PLoS ONE: Nuclear Receptor Expression og funktion i Human Lung Cancer Pathogenesis

Abstrakt

Lungekræft skyldes kombinationer af forskellige genetiske mutationer. Her, for at forstå relevansen af ​​nukleare receptorer (NRS) i onkogenet-associerede lungekræft patogenese, undersøgte vi ekspressionsprofilen af ​​hele 48 NR medlemmer ved hjælp QPCR analyse i et panel af humane bronchiale epithelceller (HBECs), som omfattede præcancer og tumorigene HBECs huser onkogene

K-ras

V12

og /eller

p53

ændringer. Analysen af ​​profilen afslørede, at oncogene ændringer ledsaget transkriptionelle ændringer i ekspressionen af ​​19 NR’er i præcancerøse HBECs og 15 NR’er ifølge den maligne progression af HBECs. Blandt disse peroxisomproliferatoraktiveret receptor gamma (PPARy), et NR valgt som proof-of-principle undersøgelse viste forøget ekspression i præcancerøse HBECs, som overraskende blev vendt, da disse HBECs erhvervet fuld

in vivo

tumorigenicitet . Især PPARy aktivering med thiazolidindion (TZD) behandling vendt forøget ekspression af pro-inflammatoriske cyclooxygenase 2 (COX2) i præcancerøse HBECs. I fuldt tumorigene HBECs med inducerbar ekspression af PPARy, TZD behandlinger inhiberede tumorcellevækst, clonogenecity, og cellevandring i en PPARy-sumoylation afhængig måde. Mekanistisk den sumoylation af ligand-PPARy faldt COX2-ekspression og forøget 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase ekspression. Dette antyder, at ligand-medieret sumoylation af PPARy spiller en vigtig rolle i lungekræft patogenese ved modulering prostaglandin metabolisme

Henvisning:. Kim J., Sato M, Choi JW, Kim HW, Yeh BI, Larsen JE et al . (2015) nuklearreceptor Expression og funktion i Human Lung Cancer Patogenese. PLoS ONE 10 (8): e0134842. doi: 10,1371 /journal.pone.0134842

Redaktør: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Korea, Republik

Modtaget: Februar 4, 2015; Accepteret: 15 juli 2015; Udgivet: August 5, 2015

Copyright: © 2015 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. The National Research Foundation Korea finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (NRF-2013R1A1A1A05005075 til YJ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

det nukleare receptor omfatter superfamilien 48 medlemmer af transkriptionsfaktorer, der er for det meste ligand-aktiverede og spille afgørende roller i diverse fysiologiske processer, herunder metabolisme, udvikling og differentiering i kroppen. Dysregulering af NR veje forårsager alvorlige kroniske sygdomme som diabetes [1-3], åreforkalkning [4, 5], og flere typer af kræft [6-8]. Ekspressionen af ​​hele NR superfamilien er blevet undersøgt i forskellige fysiologiske og patologiske tilstande, herunder cellulær differentiering modeller [9-12], mus anatomiske systemer [1], NCI60 panel af humane cancercellelinjer [6], og humane lunge cancercellelinier og patientprøver [7, 8]. Disse undersøgelser har afsløret, at delmængder af NR’er ikke kun forbundet med specificeret væv fysiologi, men er også relevante for funktionelle differentiering i specifikke cellulære slægter [13, 14]. Desuden den genetiske underskrift NR superfamilien eller af individuelle NR medlemmer er en prognostisk biomarkør for lungekræft, og nogle NR’er er druggable mål, der kan være farmakologisk udviklet sig til potentielle kræftbehandlinger [6-8, 15-19]. Faktisk flere linjer af beviser viser, at individuelle NR’er er forbundet med debut og udvikling samt behandling eller kemoforebyggelse af kræft. For eksempel overekspression af retinsyrereceptor alfa (RARa) på grund af dets fusion til PML (RARa /PML) og østrogenreceptor a (ERa) ekspression forårsager indtræden af ​​leukæmi og brystkræft progression henholdsvis [20-22]. Målretning ERa hjælp af selektiv østrogenreceptormodulator (SERM) tamoxifen eller raloxifen og blokade eller ablation af dihydrotestosteron (DHT), som er det stærkeste endogene ligand for androgenreceptoren (AR), er velkendte terapeutiske ordninger i kræft klinikker til behandling af tilsvarende cancere [19, 23-25]. Mens SERM’er er ofte blevet brugt til behandling af brystcancer eller endda klinisk evalueret som kemoforebyggende midler mod forekomsten af ​​brystcancer, en høj risiko for uterin og endometrium cancer incidens har tidligere [26, 27] blevet rapporteret. Ligeledes selv om anti-diabetiske narkotika TZD’er er i kliniske forsøg for lungekræft behandling, molekylær funktion af TZD-aktiverede PPARy er ikke blevet klart defineret endnu som en anti-tumorigen faktor i lungekræft, eller endda argumenteret som en tumor-fremmende faktor i andre typer af kræft, dvs. brystkræft og prostatakræft [28-30].

Vi har udviklet en præklinisk model involverer udødeliggjort normale humane bronchieepithelceller (HBECs), der kan være genetisk manipuleret med specifikke onkogene ændringer at studere lungekræft patogenese og udvikling af nye målrettede tilgange for tidlig diagnose, forebyggelse og behandling af lungekræft. For nylig har vi været i stand til at udvikle fuldt skred frem, og tumorigene modeller med HBECs baseret på manipulation af p53, KRAS, og c-myc [31]. Disse præcancerøse og fuldt tumorigene modeller giver et ideelt system til at undersøge den rolle af NR’er i lungekræft patogenese herunder preneoplasia og tumordannelse.

I denne undersøgelse har vi profileret mRNA ekspression af alle 48 NR’er i denne HBEC oncogene- induceret lungekræft patogenese model [32, 33]. Dette tillod os at identificere en nøglerolle PPARy i lungekræft patogenese. I en mekanistisk proof-of-principle undersøgelse fandt vi, at PPARy sumoylation er vigtig for den anti-tumorigene virkning TZD’er i lungekræft patogenese. Denne undersøgelse giver indsigt i en biokemisk ændring af PPARy, hvilket er nyttigt for forståelsen af ​​lungekræft patogenese og også angiver kraften i denne prækliniske system til at studere rolle NR’er i lungekræft patogenese og disse resultater skal være af klinisk translationel værdi.

Materialer og metoder

Cell kultur

som tidligere rapporteret, var normale humane bronchieepithelceller udødeliggjort af CDK4 og hTERT (HBEC-KT), efterfulgt af yderligere stabil indføring af onkogene ændringer, herunder K-ras

v12 overekspression, knockdown af p53 eller begge [31-33]. En række HBEC-knob inkluderet HBEC-KT, HBEC-KTZ, HBEC-KT + pSRZ + pLenti-

K-ras

v12

(HBEC-KTR

L ), HBEC KT + pSRZ-

p53

shRNA + pLenti-

LacZ

(HBEC-KT53), og HBEC KT + pSRZ-

p53

shRNA + pLenti-

K-ras

v12

(HBEC-KTR

L53), hvor pSRZ og pLenti repræsenterer stabile shRNA og lentivirusvektorer henholdsvis [31]. Immortaliserede HBECs og tumorigene HBEC kloner (C1 og C5) blev dyrket i K-SFM (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) suppleret med 50 ug /ml oksehypofyseekstrakt uden epidermal vækstfaktor (EGF) og RPMI suppleret med 10% føtalt bovint serum, henholdsvis.

Molekylær kloning og stabil cellelinie

Både PPARy og forstærket grøn fluorescens protein (EGFP) gener flankeret af internt ribosomalt indgangssted blev bicistronically konstrueret under styring af tetracyklin-inducerbar (Tet /til) cytomegaloviruspromotor af lentiviral vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Site-directed mutationer blev indført i både sumoylation sites (K79R og K367R for PPARγ1, K107R og K395R for PPARγ2) i PPARy. Lentivira fremstillet og transduceres ind tumorigene HBEC-C1-cellelinier. Yderligere screening proces blev udført for at vælge en HBEC-C1-PPARy klon, hvor både PPAR og EGFP udtryk er stramt reguleret ved tetracyclin behandling.

Immunblotanalyse

Et panel af udødeliggjort HBEC cellelinjer blev dyrket i nærvær eller fravær af PPARy agonist troglitazon eller pioglitazon i 48 timer og derefter totale cellelysater blev fremstillet som tidligere beskrevet [7]. Primære antistoffer til cellesignalering inkluderet for antistoffer mod p53 (sc-126, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), K-ras (sc-30, Santa Cruz), phospho-MEK1 /2 (# 9121, Cell Signaling teknologi, Beverly, MA, USA), MEK1 /2 (# 9122, Cell Signaling), COX2 (sc-19999, Santa Cruz), phospho-ERK1 /2 (# 9101, Cell Signaling), ERK1 /2 (# 9102, cellesignalering), β-actin (Ab6276, Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, UK), lamin A /C (sc-7292, Santa Cruz), og PPARy (# 2435, Cell signalering). Primære antistoffer for cellecyklusprogression inkluderet antistoffer mod cyclinD1 (# 2926, Cell Signaling), cyclin A (sc-239, Santa Cruz), p16

INK (sc-468, Santa Cruz), og p21

WAF1 ( OP64, Calbiochem, La Jolla, CA, USA).

cellevækst og kolonidannelse assayet

celletælling blev udført til måling celle vækstrespons. For celletælling assay blev to hundrede HBECs podet i plader med 96 brønde i et endeligt medium volumen på 100 pi per brønd, efterfulgt af troglitazon behandling ved koncentrationer på 3 pM i nærvær af 100 nM syntetisk RXR-ligand LG268. Celleantal blev talt på fem dage efter behandlingen. Relativ vækst% blev normaliseret for hver dosis af køretøj behandling. For kolonidannelse assayet blev fem tusinde HBEC celler splittet i 6-brønds plader og behandlet med PPARy eller PPARa-ligander. Kolonier blev farvet med methylenblåt efter 7 til 10 dage ligand behandling.

cellemigrationsassay

HBECs med inducerbar ekspression af vildtype-PPARy eller SUMO-PPARy blev podet i plader med 6 brønde og fuldt dyrket med 100% sammenflydning, efterfulgt af mitomycin C behandling til at undertrykke celleproliferation. Et sår blev dannet ved at ridse cellelag med steril pipettespids. Cellerne blev derefter inkuberet i RPMI 1640 medium indeholdende 5% føtalt bovint serum med eller uden tetracyclin induktion til receptorekspression og efterfølges af ligand behandling. Celle migration blev målt efter 24 timer af PPARy-ligand behandling ved at tælle antallet af celler migreret i de sårede områder.

Luciferase rapport assay

HEK 293-celler blev co-transficeret med det tilsvarende beløb (15 ng ) af enten kontrol- plasmid eller ekspressionsplasmider for vildtype (wt-PPARy) eller sumoylation mutant (SUMO-PPARy) af PPARy i kombination med et luciferasereporterplasmid af PPAR-responselementet (TK-PPRE3x-Luc, 50 ng) og en beta- galactosidase-plasmid (β-Gal, 20 ng) til normalisering af transfektionseffektiviteten. Celler blev derefter behandlet med vehikel (EtOH), 1 uM pioglitazon eller troglitazon og analyseret for luciferaseaktivitet.

Reverse transskription og QPCR assay

Alle RNA’er blev fremstillet ved anvendelse af Qiagen kit og reverse transkriberet til cDNA for QPCR assay (TaqMan metode) som tidligere beskrevet [12]. Revers transkription af 2 ug totalt RNA i 100 pi reaktionsvolumen blev yderligere justeret til en 200 pi endelige mængder. SDS version 2.1 software blev anvendt til at detektere det realtids-PCR reaktionen udført i ABI 7900HT systemet. Effektivitet-korrigeret standard kurve analyser blev optimeret til nonbiased, multiplate sammenligning som tidligere beskrevet [8].

qPCR dataanalyse

En Makro blev oprettet for at analysere de rå data importeres til Microsoft Excel. PCR effektivitet (e), blev beregnet som e = 10

[- 1 /hældning], hvor hældningen er fremstillet fra standardkurven ved SDS 2.1 software, for 18S reference og NR af interesse. Makroen omfattede følgende statistiske beregninger. Den gennemsnitlige (. Gns) mængde for individuelle prøver stammer fra gennemsnitlige relative mængde af tre eksemplarer, hvor mængden er lig med e

-Ct (dvs.

mængde

= (10

[- 1 /slope])

-Ct). Variationskoefficienten (CV) kan yderligere opnås ved at dividere standardafvigelsen på gennemsnittet (STDEV) af den gennemsnitlige mængde (gns.), CV = STDAFV /gns. Den statistiske outlier punkt blev udelukket, hvis det var 17% CV. Ved at bruge disse mængder for både 18S og NR af interesse, blev den normaliserede værdi for hver NR udtryk yderligere beregnet ud fra opdeling af NR mængde avg ved henvisning mængde gns. (Dvs. normaliseret værdi = NR mængde avg /referencemængde gns). Endvidere blev standardafvigelsen for den normaliserede værdi beregnet som standardafvigelse = (Normaliseret værdi) X {(CV reference)

2 + (CV af NR)

2}

1/2.

Resultater

Karakterisering af udødeliggjort HBECs

Den overordnede skema til generering udødeliggjorte og tumorigene HBECs er vist i fig 1A. For at forstå effekten af ​​onkogene ændringer på tumorigent potentiale af bronkiale epitelceller, vi tidligere genererede et panel af udødeliggjort HBECs huser enten

K-ras

V12

udtryk, p53 knockdown, eller begge ændringer, som er vigtige mutationer i lungecancer [32, 33]. Ved hjælp af en mus xenotransplantatmodel, HBEC kloner, C1 og C5, blev identificeret til at være tumorigene og karakteriseret. Stabil knockdown af p53 blev bekræftet for både mRNA og proteinekspression under anvendelse QPCR assay og immunoblotanalyse, (fig 1B og S1 Fig). Aktiviteten af ​​onkogen

K-ras

V12

stabilt indført i udødeliggjort HBEC cellelinjer blev bekræftet ved fosforylering af MEK, en downstream målkinase af K-ras (Fig 1B) . Disse genetiske ændringer klart inducerede en vakuole-lignende cellulære morfologisk ændring, der syntes at være cellulær ældning, hvilket er i overensstemmelse med resultater fra en tidligere rapport [31] (figur 1C).

(A) Skema til at generere et panel af HBEC celler. (B, C)

In vitro

karakterisering af HBECs. (B) Immunoblot blev udført til ekspression af K-ras

V12, p53, pMEK, total MEK, og beta-actin i HBEC celler. (C) En mikroskopisk billede af HBEC celler (forstørrelse, 1x). Bemærk, at HBEC-KT står for HBEC cellelinjer udødeliggjort af

CDK4

plus

hTERT

; KTR

L, KT plus onkogen

K-ras

V12

; KT53, KT plus

p53

knock-down; KTR

L53, KTR

L plus

p53

knock-down.

NR udtryk i HBEC panelet

Da vi for nylig vist, at udtryk mønster for de 48 NR’er er en prognostisk biomarkør sæt samt potentielt være terapeutiske mål for lungekræft [6-8], vi spekulerede på, om nogen NR’er er forbundet med lungekræft patogenese. Derfor, for at undersøge, om indførelsen af ​​

K-ras

V12

og

p53

onkogene ændringer påvirkede ekspression af NR’er i human lunge bronchiale epitelceller, vi første profileret mRNA ekspression af alle 48 medlemmer af NR-superfamilien af ​​QPCR i isogene HBEC panel, der er oncogenically veldefineret og sammensat af genetisk identiske bronchieepithelceller cellelinjer (fig 2 og S2 fig). Vi fandt 31 ud af 50 NR’er (herunder PPARδ2 og PPARγ2, isoformer af PPARS og PPARy, henholdsvis) for at udvise forskelle i isogene panel (enten havde ingen ekspression eller ingen ændring i ekspression) (S2 Fig). Derimod viste 19 NR’er distinkte ekspressionsmønstre på tværs af de isogene HBEC paneler, der faldt i tre forskellige grupper. Den første gruppe (p53 afhængig) omfattede to medlemmer, kyllingeovalbumin opstrøms promotor-transkriptionsfaktor (Coup-TF) α, østrogenreceptor (ER) β, NR’er udviser en p53-afhængig ekspressionsmønster (Fig 2A). Den anden gruppe var repræsenteret af NR’er med en K-ras

V12-afhængig ekspressionsmønster herunder Coup-TFβ, estrogen-relateret receptor (ERR) α, kimcelle nuklear faktor (GCNF), nervevækstfaktor induceret gen B (NGFIB ) 3, neuron-afledt orphan-receptor 1 (NOR1), PPARa, PPARS, PPARδ2, reverse-erb (Rev-erb) α, og retinsyre-relateret orphan-receptor (ROR) α, thyroidhormonreceptor (TR) β (fig 2B). Den tredje gruppe (K-ras

V12 og afhængig p53) var ERa, hepatocytvækstfaktor nuklear faktor 4 (HNF4) γ, nur-relateret faktor 1 (Nurr1), PPARy, Retinoid syre receptor (RAR) β, RAR-relaterede sjældne receptor (ROR) β, som var NR’er med en dobbelt onkogen-afhængig ekspressionsmønster (fig 2C). I overensstemmelse med resultaterne fra vores tidligere rapport, hvor NR udtryk var stærkt forbundet med lungekræft progression [7], dette resultat understøtter forestillingen om, at delmængder af NR’er også kan inddrages i lungekræft patogenese fremkaldt af

K-ras

V12

overekspression og /eller tab af p53-funktion.

qPCR assay blev udført for mRNA-ekspression af hele NR superfamilien i udødeliggjort HBEC panel. (A)

p53

knockdown-afhængig udtryk. (B) onkogenisk

K-ras

V12

-afhængig udtryk. (C)

p53

knockdown og

K-ras

V12

-afhængig udtryk. Bemærk, at HBEC-KT står for HBEC cellelinjer udødeliggjort af

CDK4

plus

hTERT

; KTZ, KT plus kontrol plasmid med zeocin selektionsmarkør; KTR

L, KT plus onkogen

K-ras

V12

; KT53Z, KTZ plus

p53

knock-down; KTR

L53, KTR

L plus

p53

knockdown. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD (n = 3). Stjernerne viser statistisk signifikante punkter som vurderet af

ANOVA

. *

P

0,05, **

P

0,01 og ***

P

0,001 i forhold til HBEC-KT.

PPARy aktivering vendt onkogene

K-ras

V12

induceret udtryk for COX2 protein

Da PPARy er relativt velundersøgte blandt andre NR’er i forskellige fysiologiske funktioner (f.eks adipocytdifferentiering, betændelse kontrol) og dens ligand TZD’er rådighed i klinikken af ​​type II diabetes, ved siden besluttede vi at undersøge den molekylære studier af PPARy , som en proof-of-concept, ud af de 48 NR’er i den molekylære patogenese for lungekræft [11, 34, 35]. I overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser, at COX2-ekspression er associeret med lungecancer progression [36, 37], observerede vi en dramatisk stigning i COX2-ekspression i HBECs modificeret til at indeholde onkogene

K-ras

V12

(fig 3A og 3B). Mens PPARy mRNA steget parallelt med COX2 udtryk, PPARy protein udtryk var sammenlignelige i alle 4 HBEC celler tyder posttranskriptionel regulering af PPAR mRNA (Fig 3B). Eftersom PPARy spiller en væsentlig rolle i anti-inflammatorisk respons [34, 35], ønskede vi at teste, om PPARy-aktivering inhiberer proinflammatoriske COX2 ekspression i lungekræft patogenese model. Faktisk PPARy agonist troglitazon vendt forøget ekspression af COX2 mRNA og protein (figur 3A og 3B). Sammen med PPARy inhibering af lungekræft proliferation som tidligere rapporteret [38, 39], dette resultat antyder, at PPARy suppression af COX2-ekspression kan være vigtigt ved modulering onkogen-induceret malign transformation af HBECs til lungekræft. Med tab af p53-funktion, udtryk for cyklin D1 protein, en nøglefaktor i cellecyklusprogression fra G1 til S-fasen, faldt i HBECs med p53 knockdown og faldt endnu mere i HBECs med dual

p53

K-ras

V12

onkogene ændringer kombineret med troglitazon behandling (fig 3B). Derimod cyclin D1 udviste ingen ændring i HBECs med kun K-ras

V12-ekspression med eller uden troglitazon. Disse data tyder på, at i løbet af forstadier til kræft (præget af de HBEC celler med

p53

tab og

K-ras

V12

ændringer), PPARy udtrykkes og dens ligand-afhængig aktivering kan føre til dramatiske ændringer i COX-2 og cyclin D1-ekspression (fig 3A og 3B). Imidlertid viste troglitazon samme behandling inhibering af HBEC-KT proliferation tværs af isogene panel (fig 3C). Dette antyder, at yderligere faktorer, sammen med COX-2 og cyclin D1, kan være involveret i PPARy-medieret vækst suppression af HBEC celler.

(A) PPARy og COX2 mRNA-ekspression blev målt under anvendelse QPCR assay HBEC linjer med eller uden troglitazon behandling. (B) Immunoblots anvendelse af antistoffer mod COX2, cyclin D1, PPARy eller beta-actin blev anvendt til at måle det tilsvarende protein ekspression i HBEC panelet, når behandlet eller ikke behandlet med 1 uM af troglitazon. (C) Vækst respons HBEC-KT-cellelinier til den kombinerede behandling af PPARy-ligand troglitazon (3 uM) og RXR-ligand LG268 (100 nM). Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD (n = 3). Stjernerne viser statistisk signifikante punkter som vurderet af

ANOVA

. *

P

0,05, **

P

0,01 og ***

P

0,001 i forhold til HBEC-KT kontrol,

###

P

0,001 i forhold til K-ras

V12 kontrol,

+++

P

0,001 i forhold til K-ras

V12 + p53shRNA kontrol.

Karakterisering af tumorigene HBEC kloner

Da forskellige niveauer af PPARy udtryk afspejles ingen forskel i væksthæmning af ikke-tumorigen HBECs når de behandles med troglitazon (fig 3C), spekulerede vi hvis de transformerede HBECs vise en anden reaktion på PPARy ligand behandling og distinkte ekspressionsmønstre af andre NR’er sammenlignet med forstadier til kræft HBECs. Vi først karakteriseret de to tumorigene kloner, HBEC-C1 og C5, på cellulært og væv niveauer. Histologisk karakterisering af xenotransplantattumorer afsløret som vist for nylig af os, at HBEC-KT med p53 knockdown og K-ras

V12 høj ekspression manipulation kan føre til klonale derivater med forskellige histologies- pladecellecarcinom (SCC, HBEC-C1 ) og adenocarcinom (ADK, HBEC-C5) [31] (figur 4A). Biokemisk analyse bekræftede, at begge onkogene ændringer,

K-ras

V12

aktivitet samt tab af

p53

udtryk, var ligeligt opretholdt i tumorigen HBEC- C1 og C5 kloner (fig 4B). Overraskende både PPARy og COX2 udtryk var dramatisk faldt i tumorigene HBEC kloner (Fig 4B og S3 Fig) og tumorigene kloner var konsekvent resistente over for PPARy vækstinhibering (Fig 4C). Disse data antyder muligheden for, at under premalignancy drevet af

p53

K-ras

oncogene ændringer, PPARy og COX2 kan være terapeutiske mål, men at med udviklingen af ​​fuldt malignitet, at tumorerne omgå dette kontrol, som i nogle tilfælde sker ved nedregulering af PPARy. Sådanne resultater ville være i overensstemmelse med rapporter om, at anvendelsen af ​​ikke-steroide anti-inflammatorisk lægemiddel (NSAID) kan beskytte mod udvikling af lungecancer hos mænd, mens deres anvendelse i fuldt udviklede lungecancere forekommer ikke at være terapeutisk [40].

(A) Histologisk analyse af tumorigene kloner; C1 tumor dårligt differentieret karcinom med store celler, der tyder på pladecellekræft (H 0,001 i forhold til HBEC-KT kontrol.

NR udtryk i tumorigene HBEC kloner

Siden PPARy udtryk bemærkelsesværdigt blev undertrykt i fuldt maligne HBECs, vi spekulerede på, om andre NR’er anderledes udtrykkes med den samme tumorigene progression. Således afsluttede vi mRNA udtryk profil af hele NR superfamilien i panelet af ikke-tumorigen HBEC-KTR

L53 celler og tumorigene klonale derivater, herunder tumorigene cellelinjer etableret fra C1 og C5 tumorer og C5 tumor selv (Fig 5A og S4 fig). Femten af ​​de 50 NR’er viste ekspressionsmønstre potentielt associeret med malign progression af HBEC-KTR

L53 celler i HBEC tumorer (Fig 5A). Inkluderet i denne gruppe var AR, Coup-TFα, Coup-TFβ, dosering følsomme sex vending-adrenal hypoplasi medfødt kritiske region på X-kromosomet, gen 1 (DAX1), ERa, ERRα, HNF4γ, lever receptor homolog-1 (LRH1 ), NOR1, Nurr1, PPARy, RAR, RORa, RORβ, og VDR (fig 5A). Interessant, ni ud af de 15 NR’er (AR, Coup-TFα, DAX1, HNF4γ, LRH1, NOR1, Nurr1, RORa, og RORβ) viste konstant stigende udtryk mønster på tumorigen progression (Fig 5B). AR og DAX1 viste dramatisk forøget ekspression kun i HBEC tumorer, men ikke i de immortaliserede HBEC cellelinier. ERRα og VDR viste reduceret udtryk under tumorigenese fra ikke-onkogent HBEC-KT, gennem HBEC-KTR

L53 til HBEC tumorer (Fig 5B). Coup-TFβ, ERa, og RARp viste en bifasisk udtryk mønster, hvor den oprindelige udtryk på NRS i HBEC-KT faldt i HBEC-KTR

L53, men steg i HBEC tumorer, som er modsat den fuldstændig tab af PPARy ekspression i HBEC tumorer (fig 5B). Mere interessant, adenocarcinom typen HBEC-C5-celler og tumor, men ikke pladecellecarcinomet HBEC-C1, viste forøget ekspression af Coup-TFα og β, og nedsat ekspression af ERRα og VDR, antyder, at disse fire NR’er kan være specifikt involveret i adenocarcinom typespecifikke lungekræft patogenese.

qPCR assay blev udført for mRNA-ekspression af hele NR superfamilien i ikke-tumorigen HBEC-KTR

L53 celler med

p53

K-ras

V12

ændringer, to tumorigene kloner C1 og C5, og xenograft C5 tumor væv. (A) Kvantitativ mRNA-ekspression profiler af NR undergrupper med distinkt ekspressionsmønster tværs over pladen. Bemærk, at resten af ​​NR profil blev vist i S4 Fig. (B) Sammenfatning af NR ekspression fra panel A og figur 2 for at vise NR ekspressions kaskader korrelerede med tumorigene progression. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD (n = 3). Stjernerne viser statistisk signifikante punkter som vurderet af

ANOVA

. *

P

0,05, **

P

0,01 og ***

P

0,001 i forhold til HBEC-KTR

L53.

PPARy sumoylation hæmning af tumorigen HBEC vækst og migration

Som ligand-medieret PPARy sumoylation undertrykker udtryk for inducerbare nitrogenoxid (iNOS), en velkendt proinflammatoriske enzym, der genererer nitrogenoxid, og den anti-inflammatoriske rolle PPARy menes at bidrage til dens tumor suppressive funktion af denne receptor [34], testede vi, om PPARy sumoylation er kritisk for anti -tumorigenic funktion af denne receptor i HBEC progression serien. For at gøre dette, vi etablerede tumorigene stabile cellelinier (HBEC-C1), der udtrykker vildtype (wt-PPARy) eller sumoylation mutant (SUMO-PPARy) form for PPARy for at studere, hvis gain-of-funktion forskellige PPARy ( wt-PPARy vs. SUMO-PPARy) kunne vende den vækst modstand af tumorigene HBEC-C1- til ligandbehandling. Vi identificerede, at begge PPARy former viste ingen forskel i ligand-medieret trans-aktiveringsfunktion til målgenekspression anvendelse af et luciferase-assay (figur 6A). HBEC-C1-celler stramt reguleret ekspression af vildtype-PPARy eller SUMO-PPARy under kontrol af tetracyklin-inducerbar drift promotor (Tet /ON) (Fig 6B). HBEC-C1 celler med induceret ekspression af vildtype-PPARy viste signifikant vækstinhibering med mere end 50%, når de behandles med pioglitazon eller troglitazon (TZD’er) (Fig 7A). Men denne væksthæmmende respons stærkt formindsket i HBEC-C1 celler med inducerbar ekspression af SUMO-PPARy under samme behandling vilkår som de tilsvarende HBEC-C1 celler, der udtrykker wt-PPARy (fig 7A og 7B). Tilsvarende viste flydende kolonidannelse assayet at PPARy ligand behandlinger inhiberet clonogenecity af HBECs udtrykker wt-PPARy og andre lungekræft cellelinier, såsom calu6 og H2347, der udtrykker endogenouse PPARy, men ikke af den ene med SUMO-PPARy (fig 7B og 7C). Men behandling af PPARa ligand WY-14643 viste, ingen colonogenic virkning i begge wt-PPARy og SUMO-PPARy udtrykkende HBECs (Fig 7C). Dette antyder, at inhibitoriske virkning af TZD’er er specifikt afhængig af PPARy sumoylation. PPARy-aktivering inhiberes også cellemigrering i en sumoylation-afhængig måde (figur 7D). I overensstemmelse hermed ekspressionen af ​​både cyclin A og cyclin D1 faldt i HBEC-C1-celler, der udtrykker wt-PPARy, men blev ikke ændret i HBEC-C1-celler, der udtrykker SUMO-PPARy, når de behandles med TZD’er (Fig 8A og S5A Fig). Bemærk, at ekspressionen af ​​cyklin-afhængige kinase hæmmere, p16 og p21, ikke blev ændret betydeligt i den samme behandling betingelser (Fig 8A og S5A Fig). Derudover undersøgte vi adskillige inflammatoriske signalveje, der er involveret i nitrogenoxidproduktion, prostaglandin biokemi, og TNFa signaltransduktion. Interessant nok fandt vi, at TZD aktivering af wt-PPARy faldt det proinflammatoriske COX2-ekspression med tre-fold, hvorimod SUMO-PPARy-aktivering, navnlig, steg ekspressionen af ​​COX2 protein ved seks gange i HBEC-C1-celler (Fig 8B). Endvidere blev ekspressionen af ​​15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (HPGD), en prostaglandin-metaboliserende enzym, dramatisk induceret af atten gange når wt-PPARy blev aktiveret ved TZD’er. Men HBEC-C1-SUMO-PPARy celler inducerede HPGD udtryk betydeligt mindre (fem til syv gange), når de behandles med TZD’er. PPARy-aktivering også signifikant undertrykt TNFa ekspression, men ikke andre NFKB signalering faktorer, i en sumoylation-afhængig måde (S5B Fig). Bemærk, at iNOS ikke blev udtrykt i tumorigene HBEC kloner (S5C Fig). Tilsammen tyder det ligand-induceret PPARy sumoylation specifikt er involveret i undertrykkelsen af ​​inflammatorisk COX2 og TNFa signalveje, men ikke iNOS-vejen, i lungekræft patogenese.

(A) Luciferase reporter assay af vildtype og sumoylation mutant PPARy plasmider. RLU, relative luciferase enhed. (B) Tetracycline-induceret ekspression af PPARy og EGFP protein i stabilt transficeret HBEC-C1-wt-PPARy-klon. En mikroskopisk billede af tetracyclin-induceret EFGP ekspression (øverst i B). Immunoblot assays til ekspression af lamin A /C og tetracyclin-induceret PPARy (nederst i B). En bicistronisk konstrukt ifølge PPARy og EGFP blev stabilt indført i en tumorigen HBEC klon til at generere HBEC-C1-PPARy-cellelinier som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD (n = 3). Stjernerne viser statistisk signifikante punkter som vurderet af

ANOVA

. *

P

0,001 i forhold til HBEC-KT kontrol.

Vækst respons og celle migration af lungekræft blev analyseret for at behandling med PPARy-ligander. (A) Cell vækstrespons. *

P

*

P

*

P