som eksterne kontroller (Fig 1A). ACTN4 ekspression var højere end for ACTN1 i alle celler, bortset DLD-1-celler. DLD-1-celler udtrykte ACTN4 ved en lav, men lignende, niveau end ACTN1 (Fig 1B). Således, for at tydeliggøre forskellen funktion ACTN1 og ACTN4, vi brugte DLD-1 celler fordi virkningerne af ektopisk udtryk eller dæmpning af ACTNs var påviselige.

(A) Western blot analyse af ACTN1, ACTN4, og actin i human tyktarmskræft cellelinjer. ACTN1 og ACTN4 protein niveauer er målt i sammenligning med rekombinant His-tag ACTN1 og ACTN4 proteiner anvendt som eksterne standarder. Actin blev anvendt som en loading kontrol og oprenset kanin-skeletmuskel actin blev anvendt som en ekstern standard. (B) båndintensiteter blev kvantificeret, og molforholdet mellem ACTNs blev beregnet og repræsenteret som mol-% mod actin. Dataene repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg.

Differential roller ACTN1 og ACTN4 i dannelsen af ​​fokale sammenvoksninger

ACTN1 og ACTN4 udtryk i DLD-1 celler blev bragt til tavshed ved siRNA (fig 2A). ACTN1 knockdown faldt antallet af stress-fibre og fokale sammenvoksninger. Imidlertid ACTN4 knockdown uventet forøget stress fibre og fokale adhæsioner (Fig 2B-2D). Disse resultater viser, at både ACTN1 og ACTN4 er involveret i dannelsen af ​​stress fibre og fokale adhæsioner i DLD-1 celler, men klart i modsatte måder: ACTN1 forbedrer det, mens ACTN4 undertrykker det. De kontrasterende roller ACTNs blev også observeret ved ektopisk udtryk for ACTN1-GFP og ACTN4-GFP i DLD-1 celler (Fig 2E). ACTN4 overekspression undertrykte dannelsen af ​​stress fibre og fokale sammenvoksninger (Fig 2F-2H). På den anden side, ACTN1 overekspression inducerede udvikling af stress fibre og fokale adhæsioner.

(A) ACTN1 og ACTN4 ekspression blev bragt til tavshed af siGENOME SMARTpool siRNA i DLD-1-celler. Effektiv knockdown blev bekræftet ved Western blotting under anvendelse ACTN isoform-specifikke antistoffer. Den pilespids angiver endogene ACTN1. Stjernen angiver en ikke-specifik krydsreagerende band. (B) Celler transficeret med de viste siRNA’er blev farvet for vinculin (VCL) og F-actin og observeret ved konfokal mikroskopi. Pilene og pilespidser angiver fokale sammenvoksninger og stress fibre hhv. Scale bar = 10 um. (C) Procentdelen af ​​siRNA-behandlede celler, der danner stress fibre tegnes. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af tre uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

0,01. (D) De fokale vedhæftning numre pr celle af siRNA-behandlede celler blev afbildet. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af 71 celler til kontrol, 73 celler til si-ACTN1 celler og 55 celler til si-ACTN4 celler. *

P

0,05. (E) Forbigående ekspression af ACTN1-GFP og ACTN4-GFP i DLD-1-celler blev bekræftet ved western blotting under anvendelse ACTN isoform-specifikke antistoffer. (F) GFP, ACTN1-GFP, og ACTN4-GFP blev udtrykt i DLD-1-celler, som derefter blev farvet for VCL og F-actin og observeret ved konfokal mikroskopi. Pilene og pilespidser angiver fokale sammenvoksninger og stress fibre hhv. Scale bar = 10 um. (G) De procentdele af transficerede celler, der danner stress fibre tegnes. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af tre uafhængige forsøg. TFX indikerer transfektion. **

P

0,01. (H) De fokale vedhæftning numre pr celle af celler, der udtrykker GFP, ACTN1-GFP, og ACTN4-GFP blev afbildet. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af 130 celler for GFP, 52 celler til ACTN1-GFP og 73 celler til ACTN4-GFP. *

P

0.05.

Major signalmolekyler, der sender information fra vedhæftning plaques til actin stress fibre omfatter myosin II, FAK, SRC kinaser, og Rho familie GTPaser. Således har vi gennemgået de proteiner, der er involveret i dannelsen af ​​fokale sammenvoksninger ved western blotting i celler, hvor ACTN ekspression blev bragt til tavshed af siRNA (S1 Fig). Phosphorylering af myosin regulatoriske lette kæder (MRLC) på threonin 18 og serin 19, og tyrosinphosphorylering af FAK og SRC blev ikke ændret. RhoA aktivitet blev reduceret specifikt i ACTN1 siRNA-behandlede celler. Selv fald i myosin II aktivitet i ACTN1 eller ACTN4 knockdown celler tidligere blev rapporteret [14,17,37], kunne vi ikke konstatere væsentlige ændringer i MRLC phosphorylering. Derudover observerede i RhoA aktivitet fald var beskeden (mindre end 40% fald for ACTN1 siRNA). Disse ændringer korrelerede ikke med fænotypiske ændringer i dannelsen af ​​stress fibre og fokale sammenvoksninger observeret i ACTN knockdown celler i figur 2B-2D og 2F-2H. Desuden aktiviteten af ​​regulatorer af spirende adhæsionsdannelse, dvs. FAK og SRC, var ens i kontrol- og ACTN1 /4 siRNA-behandlede celler, hvilket antyder, at ændringerne af stress fiber dannelse og fokale vedhæftning numre i respons på manipulering af ACTN ekspression kunne tilskrives den differentierede aktiviteter sene virkende molekyler i den trinvise modning af fokale sammenvoksninger såsom regulatorer af fokal kompleks stabilitet eller regulatorer af centripetal omdrejningspunkt vedhæftning forsamling.

ACTN4 forbedrer omdrejningspunkt vedhæftning omsætningshastighed

Næste, vi co-udtrykte ACTN1-mCherry eller ACTN4-mCherry med GFP-VCL og observerede VCL time-lapse billeder ved TIRF mikroskopi at spore montering og demontering af fokale sammenvoksninger. Som vist i figur 3A, S1 Movie, S2 Movie, og S3 Movie, omsætningshastigheden af ​​fokale sammenvoksninger i ACTN4-udtrykkende celler viste hurtigere end for kontrol eller ACTN1-udtrykkende celler. Den tid, der kræves for en enkelt adhæsion skal skilles ad var 34 min i gennemsnit i kontrol mCherry-udtrykkende celler, hvilket indikerer, at vedhæftningen afgrænset af GFP-VCL signal formodes at nå en moden fokal adhæsion. Levetiden for sådanne fokale adhæsioner kunne opdeles i tre trin; samling, stabilitet, og adskillelse (Fig 3A). Vi målte den nødvendige tid til hvert trin (Fig 3B-3D). I ACTN4-udtrykkende celler, den nødvendige tid til stabilisering og demontering var kortere end i kontrol eller ACTN1-udtrykkende celler. Disse resultater viser, at i ACTN4-udtrykkende celler, er levetiden af ​​fokale adhæsioner afkortet på grund af en accelereret demontering hastighed, hvilket antyder, at fokale adhæsioner destabiliseres i en isoform-specifik måde ved ACTN4 overekspression.

(A) mCherry , ACTN1-mCherry eller ACTN4-mCherry blev co-udtrykt med GFP-VCL og VCL tid bortfalder billede blev observeret af total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi at spore montering og demontering af fokale sammenvoksninger. Øvre paneler viser repræsentative kymographs af GFP-VCL fluorescens langs 5-um lange linjer trukket i områder af at udvide lamellipodia. Fluorescensintensitet i det øverste panel blev plottet mod tid og vist som en graf til bunden af ​​respektive kymographs. De omsætning faser af fokal vedhæftning forsamling, stabilitet og demontering præsenteres som røde stiplede linier i mCherry vektor graf. (B-D) Varighed af hver omsætning fase eksemplificeret i venstre graf i A blev analyseret og kvantificeret fra 51 adhæsioner for mCherry-udtrykkende celler, 57 adhæsioner til ACTN1-mCherry-udtrykkende celler og 64 adhæsioner til ACTN4-mCherry-udtrykkende celler . Data er præsenteret som boks og knurhår parceller med kasser, der repræsenterer 25-75. percentil rækkevidde og whiskers repræsenterer 10.-90. percentil rækkevidde. N. S., ikke signifikant, **

P

0.01.

ZYX rekruttering til fokale komplekser er svækket i ACTN4-udtrykkende celler

betragtning af, at fokale sammenvoksninger destabiliseres af ACTN4 udtryk i DLD-1 celler, vi hypotese, at ACTN4 hæmmer funktion af proteiner involveret i omdannelsen af ​​fokale komplekser til centripetale fokale sammenvoksninger. Især undersøgte vi lokalisering af ZYX, som er rapporteret til specifikt lokalisere i modne centripetale fokale sammenvoksninger [30]. Vi brugte PAX som en generel markør for fokale sammenvoksninger hele modning. Som vist i den øvre række i fig 4A, GFP-udtrykkende kontrol DLD-1 celler dannet PAX-positive plaques i den lamellare celle periferien. Disse plaques blev antaget at svare til både fokale komplekser og centripetale fokale sammenvoksninger. Blandt disse plaques, kan modne centripetale fokale adhæsioner skelnes baseret på ZYX colokalisering. De gennemsnitlige antal PAX- og ZYX-positive plaques i kontrol- celler var 0,14 og 0,073 per kvadrat mikrometer, (fig 4B og 4C). Derfor ca. halvdelen af ​​de fokale sammenvoksninger var ZYX-positive og blev derfor anset for at være modne i kontrol celler. ACTN1-GFP- og ACTN4-GFP-udtrykkende celler dannede lignende antal PAX plaques som observeret i kontrol- celler, hvilket tyder på, at ACTNs har ringe indflydelse på dannelsen af ​​fokale komplekser (Fig 4B). I modsætning hertil blev der både antallet og forholdet mellem ZYX-positive plaques i ACTN4-udtrykkende celler signifikant reduceret til 0,049 plaques /um

2 og 40%, sammenlignet med dem af kontrol og ACTN1-udtrykkende celler (Fig 4C og 4D). Desuden blev den fremherskende form af fokale adhæsioner i ACTN4-udtrykkende celler ændret til en rund, prik-lignende struktur i modsætning til de aflange centripetale adhæsioner, der ofte blev observeret i kontrol og ACTN1-udtrykkende celler (se pile i fig 4A, bund række). Ændringen i form blev afspejlet i størrelsen af ​​PAX-positive plaques, der blev mindre i ACTN4 udtrykker celler (Fig 4E). Disse resultater viser, at fokale komplekser ikke kan nå de modnede centripetale fokale adhæsioner i ACTN4-udtrykkende celler. Desuden ACTN4 specifikt inhiberer korrekt rekruttering af ZYX til grupper, komplekser, hvilket kan forklare de fænotypiske forskelle mellem ACTN1- og ACTN4-udtrykkende celler.

(A) GFP, ACTN1-GFP, og ACTN4-GFP ( vist med grønt) blev udtrykt i DLD-1-celler, som blev farvet for PAX (blå) og ZYX (rød) proteiner og afbildet under et konfokalt fluorescensmikroskop. Boxed regioner i den yderste venstre kolonne angiver den perifere lameller bruges til PAX og ZYX plak kvantificering. En serie af forstørrede billeder af indrammede områder er vist til højre. Pilene og pilespidser angiver PAX-positive og PAX /ZYX-double-positive plaques, hhv. Scale bar = 30 um. (B-C) antal PAX og ZYX plaques pr arealenhed af perifere lameller blev talt i GFP-, ACTN1- eller ACTN4-udtrykkende celler. Otte til seksten celler blev analyseret pr gruppe. Fejlsøjler henvise til standardafvigelser mellem celler. N. S., ikke signifikant, *

P

0,05, **

P

0,01. (D) Ratio af ZYX-positive til PAX-positive plaques, dvs. i alt plaque sammenvoksninger. Fejlsøjler henvise til standardafvigelser mellem celler. N. S., ikke signifikant, **

P

0,01. (E) PAX plaquestørrelse i GFP-, ACTN1- eller ACTN4-udtrykkende celler blev målt i mindst 171 adhæsioner fra 8-11 celler pr gruppe. Fejlsøjler henvise til standardafvigelser mellem celler. N. S., ikke signifikant, *

P

0,05, **

P

*

P

0,05. 0,01.