PLoS ONE: Crosstalk fra ikke-kræft Mitokondrier Kan hæmme tumor egenskaber metastatiske celler ved at undertrykke oncogen Pathways

Abstrakt

Mitochondrial-nucleus cross foredrag og mitokondrie retrograd regulering kan spille en væsentlig rolle i cellulære egenskaber. Transmitochondrial cybrid systemer (cybrids) er et fremragende redskab til at studere specifikke virkninger af ændrede mitokondrier under en defineret nukleart baggrund. Hovedparten af ​​undersøgelser under anvendelse af cybrid model fokuseret på betydningen af ​​specifikke mitokondrie-DNA variationer i mitokondriefunktionen eller tumor egenskaber. Men de fleste af disse varianter er godartede polymorfier uden kendt funktionel betydning. Objektivt ensretning mitokondriske defekter i cancerceller og etablere mitochondrier som potentielt mål anticancerlægemiddel, forståelse rolle funktionelle mitokondrier vende onkogene egenskaber under en cancer nuklear baggrund er meget vigtigt. Her analyserede vi potentialet tilbageførsel af onkogene egenskaber af en yderst metastatisk cellelinie med indførelsen af ​​ikke-kræft mitokondrier. Cybrids blev fastsat ved fusionering mitokondrier DNA forarmet 143B TK ρ0 celler fra en aggressiv osteosarcomcellelinie med mitokondrier fra godartede bryst epitelcellelinje MCF10A, moderat metastatisk brystcancer cellelinje MDA-MB-468 og 143B-celler. Trods den ensartede kræft nuklear baggrund, som observeret med mitokondrierne donorceller, cybrids med godartede mitokondrier udviste høje mitochondriale funktionelle egenskaber, herunder forøget ATP-syntese, iltforbrug og respiratoriske kæde aktiviteter sammenlignet med cybrids med kræft mitokondrier. Interessant nok kunne godartede mitokondrier vende forskellige onkogene egenskaber ved 143B TK

– celle herunder celleproliferation, levedygtighed under hypoxiske tilstand, anti-apoptotiske egenskaber, modstandsdygtighed over for anticancerlægemiddel, invasion, og kolonidannelse i blød agar, og

in vivo

tumorvækst i nøgne mus. Microarray analyse foreslog, at flere onkogene veje observeret i cybrids med kræft mitokondrier hæmmes i cybrids med ikke-kræft mitokondrier. Disse resultater tyder på den kritiske onkogene regulering af mitokondrie-nuklear cross talk og højdepunkter berigtigelse mitokondrier funktionelle egenskaber som en lovende mål i kræftbehandling

Henvisning:. Kaipparettu BA, Ma Y, Park JH, Lee TL, Zhang Y, Yotnda P, et al. (2013) Crosstalk fra ikke-kræft Mitokondrier Kan hæmme tumor egenskaber metastatiske celler ved at undertrykke oncogen Pathways. PLoS ONE 8 (5): e61747. doi: 10,1371 /journal.pone.0061747

Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 24 oktober, 2012; Accepteret: 11. marts 2013; Udgivet: 9. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Kaipparettu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af DOD (W81XWH-11-1-0292), National Institutes of Health /National Cancer Institute (NIH /NCI) (U54-CA149196 pilotprojekt) og DLD Cancer center pilotprojektet til B. Kaipparettu og NIH /NCI ( R01 CA-100023) tilskud til L. Wong. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræftceller tilpasse sig hypoxiske betingelser under progressiv tumorcellevækst ved at flytte byrden af ​​energimetabolisme fra oxidativ phosphorylering til glycolyse, benævnt Warburg virkning [1]. Reguleringen af ​​nukleare genekspression af mitokondrie-genomet, gennem ‘mitokondrier retrograd signalering’, gør det muligt for organeller til at koordinere deres funktion med kernen. Tumor celler fortsætte med at udnytte glycolysen som den vigtigste energikilde, selv i kultur under normoxiske [2], hvilket tyder på at der er sket mulige stabile genetiske eller epigenetiske ændringer i kræftceller. Desuden kan kræft mitokondrier uden påviselige genetiske ændringer transmittere onkogene signaler til nucleus og initiere mitokondriel retrograd regulering fører til tovejskommunikation mellem de to genomer [3].

For at undersøge den specifikke mitokondriske bidrag til tumor egenskaber, skal effekten af ​​nukleare gener udelukkes. Transmitochondrial cybrid system er en glimrende metode til at nå dette mål [4] – [9]. Flere undersøgelser brugt denne spændende teknologi meste at vise den funktionelle og patogene betydning af specifikke mitokondrie-DNA (mtDNA) mutationer eller varianter [5], [10]. The mtDNA er kendt for at mutere ofte i en række forskellige cancere, men de fleste af disse mtDNA ændringer, undtagen et par, er uden kendt funktionel betydning og kan simpelthen afspejle den genomiske instabilitet af tumorceller. Selv uden tilstedeværelse af kendte skadelige mtDNA mutationer, har undersøgelser vist, at metastatiske mitokondrier kan forbedre tumor egenskab af en cancercelle og gøre dem metastatisk [9], [11]. Men fra et terapeutisk synspunkt, for at målrette syge mitokondrier, er det vigtigt at vide, om ikke-kræft funktionelle mitokondrier kan vende den onkogene egenskab af metastatiske celler. Hvis ja, kan målrette syge mitokondrier eller afhjælpe den funktionelle defekt af normale mitokondrier give en kritisk druggable område for kræftbehandling. I denne undersøgelse har vi bedt et interessant spørgsmål, om ikke-kræft mitokondrier kan vende onkogene egenskaber en aggressiv kræft celle. Under en defineret kræft nuklear baggrund, vi sammenlignet mitokondrier fra ikke-kræft, moderat metastatiske bryst celler i et stærkt metastatisk nuklear baggrund med mitokondrier fra yderst aggressiv kræftcelle som kontrol. Selv under den samme nukleare baggrund, kunne mitokondrier fra ikke-kræftceller hæmme flere onkogene veje, vende de onkogene egenskaber og forbedre terapeutiske respons af kræftcellerne. Dette understreger betydningen af ​​mitokondrierne som en kritisk regulator af cellulær kræft ejendom og et potentielt mål for anticancer-terapi.

Materialer og metoder

Etik Erklæring om dyreforsøg

Alle dyr Reglerne blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Baylor College of Medicine og udført i overensstemmelse med NIH retningslinjer for etisk behandling af dyr.

Cybrids

Immortaliserede ikke-kræft brystepitelceller MCF10A celler , brystcancer MDA-MB-468 celler og metastatisk osteosarkom-afledte 143B TK

– celler (143B) blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). En detaljeret protokol for generering af

ρ

0

celler og cybrids har for nylig offentliggjort [3], [6], [8]. Kort fortalt mtDNA depleteret 143B ρ

0 celler blev anvendt som den nukleare donor. Til generering cybrids, mitokondriske donorceller (MCF10A, MDA-MB-468 og 143B TK) blev udskrællet af natten actinomycin-D behandling og fusioneres med den 143B ρ

0 celler ved anvendelse 45% polyethylenglycol (MW 1450; Sigma kat P-5402) i 60 sekunder. En dag efter fusion blev celler dyrket i selektionsmedium med bromdeoxyuridin (BrdU), men uden uridin [3], [12]. Ubrændt kontrol 143B ρ

0-celler ikke kunne overleve uden uridin og mitokondrier donor celler blev dræbt af BrdU. Cybrids indeholder mitokondrier afledt MCF10A, MDA-MB-468 og 143B celler med 143B ρ

0 celler som nuklear baggrund er navngivet som 10A /143B, 468 /143B og 143B /143B cybrids hhv.

Kvantificering og sekvensanalyse af mtDNA og Validering af Nuclear DNA

Totalt genomisk DNA blev ekstraheret ved phenol /kloroform metoden og 16,6 kb mitokondrie-genomet blev forstærket af 24 par af overlappende primere som offentliggjort før [13] – [ ,,,0],15]. qPCR blev anvendt til at kvantificere mtDNA kopi nummer for at kontrollere

ρ

0

tilstand og at kvantificere mtDNA indhold i cybrids ifølge offentliggjorte procedurer [16], [17]. Kun cybrid kloner indeholdende sammenlignelige mtDNA kopi antal blev anvendt til eksperimenter. Hele genomet mtDNA og reference nuklear DNA-sekvensanalyse blev udført ved anvendelse BigDye terminator (version 3.1) cyklus sekventering reagenskit på en ABI 3730XL DNA Analyzer (Foster City, CA). Resultaterne af DNA-sekvenser blev sammenlignet med offentliggjorte Cambridge referencesekvens fra https://www.mitomap.org. Nuklear kilde til cybrids blev bekræftet ved genotypebestemmelse.

reaktive oxygenspecies (ROS) Produktion

Cellerne blev udsået og dyrket i glucose eller galactose medium i 24 timer i plader med 24 brønde (2 × 10

4 per brønd). ROS produktion blev målt 30 minutter efter lastning med 5 mmol /l 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) [18]. Efter vask med PBS-buffer blev cellerne trypsiniseret og suspenderet i PBS-puffer. Fluorescens målinger ved excitation og emission bølgelængder på 485 og 535 nm, blev udført med en Tecan s Infinite M200® mikropladelæser (Mannedorf, Schweiz).

ATP syntese

ATP syntese var målt ved luciferin /luciferase assay [3]. Celler blev inkuberet med 5 mmol /l malat plus 5 mmol /l glutamat (kompleks I-drevet substrater), eller med 10 mmol /l succinat (kompleks II-drevet substrat) plus 2 pg /mL rotenon (kompleks I inhibitor), og 0,2 mmol /L ADP i 3 minutter i nærvær eller fravær af 10 pg /ml oligomycin. Hastigheden for oligomycin følsomme ATP-syntese blev analyseret ved anvendelse Tecan uendelige M200® og udtrykt som nmol ATP produceret /min /mg protein.

Western blot-analyse

Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE på en 12% gel. Specifikke antistoffer anvendes til Western Blot-analyse og kemiluminescens blev detekteret ved anvendelse af peberrodsperoxidase-mærket som sekundært antistof (Bio-Rad, CA). Mitokondrielle proteiner: ATP syntase subunit alfa (F1α), Core 2, FeS underenhed (Ip), COXII, ND6, og Porin (alle fra Mitoscience, OR). Apoptotiske proteiner: spaltet caspase 3 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (Cell Signaling, MA). β-actin og Porin blev brugt som lastning kontrol for nuklear og mitokondrie kodede proteiner henholdsvis [3].

Cell Proliferation Assay

Cell proliferation blev målt til normoxi (21% O

2 ) eller hypoxi tilstand (1% O

2) ved anvendelse kolorimetrisk assay baseret på måling af BrdU-inkorporering (4 timer) under DNA-syntese, ifølge fabrikantens protokol (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland).

TUNEL assay

Apoptose blev analyseret ved TUNEL-assay under anvendelse af deadend ™ fluorometrisk TUNEL-systemet (Promega, WI, USA) ifølge producentens anvisninger [19], [20].

Anticancer Drug Behandling og MTT Assay

Efter natten over dyrkning af 5 × 10

3 cybrids i en 96 brønd plade blev cybrids behandlet med køretøj, doxorubicin (0,1 uM) under normoxisk (21% O

2) og hypoxiske (1% O

2) betingelser for en anden 24 timer. Cellelevedygtighed blev analyseret ved MTT-assay ved anvendelse af Tecan Infinite M200 ifølge publiceret protokol [21], [22].

kolonidannelse i blød agar

Six-brønds plade med 0,5% agar i DMEM medium som det nederste lag blev anvendt til blød agar-kolonidannelse assayet. For hver brønd, 5 x 10

3 cybrids suspenderet i DMEM-medium med 0,35% agarose blev udpladet som toplag og inkuberet ved 37 ° C i 3-4 uger. Kolonier blev farvet med 0,005% Crystal violet og tælles. Antallet af kolonier for hver cybrid blev afbildet som middelværdi ± SD.

Matrigel ™ invasion assay

invasiv vækst evne cybrids blev kvantificeret under anvendelse af BD BioCoat ™ Matrigel ™ invasion Chamber (6- brønd) (Becton Dickinson Biosciences, MA, USA) ifølge producentens protokol [23]. Efter trypsinisering, 5 × 10

4-celler i 0,5 ml medium blev tilsat til hver brønd i tre eksemplarer. Efter 24 timer blev cellerne invaderet til det nedre kammer fikseret og farvet med 100% methanol og 1% toluidinblåt. Antallet af besatte celler blev talt ved hjælp af et mikroskop, og procentdele af Matrigel matrix-invaderende celler blev beregnet i forhold til den ikke-coatede kontrol membran.

Microarray Gene Expression Analyse og validering af qPCR

Genekspression profil 10A /143B og 468 /143B cybrids blev sammenlignet under anvendelse Affymetrix human U133 Plus 2.0 arrays i tre eksemplarer i henhold til producentens anvisninger. Kort beskrevet RNA fra 10A /143B og 468 /143B cybrids blev ekstraheret i tre eksemplarer og 5 ug af total RNA blev anvendt til første og anden streng cDNA syntese. Den microarray hybridisering blev udført i Affymetrix U133 Plus 2.0 microarray chips på Affymetrix F450 fluidics station ved hjælp af EukGE-WS2v5_450 protokol og scannes med en Affymetrix GeneChip 7 G-scanner (Affymetrix, Santa Clara, CA). Dataene blev analyseret ved den statistiske core facilitet på Dan L. Duncan Cancer Center ved Baylor College of Medicine. Gener blev defineret ændret betydeligt mellem de to cybrids med t-test P 0,01, fold forandring 2 eller 0,5; globale forskelle oversteg langt chance forventet. Den genekspression datasæt blev yderligere underkastet pathway signatur analyse for at finde formodede differentielle pathway aktivering begivenheder. Pathway-associeret gen underskrifter blev defineret, ved hjælp af offentlig data: p53 signatur bestod af kanoniske bundne og up-regulerede p53 gen mål, som katalogiseret i p53 IARC databasen (https://www-p53.iarc.fr/TargetGenes.html ), og de andre gen underskrifter undersøgt tidligere blevet katalogiseret og beskrevet [24]. Hjælp af det sæt af unikke gener repræsenteret i datasættet (hvor flere prober omhandlede det samme gen, blev proben med den højeste variabilitet bruges til at repræsentere genet), og med udtrykket værdier centreret på middelværdien tværs prøver, den gennemsnitlige udtryk for gener “op” i signaturen blev trukket fra gennemsnittet for de gener “ned”, med henblik på at beregne en oversigt vej score for en given signatur og prøve profil. For tilfældigt udvalgte gener, blev mRNA ekspression forskelle observeret i microarray analyse yderligere valideret af q-RT-PCR ved anvendelse af primere, der er beskrevet i tabel S1.

In vivo

Tumor Growth Analysis

Tumorvækst blev analyseret for cybrids blev udført under anvendelse nu /nu nøgne hunmus (Charles River Laboratories, MA, USA). Fire mus blev anvendt for hver cybrid gruppe. Omkring 1,5 millioner celler af hver af de samme cybrids blev blandet med Matrigel (300 ul cellesuspension i PBS med 300 ul reduceret vækstfaktor Matrigel), og injiceret i både venstre og højre flanker af dyrene under anvendelse af en 26 gauge nål. Tumorstørrelse blev målt to gange om ugen med skydelære og tumorvolumen blev beregnet efter formlen LW

2/2 (L og W repræsenterer længden og bredden af ​​tumorer) [25]. Eksperimentet blev afsluttet, når middelværdien af ​​tumorvolumen i nogen af ​​kontrolmusene (143B /143B) oversteg 1,0 cm

3. Ved slutningen af ​​forsøget blev musene aflivet ved eksponering for CO

2 og primære tumorer blev udskåret og vejet.

Statistik Salg

Resultaterne blev præsenteret som middelværdi ± SD eller SEM . Statistisk analyse blev udført under anvendelse af

t

test og ANOVA. P-værdi. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater og Diskussion

cybrid teknologi beskrives her tillader undersøgelse af effekt mitokondrier afledt af kræft eller ikke-kræftceller på mitokondriefunktionen og onkogene egenskaber i en fælles nuklear baggrund. Ikke alle celler kan overleve under mitokondrier forarmet betingelser. Her brugte vi 143B TK

-. Celler som nuklear donor, som er en af ​​de mest godt karakteriseret cellelinie til cybrid undersøgelser og den første etableret human ρ0 cellelinie

Ikke-kræftceller og deres Cybrids Exhibit Bedre mitochondriale Funktionelle egenskaber sammenlignet med Cancer mitokondrier

Vi analyserede først mitokondriefunktionen af ​​forældrenes mitokondrie donor cellelinjer og deres cybrids. Eftersom lækagen af ​​ROS er en indikation af mangelfuld mitokondriefunktionen blev ROS produktion analyseret i alle parentale cellelinjer under anvendelse celle-permeable probe, DCFH-DA. Under metabolisk stress, såsom i fravær af glucose cellerne tvunget til udelukkende afhænge af mitokondriel oxidativ phosphorylering til energiforsyning [22]. Hvis der derfor er defekt i mitokondrie respiration cellerne forventes at producere øget mængde af ROS i galactose-medium [25]. Som forventet begge cancercellelinier (143B og MDA-MB-468) fremstillet signifikant højere (p 0,05) ROS i galactose-medium sammenlignet med glucose-medium. Der var imidlertid ingen signifikant stigning i ROS produktion for MCF10A celler i galactose-medium (fig. 1A). Vi analyserede derefter cybrids og opnåede en lignende reaktion som observeret med stamcellerne. For cybrids med mitokondrier fra godartede MCF10A celler, var der ingen signifikant stigning i ROS niveau i galactose medium. Men cybrids med kræft mitokondrier viste signifikant forøget ROS niveau i galactose medium (fig. 1B). For yderligere at undersøge stedet for svigt i den respiratoriske kæde er ansvarlig for forringet oxidativ phosphorylering, blev ATP-syntese satser målt i nærvær af komplekse I substrater (glutamat plus Malate) eller kompleks II substrat (succinat). Som vist i fig. 1C, ATP-syntese signifikant højere i benigne celler sammenlignet med cancerceller i nærvær af komplekse I (p 0,01) eller komplekse II substrater (p 0,01). Som forventet cybrid celler viste også lignende resultater for ATP-syntese som observeret med de parentale celler. I nærværelse af enten komplekse I substrater eller komplekse II substrater, blev ATP-syntese sats markant forøget i 10A /143B cybrids sammenlignet med 143B /143B og 468 /143B cybrids (p 0,01) (figur 1D.). Disse resultater antyder, at cancer mitokondrier sandsynligvis har ændret funktion påvirker flere komplekser i respirationskæden. Western blot analyse viste, at sammenlignet med cybrids med kræft mitokondrier, blev mtDNA-kodede mitokondrie kompleks I ND6 underenhed af mitokondrie NADH dehydrogenase protein steget betydeligt i MCF10A /143 cybrids men ingen forskel i nukleare kodede proteiner som F1α, Core2 og Ip (fig. 1E). Således indførelse af mitokondrier fra ikke-kræft MCF10A kunne i det mindste delvist øge ekspressionen af ​​mtDNA kodet respiratoriske kæde proteiner, således, berigtige den reducerede mitokondrielle funktion i 143B cancercelle.

(A) ROS-produktion i parentale celler . Efter Celler blev dyrket i DMEM-glucose eller DMEM-galactose-medium i 24 timer og ROS blev målt under anvendelse DCFH-DA fluorescerende farvestof. Data, udtrykt som DCF-fluorescens /mg protein. (B) ROS-produktion i cybrid celler. (C) mitokondrier ATP syntese sats i forældrenes celler. ATP-syntese var drevet af kompleks I-substrater (glutamat plus malat) eller kompleks II substrat (succinat) i nærværelse af komplekset I inhibitor (rotenon). Satserne for ATP-syntese er udtrykt som nmol ATP /min /mg protein. (D) mitokondrier ATP syntese sats i cybrids. (E) Western blot-analyse af repræsentative proteinunderenheder af mitokondrierne respiratoriske komplekser i cybrids. β-actin og porin blev brugt som lastning kontrol for nuklear og mitokondrier proteiner hhv. (* = P 0,05).

Ikke-kræft Mitokondrier kan vende den onkogene Egenskaber metastatisk Cell

For at forstå den funktionelle betydning af mitokondrie retrograd regulering fra ikke-kræft mitokondrier på de tumorigene egenskaber for en metastatisk kerne, vi sammenlignede cybrids til forskellige onkogene egenskaber.

Cell Proliferation og levedygtighed under hypoxiske betingelse

i solide tumorer, kræftceller har kapacitet til at formere sig og opretholde levedygtigheden under hypoxiske betingelser på grund af den reducerede vaskularisering og nedsat blodforsyning i tumorvæv. Vi sammenlignede celleproliferation i cybrids under hypoxiske betingelser. Interessant, selv under den ensartede nukleare baggrund, cybrids med ikke-kræft mitokondrier viste signifikant nedsat celledeling i hypoxiske betingelser (Fig. 2A).

(A) Procent af celleproliferation i cybrids under hypoxisk tilstand (1% O

2 til 4 timer) i forhold til normoxisk tilstand (21% O

2). DNA-replikation blev vurderet ved anvendelse af et ELISA-baseret BrdU-inkorporering assay. (B) Procentdelen af ​​cybrids invaderet i en Matrigel invasion assay. (C) Fase kontrast billede af forankringen uafhængige vækst i cybrids med kolonidannelse assay i blød agar. (D) middel (± SD) antal kolonier med hver cybrids. (E) Anticancer lægemiddelresistens af cybrids: Procent af levedygtige cybrid celler detekteret MTT assay efter behandling med doxorubicin i normoxisk (krydset bar) og hypoxiske (forgudede bar) betingelser for 24 timer. (B) Western blot-analyse af apoptotiske markører spaltet caspase 3 og PARP-1 efter behandling med vehikel eller doxorubicin (DOX) i 24 timer. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (* = P 0,05, 10A /143B vs 143B /143B og 468 /143B;

† = P 0,05, 468 /143B vs 143B /143B og

# = P 0,05, 10A /143B doxorubicin efter normoxisk vs hypoksisk tilstand).

In vitro

Tumorgenetisk Properties

evnen til at invadere celle-matrix og vokse under forankring uafhængige forhold er nogle af kræft træk . Den nukleare donor 143B osteosarcomcellelinie er yderst tumorigene og metastatiske i naturen. Vi analyserede først invasionen potentiale cybrids vha Matrigel invasion kammer. Som vist i fig. 2B, Matrigel invasion assay foreslog signifikant lavere invasion indeks for 10A /143B cybrids sammenlignet med cybrids med kræft afledt mitokondrier. Vi analyserede derefter forankring uafhængige vækstpotentiale ved hjælp af

in vitro

kolonidannelse assay i blød agar. Selv under ensartet metastatisk nukleare baggrund, cybrids indeholder ikke-kræft mitokondrier dannet betydeligt færre kolonier i forhold til cybrids med kræft mitokondrier. Antallet af kolonier i cybrids med moderat metastatisk MDA-MB-468 celler var i mellem 10A /143B og 143B /143B cybrids (Fig. 2C og D).

Modstand mod Anticancer Drug Therapy

Modstand mod celledød fra anticancerlægemiddel er en af ​​de hyppigste årsager til svigt kræftbehandling. De fleste af de konventionelle kemoterapeutiske midler dræber via mitokondrielle pathway af apoptose. Da doxorubicin ofte anvendes til behandling af faste tumorer, herunder bryst-, lever og knogletumorer, blev cellelevedygtigheden efter anticancer lægemiddelbehandlinger analyseret i cybrids under normoxiske og hypoxiske betingelser. Cellernes levedygtighed analyse foreslog, at sammenlignet med 143B /143B og 468 /143B cybrids med kræft mitokondrier, cybrids indeholder ikke-kræft MCF10A mitokondrier havde signifikant øget celledød efter anticancer narkotika behandling i både normoxiske og hypoxiske betingelser (Fig. 2E). Den øgede celledød efter anticancer-terapi blev yderligere bekræftet ved forøget ekspression af apoptotiske markører aktiveret caspase 3 og kløvet PARP i doxorubicin behandlet 10A /143B cybrids (fig. 2F). Disse resultater tyder på, at mitokondrielle egenskaber spiller væsentligt bidrag til svar på anticancer medicinsk behandling.

In vivo

tumorvækst

in vitro

analyser kraftigt foreslog inhiberingen af ​​onkogene egenskaber af aggressive 143B-celler ved indføring af ikke-kræft mitokondrier. Disse resultater blev yderligere bekræftet ved hjælp af en

in vivo

nøgne mus model. Som forventet, alle cybrids dannede tumorer under den meget tumorgene og metastatiske 143B nukleare baggrund. Men som observeret med

in vitro

kolonidannelse assay, tumor vækst blev hæmmet betydeligt i 10A /143B cybrids indeholder ikke-kræft mitokondrier i forhold til 143B /143B cybrids med kræft mitokondrier (Fig. 3A). Tumorvægt og størrelse var signifikant lavere i cybrids med mitokondrier afledt af benigne MCF10A celler (fig. 3B og C). Som observeret i

in vitro

kolonidannelse assay, tumor størrelse og vækst i cybrids med mitokondrier afledt af moderat kræft MDA-MB-468 brystcancerceller var i mellem 143B /143B cybrids og 10A /143B cybrids . Alt i alt, vores

in vitro

in vivo

undersøgelser tyder på, at mitokondrier-nukleare krydstale fra ikke-kræft mitokondrier kan hæmme tumor egenskaber for en yderst metastatisk celle.

(A) Fotografi af tumorerne dannet med forskellige cybrids efter implantation i til nøgne mus. (B) Middelværdien (SEM) vægt af tumorerne efter deres kirurgisk fjernelse. (C) Middelværdien (± SEM) volumen af ​​

in vivo

tumorvækst på forskellige dage efter omplantning af cybrids. (* = P 0,05 t-test i forhold til 143B /143B og # = P 0,01 i ANOVA).

Mitochondriel Retrograd signalering fra Benign Mitokondrier Undertryk Adskillige oncogen Pathways

Mitokondriel retrograd signalering er en vej for kommunikation fra mitokondrier til kernen under normale og patofysiologiske forhold. For at forstå den mitokondrielle retrograd regulering af nukleare gener ved kræft og ikke-kræft mitokondrier, brugte vi microarray analyse. Genekspression profiler blev sammenlignet og bioinformatically analyseret onkogene veje for cybrids med mitokondrier fra godartet bryst epitel (10A /143B) og brystkræft celle (468 /143B). Interessant, selv under de samme nukleare baggrund, 6478 probe sæt repræsenterer 4071 unikke gener blev ændret betydeligt i 10A /143B cybrids sammenlignet med 468 /143B cybrids (Fig. 4A). Blandt væsentligt ændrede gener, 4794 probe sæt repræsenterer 2816 unikke gener fik opreguleret og 1684 probe sæt repræsenterer 1255 unikke gener nedreguleret i cybrids med MCF10A mitokondrier. Yderligere analyse af onkogene veje tyder på, at mange onkogene veje herunder RAS, HER2, SRC og P53 veje er nedreguleret i MCF10A /143B cybrids med ikke-kræft mitokondrier (Fig. 4A). Nogle af tumorsuppressorgener herunder RB1, PTEN og VHL steget betydeligt i MCF10A /143B cybrids med godartede mitokondrier. Microarray data for tilfældigt udvalgte gener blev valideret af q-RT-PCR-analyse (fig S1). Således microarray analyse tyder på, at selv under en meget aggressiv cancer nukleare baggrund, kan mitokondrier-nukleare krydstale fra ikke-kræft mitokondrier undertrykke flere onkogene veje og gøre cellerne mindre kræft.

(A) Sammenligning af 10A /143B vs 468 /143B cybrids med definerede gener signifikante med t-test P 0,01, fold forandring 2 eller 0,5. Gul, højere udtryk. Gener valideret af RT-PCR er angivet. (B) Pathway signatur analyse af udtrykket datasæt viser formodede differentielle vej aktivering niveauer (signatur navne i kursiv angiver forskelle mellem prøven grupper med P 0,01, t-test). Rød, højere udledes pathway signatur aktivitet. Pathway underskrifter blev defineret ved hjælp af tidligere undersøgelser, der er angivet i parentes [24].

Selv i mere end 3 årtier, er tumorer betragtes som sygdomme i muterede onkogener, alternative “metaboliske” modeller også er blevet foreslået til spille en rolle i udviklingen og progressionen af ​​cancer. Mitokondriel dysfunktion betragtes som en af ​​de mest almindelige og konsistente fænotyper af cancerceller. I de senere år er et stigende strøm af dokumenter forbinder kræft gener med energi metabolisme [26]. Talrige forskelle i den molekylære sammensætning af den mitokondriske indre membran mellem normale celler og cancerceller er også blevet rapporteret. Analyse af den indre membran lipid sammensætning af forskellige tumor mitokondrier har indikeret forhøjede niveauer af kolesterol, varierende total phospholipid indhold, og /eller ændringer i mængden af ​​individuelle phospholipider i forhold til normale kontroller [27]. Vores resultater viste, at selv om gener, der koder mest mitokondrielle proteiner er placeret i kernen, indførelse af mitochondrier afledt af ikke-cancercelle til en cancer nuklear miljø resulterede i suppression af onkogene veje og ændrede cancer egenskaber. Adskillige rapporter postulerede, at ROS kan være formidler af de defekte mitokondrier i kræft [11], [25]. Imidlertid kan andre end ROS faktorer fra kræft mitokondrier også spille en rolle i tumoren egenskaber. Det er også muligt, at som observeret med cellulære omprogrammering, mitokondrier fra forskellige cellulære miljø kan være blevet programmeret på bestemt måde, og det kan bære over nogle af dens virkning til den næste generation, uanset den nukleare baggrund. Nylige undersøgelser har antydet, at ændrede mitokondrier kan påvirke epigenetiske modifikationer i kernegener herunder DNA-methylering [28], [29]. Sådanne epigenetiske ændringer, herunder DNA og kromatin ændringer og signalering gennem små RNA kan bidrage til opretholdelsen af ​​mitokondrier medierede onkogen transformation i generationer.

De fleste af de cybrid undersøgelser fokuserede på somatiske mutationer i mitokondrier genom og dets funktionelle betydning. Der er blevet udført mange eksperimenter for at undersøge rollen af ​​specifikke mtDNA mutationer i cancer [3], [30] – [36]. Selvom somatiske mtDNA ændringer er fælles træk af kræft, og nogle tyder på, at visse mtDNA mutationer rent faktisk spiller en funktion i udviklingen af ​​kræft, effekten af ​​kræft mitokondrier på tumorigenese stort set uklar [5], [25]. Vi har ikke observere nogen kendt patogen mutations forskel mellem 143B og MCF10A celler. Selv om de fleste af de mitochondrielle mutationer er individuelt ikke skadelig, er der en mulighed for, at kombination af forskellige mutationer kollektivt kan bidrage til stabiliteten protein og /eller retrograd signalering.

Resistance til celledød fra anticancerlægemiddel er en af ​​de hyppigste årsager til svigt kræftbehandling. De fleste af de konventionelle kemoterapeutiske midler dræber via mitokondrielle pathway af apoptose. Mitokondrie pathway af apoptose opfører sig som en kritisk fænomen, hvori der sker en hurtig, binær overgang fra et normalt fungerende celle til en hurtig gennemførelse af et program for celledød [37]. En nylig spændende undersøgelse foreslået, at forskellene i respons på kemoterapeutisk behandling kan skyldes forskellene i forbehandling i parathed af tumorceller til at undergå apoptose, en målbar egenskab, som de kalder “mitokondrie priming” [38]. Ifølge deres konklusion, differentiel ‘mitokondrie priming “er en vigtig mekanisme bag det terapeutiske indeks af konventionel kemoterapi [38]. Anti-cancer specifikt er rettet mod kræft celle mitokondrier er navngivet som “mitocans” [39] – [42].